劉樹人， 劉曉龍， 李　岳， 馬曉玉， 張志峰

(中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室,山東 青島 266003)

?

單環(huán)刺螠呼吸腸JNK通路對硫化物的應激反應?

劉樹人， 劉曉龍， 李岳， 馬曉玉， 張志峰??

(中國海洋大學海洋生物遺傳育種教育部重點實驗室,山東 青島 266003)

摘要：JNK通路是MAPK信號通路的子通路之一，參與生物體的多種應激反應。本研究分析了單環(huán)刺螠JNK分子的特征，并對50和150 μmol/L硫化物應激下單環(huán)刺螠呼吸腸中JNK的反應進行了研究。單環(huán)刺螠JNK cDNA全長2 102 bp，編碼403個氨基酸，推導的氨基酸序列具有JNK家族的典型特征。Western blot(蛋白免疫印跡)檢測顯示，單環(huán)刺螠呼吸腸中JNK總蛋白數(shù)量在硫化物暴露期間未見明顯的變化；當單環(huán)刺螠暴露于硫化物環(huán)境中時，其呼吸腸細胞中磷酸化JNK的含量呈現(xiàn)顯著性地持續(xù)升高趨勢，其起始顯著升高發(fā)生在單環(huán)刺螠暴露0.5 h，隨著暴露時間的延長，磷酸化JNK的含量持續(xù)升高，并在150 μmol/L硫化物暴露48 h時其含量增至最高，為對照組的10.2倍；此外，暴露于50 μmol/L硫化物中的單環(huán)刺螠呼吸腸磷酸化JNK含量普遍低于150 μmol/L硫化物相同暴露時間的磷酸化JNK的含量。研究結果表明，單環(huán)刺螠JNK基因擁有進化保守性，且JNK信號通路在單環(huán)刺螠呼吸腸應對硫化物中發(fā)揮作用。

關鍵詞：單環(huán)刺螠；硫化物；JNK通路

Liu Shu-Ren, Liu Xiao-Long, Li Yue, et al. Response of JNK pathway in the hindgut ofUrechisunicinctusafter sulfide stress[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(2)： 76-82.

哺乳動物細胞中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4條并行的MAPKs(絲裂原激活蛋白激酶，Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路，分別是ERK5(BMK1)通路，ERK(Extracellular signal-regulated kinase)通路，p38MAPK(p38 Mitogen-activated protein kinase)通路，JNK/SAPK(c-Jun N-terminal kinase/stress-activated kinase)通路[1]。MAPKs通路可被多種刺激(絲裂原、滲透壓應激、熱應激和促炎癥因子等)所激活，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、代謝、存活和凋亡等[1-2]。而不同的細胞外刺激激活不同的MAPKs信號通路，并通過其相互調(diào)控進而介導不同的細胞生物學效應[2]。JNK信號通路在細胞分化、分裂、癌變、凋亡及免疫反應中起著重要的調(diào)控作用。已有研究表明，JNK信號通路對紫外線、滲透壓變化、高溫、DNA損傷劑、炎癥細胞因子、蛋白抑制劑等外界刺激有強烈的反應[3-5]；此外，它還可被一些化學物質諸如順鉑、硫芥氣、金屬離子、二氧化硫、硫化氫等所激活[6-8]。Osipov等報道，在豬的缺血再灌注模型中，H2S可以上調(diào)ERK1/2的磷酸化激活水平[9]；在人的臍靜脈內(nèi)皮細胞中，H2S可激活p38MAPK[10]；但在大鼠動脈血管平滑肌細胞中，H2S抑制了受內(nèi)皮素激活的p38MAPK的活性[11]；在人的PC12細胞中，H2S則通過下調(diào)ERK1/2和p38的磷酸化激活水平來應對化學性低氧對細胞的損傷[12]。有關H2S影響MAPK信號通路的研究結果似乎在不同細胞或物種之間存在差異，尚未達成一致的認識。

