陳謹(jǐn)+程險(xiǎn)峰+江炳福+詹圣偉+朱明+鄭錦繡+陳道利

[摘要] 目的 了解長(zhǎng)江中下游三城市腸道病毒71型（EV71）基因型的分布狀況。方法 利用逆轉(zhuǎn)錄半巢式PCR的方法檢測(cè)三所城市143份臨床診斷為手足口病患兒的血清和咽拭子標(biāo)本。 結(jié)果 143份標(biāo)本中檢測(cè)到陽性EV71 RNA33份（23%）；經(jīng)過測(cè)序證實(shí)33份標(biāo)本均為EV71 C4型。 結(jié)論 三所城市的手足口病主要由C型 EV71病毒引起。不同城市間EV71病毒存在一定的變異。

[關(guān)鍵詞] EV71；RT-PCR；手足口??；基因型

[中圖分類號(hào)] R373[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號(hào)] 1673-9701（2014）19-0076-03

The analysis of genic characteristics of 143 cases of enterovirus 71 in 3 cities of the middle and lower reaches of Changjiang River

CHEN Jin1 CHENG Xianfeng1 JIANG Bingfu2 ZHAN Shengwei1 ZHU Ming1 ZHENG Jinxiu1 CHEN Daoli1

1.Maanshan Center for Disease Control and Prevention in Anhui Province, Maanshan 243000, China; 2. Medical College of Dongnan University, Nanjing 210009, China

[Abstract] Objective To investigate the EV71 genotypes in 3 cities of the middle and lower reaches of Changjiang River. Methods EV71 RNA was detected in 143 samples from the hospitals with reverse translation polymerase chain reaction. Results There were 33 (23%) positive products. After the 33 positive products were sequenced, the results showed that they were all C4 genotype EV71. Conclusion It seems that the HFMDs are mainly infected by the C4 genotype EV71 in these areas. This study indicates that the current C4 genotype EV71 varied significantly in different cities.

[Key words] EV71; RT-PCR; Hand-foot-mouth disease; Genotype

人類腸道病毒71 型（EV71）屬于腸病毒屬A型，是柯薩奇病毒A16（CA16）的近親, 其感染后主要引起手足口?。╤and-foot-mouth disease, HFMD）、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎及腦炎等臨床癥狀。EV71急性感染還容易造成嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，重癥病人病死率可達(dá)10%～25%，這一點(diǎn)與CA16不同[1]。1997年以來，EV71病毒的流行在亞太地區(qū)呈明顯上升趨勢(shì)。其中，1998年和2000年臺(tái)灣有過兩次EV71大流行，分別有129 106和80 677人染病，78、41人死亡[2]。我國(guó)深圳2003年也出現(xiàn)EV71暴發(fā)疫情[3]，2008年3～4月間我省阜陽市發(fā)生兒童感染EV71疫情，死亡總?cè)藬?shù)達(dá)到36人[4]。

有研究利用VP1序列的差異對(duì)EV71型病毒進(jìn)行的一項(xiàng)分子流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)[5]，EV71型病毒又可分為A、B、C三個(gè)亞型。在亞型中，B型和C型又可以分成B1~B5和C1~C5。各地流行的EV71病毒株存在差異，1970年美國(guó)加利福尼亞分離出的EV71毒株屬于A型；隨后，美國(guó)、哥倫比亞及澳大利亞等地成功分離出EV71毒株的亞型EB型。1997～2000年，亞太地區(qū)流行的EV71屬于B3、B4、C1和C2型[6]，而2008年安徽省阜陽市流行的毒株則為C4型。

為了了解長(zhǎng)江中下游三城市EV71流行毒株的基因型別，我們通過RT-nPCR技術(shù)（逆轉(zhuǎn)錄-半巢式聚合酶鏈反應(yīng)）對(duì)143個(gè)疑似手足口病的樣本的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)不同城市之間流行的毒株是否為同源毒株進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 一般材料

咽拭子標(biāo)本共143份，來源于2012年5～7月安徽馬鞍山市、蕪湖市和南京市各醫(yī)院收治的手足口病患兒。手足口病診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《手足口病預(yù)防控制指南》（2008年版）。

1.2 EV71代表株的基因序列

在GenBank中查詢13株EV71毒株的VP1序列，其中11株包括A、B、C型及其亞型，為部分基因序列。剩余2株為全基因序列。

1.3 引物的設(shè)計(jì)