單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)俗稱海腸子，類屬螠蟲動物門(Echiurioidea)、螠綱(Echiurida)、無管螠目(Xenopeneusta)、刺螠科(Urchidae)，主要分布于我國黃渤海沿岸、日本北海道和本州島、朝鮮半島和俄羅斯，是一種生活在沿海泥沙岸潮間帶下區(qū)及潮下帶淺水區(qū)U型洞穴內(nèi)的底棲生物種。已有研究表明,單環(huán)刺螠可以耐受、代謝和利用硫化物[13-16]?；衾^革等[17]報道，硫化物可上調(diào)單環(huán)刺螠MAPKKK(1個MAPK信號通路的上游調(diào)控分子)mRNA的表達，表明MAPK信號通路可能參與單環(huán)刺螠應對硫化物的生理反應。本研究使用RACE技術克隆了單環(huán)刺螠JNK的全長cDNA序列；體外原核表達了JNK蛋白并制備其多克隆抗體；使用JNK多克隆抗體和磷酸化JNK單抗以及蛋白質印跡雜交(Western blot)技術，檢測了50 μmol/L硫化物處理的單環(huán)刺螠呼吸腸(又稱后腸)中JNK在總蛋白水平和激活(磷酸化JNK，p-JNK)水平上的變化。以期揭示JNK信號通路在單環(huán)刺螠應對硫化物中的作用，并為深入探討MAPK信號通路的作用提供基礎數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1 主要試劑及試劑盒

Trizol試劑盒購自Invitrogen公司，SMARTTMRACE cDNA擴增試劑盒購自Clontech公司，Ni2+-NTA His-Bind Resins購自Novagen公司，RNAase-free DNAase I、PMD18-T載體、Xho I內(nèi)切酶、BamH I內(nèi)切酶、AD酶均購自Takara公司，ECL化學發(fā)光顯色試劑盒購自碧云天生物，p-JNK抗體購自Santa Cruz公司，羊抗兔IgG購自上海生工生物。

1.2 實驗動物處理和取樣

單環(huán)刺螠購自青島市四方路海產(chǎn)品市場，實驗室內(nèi)通氣暫養(yǎng)一周。暫養(yǎng)期間，每日換水1/2(鹽度28，pH=8.0,溫度(20±1)℃)，投喂適量的單細胞藻(小新月菱形藻Nitzschiaclosteriumf.minutissima與小球藻Chlorellavulgaris)，實驗前24 h停止通氣和喂食。選擇體表無傷痕的健康個體(體重(34.6±10.4) g)108尾，隨機均分到9個含有30 L沙濾海水的養(yǎng)殖玻璃缸中；實驗設置2個硫化物處理組(50、150 μmol/L硫化物組)和1個對照組(未加硫化物的自然海水)；每個組設3個重復的玻璃缸。各實驗組中不同濃度的硫化物通過向水體中添加硫化物母液(10 mmol/L Na2S，pH=8.0)來實現(xiàn)；根據(jù)前期實驗，每2 h檢測和添加硫化物母液1次，使用亞甲基藍法[18]檢測水體中的硫化物濃度。實驗期間，分別于0、0.25、0.5、1、1.5、2、6、24、48、72 h從各培養(yǎng)缸中取單環(huán)刺螠1條，解剖取呼吸腸，磷酸緩沖液中漂洗3次，液氮中速凍后，保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3 方法

1.3.1 單環(huán)刺螠JNKcDNA全長的獲取以及序列分析

1.3.1.1總RNA的提取使用Trizol(Invitrogen)試劑盒并按照說明書提取單環(huán)刺螠呼吸腸總RNA。使用RNAase-free DNAase I(Takara)消除總RNA中的基因組DNA，1.2%瓊脂糖電泳和紫外分光光度計法檢測RNA的質量和濃度。

1.3.1.2 RACE擴增和全長cDNA的獲得以單環(huán)刺螠呼吸腸總RNA為模板，使用SMARTTMRACE cDNA擴增試劑盒(Clontech)并按照操作指南分別合成3’RACE和5’RACE的第一鏈cDNA模板。根據(jù)illumina RNA-seq轉錄組數(shù)據(jù)庫(NCBI Sequence Read Archive http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi accession number: SRA122323)中獲得的一段1 190 bp長的JNKcDNA序列，分別設計3’RACE和5’RACE特異性引物，GSP1：5’-AAGATCATCGAGCAGCTGGGGACAC-3’，GSP2：5’-TGGGAAGAGCT TCTCCGTCGGGTAT-3’。使用已獲得的3’RACE和5’RACE cDNA第一鏈為模板進行RACE擴增。擴增產(chǎn)物分別經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳，切膠回收特異性片段。按試劑盒說明書步驟將回收產(chǎn)物連入PMD18-T載體，使用熱激法轉化DH5α感受態(tài)細胞，而后進行氨芐抗性篩選，挑取菌落用M13+和M13-引物進行PCR篩選。將PCR篩選的陽性克隆送至華大基因進行測序。使用DNAMAN 6.0軟件對所獲得3’RACE和5’RACE序列進行全長cDNA拼接。

1.3.1.3 序列的分析及比較將獲得的cDNA全長序列通過BLAST X和BLAST P程序在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列相似性及氨基酸保守性分析；利用ProtParam軟件分析該蛋白的分子量及穩(wěn)定性特征；用Clustal X軟件進行氨基酸序列的多序列比對及功能結構域的查找；使用MEGA 5.05軟件和鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構建系統(tǒng)進化樹。

1.3.2 單環(huán)刺螠JNK蛋白多克隆抗體的制備及磷酸化JNK抗體的選擇

1.3.2.1 單環(huán)刺螠JNK蛋白的表達純化及多克隆抗體的制備根據(jù)已經(jīng)獲得的JNK全長cDNA序列設計1對引物，P1：5’-GGATCCATGAGTGGGAAATTACCAAG-3’(下劃線序列為BamHI酶切位點)，P2：5’-CTCGAGTACACAACCTCCATATTCCT-3’(下劃線序列為XhoI酶切位點),用于擴增JNK的ORF序列。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳鑒定、回收和純化，連接到PMD18-T載體，并且轉入DH5α感受態(tài)細胞中送華大基因測序。

將含有JNKORF序列的PMD18-T載體和原核表達載體用BamHI和XhoI進行雙酶切，回收片段用T4 DNA連接酶4 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉化進大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑菌落培養(yǎng)，提取質粒，用BamHI和XhoI雙酶切鑒定陽性克隆。

陽性克隆在含卡那霉素(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中37 ℃震蕩過夜，次日以1%的比例接種到LB培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，37 ℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4 h，加入誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至終濃度1 mmol/L,誘導表達3 h后的200 mL菌液以5 000 r/s離心10 min收集菌體。用20 mL PBS重懸菌體，冰浴中超聲破碎至溶液澄清。在4 ℃、12 000 r/s離心10 min，收集包涵體沉淀。將包涵體溶于5 mL變性液(8 mol/L尿素，10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0), 0.1 mol/L磷酸鈉，1 mmol/L β-巰基乙醇)中，4 ℃溶解5 h。4 ℃下12 000 r/s離心20 min收集上清。按照公司提供的操作說明，用Ni2+-NTA His-Bind Resins純化JNK蛋白，收集洗脫液。SDS-PAGE分析鑒定洗脫液蛋白組分。使用Bradford檢測蛋白含量之后，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將純化后的JNK重組蛋白約5 mg，送至上海生工生物進行多克隆抗體的合成。使用酶聯(lián)免疫法進行多克隆抗體的效價檢測。

1.3.2.2 JNK磷酸化抗體的選擇根據(jù)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，單環(huán)刺螠JNK氨基酸序列與人JNK序列同源性高，尤其是在被抗體公司選作抗原的活化環(huán)部分，序列的同源性高達92%。因此根據(jù)Santa Cruz公司的建議，選擇人p-JNK(G7) (Santa Cruz, CA, USA)用于檢測本研究中激活態(tài)的單環(huán)刺螠p-JNK含量。