以GenBank中的EV71基因序列為參照，通過不同的基因型以及亞型的保守區(qū)合成相關(guān)引物。具體引物序列如下：第一輪：5-CCRGTAGGKGTRC ACGCRAC-3， 5-GTTCTTAACTCACATAGCA-3；第二輪：5-TTGACAAAAACTGAGGGGTT-3，5-GTTCTTAACTC ACATAGCA-3。由于引物位于EV71 的VP1區(qū)域，所以能更加有效地?cái)U(kuò)增EV71 A、B、C亞型的基因片段[7]。

1.4 RNA抽提及半巢氏RT-PCR檢測(cè)

取200 μL咽拭子按照Rneasy Mini Kit（Qiagen）中提到的操作說明進(jìn)行病毒RNA的提取。所提取RNA于-70℃進(jìn)行保存或者立刻進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。以陰性作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，RT-PCR反應(yīng)采用一步法RT-PCR試劑盒（Qiagen）進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪的反應(yīng)環(huán)境為：42℃下逆轉(zhuǎn)錄（45 min），94℃下預(yù)變性（4 min）；第一輪的PCR反應(yīng)環(huán)境：94℃下變性（30 s），50℃下退火（25 s），72℃下延伸（70 s），一共35個(gè)循環(huán)周期；72℃下再延伸（10 min）。第二輪的PCR反應(yīng)溫度依次為：50℃（30 min），94℃（2 min），94℃（30 s），48℃（30 s），72℃（40 s），一共35個(gè)循環(huán)周期。

1.5 測(cè)序與分析

通過純化試劑盒對(duì)PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，該過程由上海英駿生物公司完成。利用分子生物學(xué)軟件MEGA4.1和DNASTAR進(jìn)行序列的遺傳距離計(jì)算、同源性比較以及基因的進(jìn)化樹繪制，方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[8]。

2 結(jié)果

2.1 EV71 RNA的檢測(cè)

對(duì)三個(gè)城市臨床診斷為手足口病患兒的143份咽拭子標(biāo)本進(jìn)行EV71病毒的 RNA檢測(cè)。結(jié)果顯示共有33份陽性標(biāo)本，陽性率為31%。部分陽性標(biāo)本的PCR產(chǎn)物的電泳圖譜見圖1。

1. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2. 陰性對(duì)照；3. MAS-01；4. MAS-12；

endprint

5.WUHU-01；6.NANJING-05

圖1 馬鞍山地區(qū)標(biāo)本的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 同源性分析

將33份純化后的陽性標(biāo)本的核苷酸序列與EV71病毒各基因型和亞型代表株的相應(yīng)片段進(jìn)行同源性比較（表1）。33株EV71病毒分離株與 CA16、A、B 基因型及亞型代表株的同源性差異較大，與CA16代表株核苷酸同源性僅為49.2%～53.4%，與C代表株同源性差異較小，為82.6%～98.6%。與 B基因型及其亞型代表株的同源性為78.1%～81.4%，與A代表株（U22521）的同源性為75.0%～79.3%;與C4基因亞型同源性最高，達(dá)92.1%～98.6%。馬鞍山12株內(nèi)部同源性最高，達(dá)到99.5%～100%，南京11株內(nèi)部同源性為96.5%～100%，而蕪湖10株同源性為96.3%～100%。三城市之間毒株比較發(fā)現(xiàn)，馬鞍山與南京毒株間的同源性在92.5%～94.7%之間；馬鞍山與蕪湖毒株間的同源性較高，為96.3%～100%；而南京、蕪湖毒株間的同源性最低，僅為89.8%～94.1%。

2.3基因分型

從基因進(jìn)化樹（圖2）可以看到，CA16 U05876毒株單獨(dú)成一分支，EV71 A型U22521株構(gòu)成一個(gè)主要分支；AF376066、AF376117、U22522、AY905548、AY135873株則分別構(gòu)成B1~B5亞型；33例陽性標(biāo)本與來源于新加坡、臺(tái)灣及阜陽的6個(gè)毒株形成一個(gè)分支，該分支較大。上述結(jié)果提示，33份標(biāo)本屬于C型EV71病毒，同時(shí)和阜陽EU703812毒株形成同一亞型，為EV71 C4b病毒。C型EV71分支中可繼續(xù)分為5個(gè)亞型。其中AF135948 和AB552988共同形成一個(gè)亞型，為亞型C2。AF135932獨(dú)自形成一個(gè)亞型，為亞型C1；阜陽株和我們的研究中發(fā)現(xiàn)的33株組成一個(gè)分支，為亞型C4。

3 討論

1969年EV71病毒首次從一名患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒中分離出。此后全球范圍內(nèi)均有EV71病毒的相關(guān)流行報(bào)道。過去40多年間，共三次全球大流行。其中，我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)于1998年發(fā)生了HFMD的大流行，共出現(xiàn)病例為129 106例，其中嚴(yán)重病例405例，死亡78例，大部分死因?yàn)榉嗡[和肺出血，其中＜5歲的死亡患兒占91％，其中48.7%的患者感染EV71[2]。