1.3.3 Western blot檢測

1.3.3.1 總蛋白的提取取約100 mg單環(huán)刺螠呼吸腸組織于1 ml裂解液(150 mmol/L氯化鈉,1% NP-40, 0.5%脫氧膽酸鈉, 0.1% SDS, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L PMSF和50 mmol/L Tris, pH=7.4)中冰上勻漿，然后12 000 r/s離心5 min，取上清蛋白溶液并用考馬斯亮藍法進行蛋白濃度測定，而后分裝保存于-80 ℃冰箱。

1.3.3.2 Western blot取50 μg呼吸腸總蛋白加入20 μL含SDS和β-巰基乙醇的上樣緩沖液中，99 ℃恒溫變性10 min，SDS-PAGE(分離膠配制濃度為10%，濃縮膠配制濃度為5%)電泳。每1個樣本每次跑膠2塊，分別用于檢測JNK總蛋白(t-JNK)和磷酸化JNK蛋白(p-JNK)。使用Trans-Blot?半干轉印系統(tǒng)(Bio-Rad)將電泳分離的蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(150 mA的電流在4 ℃轉膜25 min)。取出PVDF膜，放入盛有5% BSA溶液(0.25 g BSA加5 mL TBST)中，搖床上封閉PVDF膜1 h，TBST漂洗5次，每次5 min。然后，將濾膜放入5% BSA溶液稀釋的第一抗體(其中p-JNK (G7) (Santa Cruz, CA, USA)稀釋2 000倍，JNK多克隆抗體稀釋1 000倍)中，搖床上孵育2 h，TBST漂洗5次，每次5 min。用稀釋的辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白(p-JNK膜使用1∶2 500的馬抗鼠IgG(Cell Signaling Technology)，t-JNK膜使用1∶5 000稀釋的羊抗兔IgG(上海生工)與PVDF膜溫育)在搖床上孵育1 h。TBST漂洗5次，每次5 min。用ECL化學發(fā)光顯色法和化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Tanon 4 200 Multi，上海天能科技)進行顯色并拍照。使用ImagequaNT v4.2軟件(Molecular Dynamics)進行光密度分析，將0 h的目的條帶光密度值設為1，其它時間的目的條帶光密度值均與0 h條帶相比，以倍數(shù)表示它們的大小并使用EXCEL2007軟件制作柱形圖。t-JNK和p-JNK的Western blot檢測均重復3次，光密度值取3次的平均值。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準誤差表示。使用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Tukey HSD檢驗，以P<0.05設為組間均值的顯著性差異水平。

2結果

2.1 單環(huán)刺螠JNK的序列特征

通過3’和5’RACE擴增分別獲得2 845和910 bp的核苷酸序列，組裝后的全長cDNA序列為2 102 bp(GenBank序列號：KP893339)。該全長cDNA序列包含5’非編碼翻譯區(qū)(5’UTR)160 bp，3’UTR 730 bp和編碼403個氨基酸的開放閱讀框1 212 bp，該蛋白的理論等電點為7.15，分子量為45.9 kDa。序列分析發(fā)現(xiàn)，該推導的氨基酸序列包含4個高度保守的真核生物JNK特征結構域，分別是富甘氨酸環(huán)(Glycine-rich loop, P-loop)、催化環(huán)(Catalytic loop)、通用錨定結構域(Common docking, CD)和含有雙磷酸化位點(TPY)的激活環(huán)(Activation loop)(見圖1)。同源性分析顯示該序列與已報道的其他物種JNK具有高的同源性，與人、小鼠、原雞、非洲爪蟾、斑馬魚、內(nèi)華達古白蟻、畢氏粗角蟻、加利福尼亞海蝸牛、捕鳥蛛的同源性分別為74.4%、73.7%、73.3%、73.7%、72.95%、78.41%、79.95%、76.67%、77.42%。系統(tǒng)進化分析顯示，該序列首先與無脊椎動物JNK聚類，然后與脊椎動物聚類(見圖2)，該物種的系統(tǒng)進化關系與物種的分類地位基本一致。

2.2 單環(huán)刺螠呼吸腸中JNK對硫化物暴露的反應

為了實現(xiàn)Western blot檢測單環(huán)刺螠JNK對硫化物暴露的反應，本實驗構建了單環(huán)刺螠JNK全長ORF的表達載體，將其轉染大腸桿菌中成功表達出包涵體形式的JNK重組蛋白；鎳柱純化后的重組蛋白分子量約為47 kDa；所制備的JNK多克隆抗體滴度為1∶512 000，Western blot特異性檢測其主帶明顯(見圖3)。

Western blot結果顯示，單環(huán)刺螠在50及150 μmol/L硫化物暴露期間，其呼吸腸內(nèi)的JNK被持續(xù)性激活(見圖4A、B)；其中硫化物處理0.5 h時，無論是50 μmol/L還是150 μmol/L硫化物實驗組中單環(huán)刺螠呼吸腸細胞的磷酸化JNK含量均起始較對照組極顯著提高(p<0.01)，且隨著硫化物暴露時間的延長，磷酸化JNK含量持續(xù)極顯著升高(見圖4C)；150 μmol·L-1硫化物實驗組于暴露48 h時，P-JNK含量達到最高，是對照組的10.2倍；50 μmol/L硫化物處理組于暴露72 h時，P-JNK含量達到最高，是對照組的7.82倍。此外，除去硫化物暴露72 h，其它各硫化物暴露時間點的P-JNK含量均是150 μmol/L處理組高于同一時間點50 μmol/L處理組的P-JNK含量。然而，2個不同濃度硫化物暴露各組單環(huán)刺螠呼吸腸細胞中的JNK蛋白總量組均未見發(fā)現(xiàn)有明顯的顯著性差異(見圖4D)。

(黑色區(qū)代表氨基酸同源性為100%，深灰色區(qū)代表氨基酸的同源性為75%以上，淺灰色區(qū)代表氨基酸的同源性為50%；上劃線處分別顯示4個保守的JNK結構域。Black shaded regions are 100% homologous sequences, dark gray regions are 75%, light gray regions are 50%. Conserved Glycine-rich loop (P-loop), catalytic loop, common docking (CD) domain and activation loop are indicated in upline.) GenBank注冊號:Aplysiacalifornica(NP_001191547),Cerapachysbiroi(EZA48912),DanioRerio(NP_001032790),Gallusgallus(XP_004941164),Homosapiens(NP_620446.1),Musmusculus(NP_033184),Stegodyphusmimosarum(KFM65023),Xenopus(Silurana)tropicalis(NP_001123415),Zootermopsisnevadensis(KDR18179).

圖1不同物種JNK氨基酸序列同源性的多序列比對

Fig.1Multiple sequence alignment of JNK amino acid sequence among different species

圖2　不同物種JNK同源性的聚類分析

(A. JNK蛋白的表達純化；B. JNK多克隆抗體的特異性檢驗；1：蛋白分子量標準；2：未誘導重組菌；3：誘導3 h后總蛋白；4：誘導3 h后包涵體；5：誘導3 h后上清；6：Ni2+-NTA柱純化后蛋白。 A.Expression and purification of theU.unicinctusJNK recombinant protein B. analysis of the anti-JNK specificity；1: protein marker; 2: non-induced product of pET28a-JNK/BL21 (DE3); 3: induced product after 3 h of pET28a-JNK/BL21 (DE3); 4: inclusion body of induced product after 3 h of pET28a-JNK/BL21 (DE3); 5: supernatant of ultrasonicated induced product after 3 h of pET28a-JNK/BL21 (DE3); 6: Ni2+-NTA purified target protein.)

圖3單環(huán)刺螠JNK重組蛋白的表達純化和抗體特異性分析

Fig.3Expression and purification of theU.unicinctusJNK

recombinant protein and analysis of the anti-JNK specificity

(A和B：Western blot檢測；C：根據(jù)A、B兩圖所做的JNK總蛋白含量的光密度分析；D: 根據(jù)A、B圖所做的磷酸化JNK蛋白含量的光密度分析。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準誤來表示(n=3)。**代表與對照組相比呈極顯著性差異(P<0.01)。 A and B: Western blot detection; C: Denstiometric analysis of total-JNK content based on the results of A and B; D Denstiometric analysis of p-JNK content based on the results of A and B. Data are shown as the mean ± S.E.M. (n=3). ** indicates extremely significant difference (P<0.01) between the sulfide groups and the control group.)