由于HFMD主要由EV71 和 CVA16 引起，但兩者臨床癥狀類似，難以區(qū)分，因此主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷方法主要有免疫組化、病毒分離及中和抗體水平的檢測(cè)。然而，這些方法需較大人力、物力及時(shí)間，無法滿足快速診斷和大樣本的顯示需求。研究表明[9]腸道病毒（EV）的血清型與VP1基因序列密切相關(guān)，可用于鑒定 EV血清型；同時(shí)由于其存在最大的變異率，因此研究人員利用這一點(diǎn)對(duì)EV病毒進(jìn)行相關(guān)的分子流行病學(xué)研究。

本研究以EV71病毒特異性片段為引物，擴(kuò)增出 EV71 VP1區(qū)232bp的基因片段，從而達(dá)到快速診斷目的。本研究對(duì)143份咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了擴(kuò)增，其中33份標(biāo)本的PCR結(jié)果為陽性。同時(shí)，課題組對(duì)33株EV71病毒的特異性序列進(jìn)行了相關(guān)的基因進(jìn)化分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明33株病毒與 A型及B型代表株存在較大差異，而與 C型代表株存在較高的同源性，尤其與屬于C4亞型毒株有很高同源性。

以往研究認(rèn)為各毒株基因型內(nèi)部的差異＞15%視

為一個(gè)新的基因型，而同源性＜12％為亞型分型的標(biāo)準(zhǔn)[9]。實(shí)驗(yàn)中所分離的33株EV7病毒與C型病毒有82.6%～98.6%的同源性序列。因此根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該出現(xiàn)新的病毒型或病毒亞型。然而從基因樹的結(jié)果進(jìn)行分析，33株病毒依舊為C型病毒。造成該現(xiàn)象發(fā)生的可能原因?yàn)椋篜CR擴(kuò)增的序列片段較小，造成有較大差異的同源性現(xiàn)象的形成。當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)EV71的檢測(cè)研究所擴(kuò)增的序列均為200～350 bp。因此，繼續(xù)以之前的分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病毒分型值得商榷。

根據(jù)基因同源性的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)33株EV71分離株雖然均屬于C4亞型，但不同城市所分離的毒株同源性并不高，存在較大變異。因此，對(duì)EV71分子流行病學(xué)進(jìn)行深入的研究有利于我們研制特異性強(qiáng)、靈敏度高的診斷試劑和EV71疫苗。

[參考文獻(xiàn)]

[1]周曉鳳，熊林. 重癥手足口病并發(fā)腦炎患兒的護(hù)理干預(yù)[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生， 2013，51（15）：98-99.

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[6]王美芬，陳韜杜，曾慶，等. 2010年昆明及周邊地區(qū)普通型與重型手足口病病原學(xué)分析[J]. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)刊，2013， 40（1）：30-32.

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[9]張穎，和鵬，陳純，等. 廣州市2011年柯薩奇病毒A組6型的分子流行病學(xué)特征[J]. 中華流行病學(xué)雜志，2014， 35（1）：103-104.

（收稿日期：2014-03-26）

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圖1 馬鞍山地區(qū)標(biāo)本的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 同源性分析

將33份純化后的陽性標(biāo)本的核苷酸序列與EV71病毒各基因型和亞型代表株的相應(yīng)片段進(jìn)行同源性比較（表1）。33株EV71病毒分離株與 CA16、A、B 基因型及亞型代表株的同源性差異較大，與CA16代表株核苷酸同源性僅為49.2%～53.4%，與C代表株同源性差異較小，為82.6%～98.6%。與 B基因型及其亞型代表株的同源性為78.1%～81.4%，與A代表株（U22521）的同源性為75.0%～79.3%;與C4基因亞型同源性最高，達(dá)92.1%～98.6%。馬鞍山12株內(nèi)部同源性最高，達(dá)到99.5%～100%，南京11株內(nèi)部同源性為96.5%～100%，而蕪湖10株同源性為96.3%～100%。三城市之間毒株比較發(fā)現(xiàn)，馬鞍山與南京毒株間的同源性在92.5%～94.7%之間；馬鞍山與蕪湖毒株間的同源性較高，為96.3%～100%；而南京、蕪湖毒株間的同源性最低，僅為89.8%～94.1%。