圖4硫化物暴露下單環(huán)刺螠呼吸腸中JNK總蛋白水平及磷酸化激活水平的WB檢測

Fig.4Western blotting analysis of total-JNK and p-JNK amount in hindgut of U. unicinctus exposed to sulfide

JNK信號通路是真核生物細胞中重要的一條信號通路，它可被細胞因子如白介素1(IL-1)、表皮生長因子(EGF)、腫瘤壞死因子α(TNFα)以及多種理化因子激活，參與細胞形態(tài)維持、細胞骨架構建、細胞增殖與分化以及細胞凋亡等過程[18]。本文使用RACE技術獲得了單環(huán)刺螠的1個全長cDNA序列，其推導的氨基酸序列中含有4個高度保守的真核生物JNK特征結構域，即富甘氨酸環(huán)、催化環(huán)、通用錨定結構域和含有雙磷酸化位點(TPY)的激活環(huán)，并且與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的JNK有高的同源性，初步推斷其為單環(huán)刺螠的JNK全長cDNA。系統(tǒng)進化分析結果顯示，該序列首先與無脊椎動物的JNK聚類，然后再與脊動物JNK聚類，表明單環(huán)刺螠JNK基因的進化地位與經(jīng)典分類基本一致。

本實驗結果顯示，當單環(huán)刺螠暴露在50和150 μmol/L硫化物環(huán)境中時，其呼吸腸中的JNK蛋白表達總量均未見顯著性增加，但其磷酸化JNK含量均顯著提高，表明單環(huán)刺螠呼吸腸主要通過JNK激活水平而非蛋白表達水平的提高來應對環(huán)境硫化物的應激。有學者指出，JNK信號通路既參與細胞凋亡調(diào)控又與細胞存活相關[19]，最終體現(xiàn)哪一個細胞過程的調(diào)控可能與JNK激活時間的持續(xù)長度有關系。通常由細胞因子誘導的瞬時JNK激活與細胞的存活有關，而許多環(huán)境應激引起的JNK長效激活主要與細胞的凋亡或其它形式的細胞死亡(壞死、自我吞噬)相關[20-22]。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)，用甲基苯丙胺誘導SH-SY5Y(神經(jīng)母細胞瘤)細胞凋亡時，ERK、JNK磷酸化水平明顯提高，而用抑制劑SP600125抑制JNK活性后，細胞凋亡明顯減少；Adhikari和Bhatia[24]報道H2S可引起人胰腺腺泡細胞中JNK的長效激活，進而導致該細胞的凋亡。本實驗中，單環(huán)刺螠暴露在50 μmol/L硫化物中其呼吸腸JNK的激活量隨著暴露時間的延續(xù)持續(xù)性升高，這與上述在SH-SY5Y細胞和胰腺腺泡細胞中的結果類似。據(jù)此推測單環(huán)刺螠呼吸腸中的JNK持續(xù)性激活可能參與細胞凋亡的調(diào)控。

參考文獻：

[1]Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signalling cascades[J]. Nature, 2001, 410(6824): 37-40.

[2]Johnson G L, Lapadat R. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases[J]. Science, 2002, 298(5600): 1911-1912.

[3]Gaitanaki C, Kefaloyianni E, Marmari A, et al. Various stressors rapidly activate the p38-MAPK signaling pathway in Mytilus galloprovincialis (Lam.)[J]. Molecular and Cellular Biochemistry, 2004, 260(1): 119-127.

[4]Kyriakis J M, Avruch J. Mammalian mitogen-activated protein kinase signal transduction pathways activated by stress and inflammation[J]. Physiological Reviews, 2001, 81(2): 807-869.

[5]Raingeaud J, Gupta S, Rogers J S, et al. Pro-inflammatory cytokines and environmental stress cause p38 mitogen-activated protein kinase activation by dual phosphorylation on tyrosine and threonine[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(13): 7420-7426.

[6]Zanke B W, Boudreau K, Rubie E, et al. The stress-activated protein kinase pathway mediates cell death following injury induced by cis-platinum, UV irradiation or heat[J]. Current Biology, 1996, 6(5): 606-613.

[7]Rebholz B, Kehe K, Ruzicka T, et al. Role of NF-κB/RelA and MAPK pathways in keratinocytes in response to sulfur mustard[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2008, 128(7): 1626-1632.

[8]Samet J M, Graves L M, Quay J, et al. Activation of MAPKs in human bronchial epithelial cells exposed to metals[J]. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, 1998, 275(3): L551-L558.

[9]Osipov R M, Robich M P, Feng J, et al. Effect of hydrogen sulfide on myocardial protection in the setting of cardioplegia and cardiopulmonary bypass[J]. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery, 2010, 10(4): 506-512.

[10]Papapetropoulos A, Pyriochou A, Altaany Z, et al. Hydrogen sulfide is an endogenous stimulator of angiogenesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106(51): 21972-21977.

[11]Du J, Hui Y, Cheung Y, et al. The possible role of hydrogen sulfide as a smooth muscle cell proliferation inhibitor in rat cultured cells[J]. Heart and Vessels, 2004, 19(2): 75-80.

[12]Lan A, Liao X, Mo L, et al. Hydrogen sulfide protects against chemical hypoxia-induced injury by inhibiting ROS-activated ERK1/2 and p38MAPK signaling pathways in PC12 cells[J]. PLoS One, 2011, 6(10): e25921.

[13]張志峰, 王思鋒, 霍繼革, 等. 單環(huán)刺螠對硫化物暴露的呼吸代謝適應[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2006, 36(4): 639-644.

Zhang Z F, Wang S F, Huo J G. Adaptation of Respiratory metabolism to sulfide exposure inUrechisunicinctus[J]. Periodical of Ocean University of China, 2006, 36(4): 639-644.

[14]Wang S, Zhang Z, Cui H, et al. The effect of toxic sulfide exposure on oxygen consumption and oxidation products inUrechisunicinctus(Echiura: Urechidae)[J]. Journal of Ocean University of China, 2010, 9(2): 157-161.

[15]Ma Z, Bao Z, Wang S, et al. Sulfide-based ATP production inUrechisunicinctus[J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2010, 28: 521-526.

[16]Ma Y B, Zhang Z F, Shao M Y, et al. Sulfide: quinone oxidoreductase from echiuran wormUrechisunicinctus[J]. Marine Biotechnology, 2011, 13(1): 93-107.

[17]霍繼革, 張志峰, 胡曉麗, 等. 硫應激單環(huán)刺螠差異表達的初步研究[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2007, 37(3): 457-462.

Huo J G, Zhang Z F, Hu X L. Preliminary analysis of gene expression differences in sulfide stressedUrechisunicinctus[J]. Periodical of Ocean University of China, 2007, 37(3): 457-462.

[18]Cline J D. Spectrophotometric determination of hydrogen sulfide in natural waters1[J]. Limnology and Oceanography, 1969, 14(3): 454-458.

[19]Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signalling cascades[J]. Nature, 2001, 410(6824): 37-40.

[20]Ip Y T, Davis R J. Signal transduction by the c-Jun N-terminal kinase (JNK)—from inflammation to development[J]. Current Opinion in Cell Biology, 1998, 10(2): 205-219.

[21]Reinhard C, Shamoon B, Shyamala V, et al. Tumor necrosis factor α-induced activation of c-jun N-terminal kinase is mediated by TRAF2[J]. The EMBO Journal, 1997, 16(5): 1080-1092.

[22]Almeida E A C, Ilié D, Han Q, et al. Matrix survival signaling from fibronectin via focal adhesion kinase to C-Jun Nh2-terminal kinase[J]. The Journal of Cell Biology, 2000, 149(3): 741-754.

[23]Ventura J J, Hübner A, Zhang C, et al. Chemical genetic analysis of the time course of signal transduction by JNK[J]. Molecular Cell, 2006, 21(5): 701-710.