2.3基因分型

從基因進(jìn)化樹（圖2）可以看到，CA16 U05876毒株單獨(dú)成一分支，EV71 A型U22521株構(gòu)成一個(gè)主要分支；AF376066、AF376117、U22522、AY905548、AY135873株則分別構(gòu)成B1~B5亞型；33例陽性標(biāo)本與來源于新加坡、臺(tái)灣及阜陽的6個(gè)毒株形成一個(gè)分支，該分支較大。上述結(jié)果提示，33份標(biāo)本屬于C型EV71病毒，同時(shí)和阜陽EU703812毒株形成同一亞型，為EV71 C4b病毒。C型EV71分支中可繼續(xù)分為5個(gè)亞型。其中AF135948 和AB552988共同形成一個(gè)亞型，為亞型C2。AF135932獨(dú)自形成一個(gè)亞型，為亞型C1；阜陽株和我們的研究中發(fā)現(xiàn)的33株組成一個(gè)分支，為亞型C4。

3 討論

1969年EV71病毒首次從一名患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒中分離出。此后全球范圍內(nèi)均有EV71病毒的相關(guān)流行報(bào)道。過去40多年間，共三次全球大流行。其中，我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)于1998年發(fā)生了HFMD的大流行，共出現(xiàn)病例為129 106例，其中嚴(yán)重病例405例，死亡78例，大部分死因?yàn)榉嗡[和肺出血，其中＜5歲的死亡患兒占91％，其中48.7%的患者感染EV71[2]。

由于HFMD主要由EV71 和 CVA16 引起，但兩者臨床癥狀類似，難以區(qū)分，因此主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷方法主要有免疫組化、病毒分離及中和抗體水平的檢測(cè)。然而，這些方法需較大人力、物力及時(shí)間，無法滿足快速診斷和大樣本的顯示需求。研究表明[9]腸道病毒（EV）的血清型與VP1基因序列密切相關(guān)，可用于鑒定 EV血清型；同時(shí)由于其存在最大的變異率，因此研究人員利用這一點(diǎn)對(duì)EV病毒進(jìn)行相關(guān)的分子流行病學(xué)研究。

本研究以EV71病毒特異性片段為引物，擴(kuò)增出 EV71 VP1區(qū)232bp的基因片段，從而達(dá)到快速診斷目的。本研究對(duì)143份咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了擴(kuò)增，其中33份標(biāo)本的PCR結(jié)果為陽性。同時(shí)，課題組對(duì)33株EV71病毒的特異性序列進(jìn)行了相關(guān)的基因進(jìn)化分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明33株病毒與 A型及B型代表株存在較大差異，而與 C型代表株存在較高的同源性，尤其與屬于C4亞型毒株有很高同源性。

以往研究認(rèn)為各毒株基因型內(nèi)部的差異＞15%視

為一個(gè)新的基因型，而同源性＜12％為亞型分型的標(biāo)準(zhǔn)[9]。實(shí)驗(yàn)中所分離的33株EV7病毒與C型病毒有82.6%～98.6%的同源性序列。因此根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該出現(xiàn)新的病毒型或病毒亞型。然而從基因樹的結(jié)果進(jìn)行分析，33株病毒依舊為C型病毒。造成該現(xiàn)象發(fā)生的可能原因?yàn)椋篜CR擴(kuò)增的序列片段較小，造成有較大差異的同源性現(xiàn)象的形成。當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)EV71的檢測(cè)研究所擴(kuò)增的序列均為200～350 bp。因此，繼續(xù)以之前的分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病毒分型值得商榷。

根據(jù)基因同源性的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)33株EV71分離株雖然均屬于C4亞型，但不同城市所分離的毒株同源性并不高，存在較大變異。因此，對(duì)EV71分子流行病學(xué)進(jìn)行深入的研究有利于我們研制特異性強(qiáng)、靈敏度高的診斷試劑和EV71疫苗。

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[9]張穎，和鵬，陳純，等. 廣州市2011年柯薩奇病毒A組6型的分子流行病學(xué)特征[J]. 中華流行病學(xué)雜志，2014， 35（1）：103-104.