[24]Wang S F, Yen J C, Yin P H, et al. Involvement of oxidative stress-activated JNK signaling in the methamphetamine-induced cell death of human SH-SY5Y cells[J]. Toxicology, 2008, 246(2): 234-241.

[25]Adhikari S, Bhatia M. H2S-induced pancreatic acinar cell apoptosis is mediated via JNK and p38 MAP kinase[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2008, 12(4): 1374-1383.

責任編輯高蓓

Response of JNK Pathway in the Hindgut ofUrechisunicinctusAfter Sulfide Stress

LIU Shu-Ren, LIU Xiao-Long, LI Yue, MA Xiao-Yu, ZHANG Zhi-Feng

(The Key Laboratory of Marine Genetics and Breeding, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Abstract:JNK pathway is a subpathway of MAPK pathways and involves in directing cellular responses to diverse stimuli in organisms. In this study, molecular characteristics of JNK and its response to sulfide stress were examined in the hindgut of Urechis unicinctus, a species of Echiura which habitats U-shape burrow of marine coast. Urechis unicinctus, a species of Echiura, inhabits marine sediments, especially subtidal mudflats and intertidal in China, Russia, Korea and Japan. It has been reported that the worm U. unicinctus may encounter sulfide exposure in its habitat and can tolerate high concentration sulfide based on the previous researches from the cytological characteristics of tissues, changes of heme compounds in coelomic liquid and sulfide oxidation of mitochondria in U. unicinctus exposed sulfide We obtained two fragments of 2 845 bp and 910 bp through 3’ and 5’-RACE PCR, depended on a 1 190 bp cDNA fragment from transcriptome of U. unicinctus. Then the full-length cDNA sequence was assembled which was 2 102 bp including an open reading frame (ORF) of 1 212 bp, a 160 bp 5’ untranslated region (UTR) and a 422 bp 3’UTR. A putative protein of amino acids with a theoretical pI of 7.15 and molecular mass of 45.9 kDa was encoded by the ORF. Five JNK conserved domains were contained in the deduced amino acid sequence, an activation loop with dual phosphorylation site (TPY), a glycine-rich loop, a catalytic loop and common docking domain, The deduced JNK amino acid sequence presented typical characteristics of JNK family. BLAST analysis indicated that the deduced amino acid sequence was highly homologous with other known JNK homologues, 81.9% identical to Cerapachys biroi, 79% to Zootermopsis nevadensis and 78% to Mus musculus. A phylogenetic tree was constructed based on amino acid alignment using the MEGA program, and it was observed that U. unicinctus JNK clustered primarily with Stegodyphus mimosarum and formed a sister group to Cerapachys biroi and other JNKs. On the whole, the relationships displayed in the phylogenetic tree were generally in accordance with classic taxonomy. Western blot detection indicated that no significant change was presented in total protein content of JNK when the worm was exposed to sulfide. But the content of active phospho-JNK(p-JNK) was significantly increased in U. unicinctus hindgut during the experiment, which was 10.2-fold higher in 150 μmol/L group at 48 h post-exposure than that of control. Our findings suggested that U. unicinctus JNK is conservative evolutionally and the JNK pathway plays a role in response to sulfide stress in U. unicinctus.

Key words:Urechis unicinctus； sulfide； JNK pathway

DOI：10.16441/j.cnki.hdxb.20150085

中圖法分類號：Q257

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5174(2016)02-076-07

作者簡介：劉樹人(1988-)，男，碩士。研究方向：海洋生物學。??通訊作者：E-mail：zzfp107@ouc.edu.cn

收稿日期：2015-03-18；

修訂日期：2015-04-26

基金項目：?國家自然科學基金面上項目(31372506)資助

引用格式：劉樹人， 劉曉龍， 李岳， 等. 單環(huán)刺螠呼吸腸JNK通路對硫化物的應激反應[J]. 中國海洋大學學報(自然科學版), 2016, 46(2): 76-82.

Supported by National Natural Science Foundation of China(31372506)