（收稿日期：2014-03-26）

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圖1 馬鞍山地區(qū)標(biāo)本的PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 同源性分析

將33份純化后的陽性標(biāo)本的核苷酸序列與EV71病毒各基因型和亞型代表株的相應(yīng)片段進(jìn)行同源性比較（表1）。33株EV71病毒分離株與 CA16、A、B 基因型及亞型代表株的同源性差異較大，與CA16代表株核苷酸同源性僅為49.2%～53.4%，與C代表株同源性差異較小，為82.6%～98.6%。與 B基因型及其亞型代表株的同源性為78.1%～81.4%，與A代表株（U22521）的同源性為75.0%～79.3%;與C4基因亞型同源性最高，達(dá)92.1%～98.6%。馬鞍山12株內(nèi)部同源性最高，達(dá)到99.5%～100%，南京11株內(nèi)部同源性為96.5%～100%，而蕪湖10株同源性為96.3%～100%。三城市之間毒株比較發(fā)現(xiàn)，馬鞍山與南京毒株間的同源性在92.5%～94.7%之間；馬鞍山與蕪湖毒株間的同源性較高，為96.3%～100%；而南京、蕪湖毒株間的同源性最低，僅為89.8%～94.1%。

2.3基因分型

從基因進(jìn)化樹（圖2）可以看到，CA16 U05876毒株單獨(dú)成一分支，EV71 A型U22521株構(gòu)成一個(gè)主要分支；AF376066、AF376117、U22522、AY905548、AY135873株則分別構(gòu)成B1~B5亞型；33例陽性標(biāo)本與來源于新加坡、臺(tái)灣及阜陽的6個(gè)毒株形成一個(gè)分支，該分支較大。上述結(jié)果提示，33份標(biāo)本屬于C型EV71病毒，同時(shí)和阜陽EU703812毒株形成同一亞型，為EV71 C4b病毒。C型EV71分支中可繼續(xù)分為5個(gè)亞型。其中AF135948 和AB552988共同形成一個(gè)亞型，為亞型C2。AF135932獨(dú)自形成一個(gè)亞型，為亞型C1；阜陽株和我們的研究中發(fā)現(xiàn)的33株組成一個(gè)分支，為亞型C4。

3 討論

1969年EV71病毒首次從一名患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒中分離出。此后全球范圍內(nèi)均有EV71病毒的相關(guān)流行報(bào)道。過去40多年間，共三次全球大流行。其中，我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)于1998年發(fā)生了HFMD的大流行，共出現(xiàn)病例為129 106例，其中嚴(yán)重病例405例，死亡78例，大部分死因?yàn)榉嗡[和肺出血，其中＜5歲的死亡患兒占91％，其中48.7%的患者感染EV71[2]。

由于HFMD主要由EV71 和 CVA16 引起，但兩者臨床癥狀類似，難以區(qū)分，因此主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。目前實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷方法主要有免疫組化、病毒分離及中和抗體水平的檢測(cè)。然而，這些方法需較大人力、物力及時(shí)間，無法滿足快速診斷和大樣本的顯示需求。研究表明[9]腸道病毒（EV）的血清型與VP1基因序列密切相關(guān)，可用于鑒定 EV血清型；同時(shí)由于其存在最大的變異率，因此研究人員利用這一點(diǎn)對(duì)EV病毒進(jìn)行相關(guān)的分子流行病學(xué)研究。

本研究以EV71病毒特異性片段為引物，擴(kuò)增出 EV71 VP1區(qū)232bp的基因片段，從而達(dá)到快速診斷目的。本研究對(duì)143份咽拭子標(biāo)本進(jìn)行了擴(kuò)增，其中33份標(biāo)本的PCR結(jié)果為陽性。同時(shí)，課題組對(duì)33株EV71病毒的特異性序列進(jìn)行了相關(guān)的基因進(jìn)化分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明33株病毒與 A型及B型代表株存在較大差異，而與 C型代表株存在較高的同源性，尤其與屬于C4亞型毒株有很高同源性。

以往研究認(rèn)為各毒株基因型內(nèi)部的差異＞15%視

為一個(gè)新的基因型，而同源性＜12％為亞型分型的標(biāo)準(zhǔn)[9]。實(shí)驗(yàn)中所分離的33株EV7病毒與C型病毒有82.6%～98.6%的同源性序列。因此根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)該出現(xiàn)新的病毒型或病毒亞型。然而從基因樹的結(jié)果進(jìn)行分析，33株病毒依舊為C型病毒。造成該現(xiàn)象發(fā)生的可能原因?yàn)椋篜CR擴(kuò)增的序列片段較小，造成有較大差異的同源性現(xiàn)象的形成。當(dāng)前國(guó)內(nèi)對(duì)EV71的檢測(cè)研究所擴(kuò)增的序列均為200～350 bp。因此，繼續(xù)以之前的分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病毒分型值得商榷。

根據(jù)基因同源性的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)33株EV71分離株雖然均屬于C4亞型，但不同城市所分離的毒株同源性并不高，存在較大變異。因此，對(duì)EV71分子流行病學(xué)進(jìn)行深入的研究有利于我們研制特異性強(qiáng)、靈敏度高的診斷試劑和EV71疫苗。

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（收稿日期：2014-03-26）

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