羅江輝， 李文瑤，陶國(guó)才

(1.四川省腫瘤醫(yī)院 麻醉科，四川 成都　610041； 2.第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院 手術(shù)麻醉科，重慶　400038)

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依達(dá)拉奉對(duì)老年大鼠術(shù)后早期記憶水平的影響及其機(jī)制研究

羅江輝1， 李文瑤1，陶國(guó)才2

(1.四川省腫瘤醫(yī)院 麻醉科，四川 成都610041； 2.第三軍醫(yī)大學(xué)附屬西南醫(yī)院 手術(shù)麻醉科，重慶400038)

[摘要]目的:探索使用依達(dá)拉奉對(duì)老年大鼠術(shù)后早期記憶水平的影響。方法:將老年大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、手術(shù)組和依達(dá)拉奉組，依達(dá)拉奉組與手術(shù)組采用大鼠剖腹探查模型，依達(dá)拉奉組于手術(shù)結(jié)束時(shí)肌注依達(dá)拉奉3mg·kg-1，對(duì)照組不做手術(shù)處理。各組大鼠于手術(shù)后12、24、72h取靜脈血漿，立即按照S100β試劑盒、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron- specific enolase，NSE )試劑盒說明書測(cè)神經(jīng)損傷特異性標(biāo)志物S100β蛋白和NSE含量。采用條件恐怖適應(yīng)實(shí)驗(yàn)中追蹤適應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠術(shù)后記憶能力。各組大鼠于術(shù)后72h最后一次采血后斷頭取腦，分離海馬，采用ELISA檢測(cè)大鼠海馬IL- 1β、TNF- α濃度。結(jié)果:與對(duì)照組相比，手術(shù)可導(dǎo)致老年大鼠術(shù)后血漿S100β蛋白、NSE表達(dá)上升(P<0.01)，海馬IL- 1β、TNF- α表達(dá)增多(P<0.01)，記憶水平下降(P<0.01)。使用依達(dá)拉奉可抑制手術(shù)引起的老年大鼠血漿S100β蛋白、NSE表達(dá)上升(P<0.01)和海馬IL- 1β、TNF- α表達(dá)增多(P<0.01)，減輕手術(shù)引起的老年大鼠記憶能力下降(P<0.01)。結(jié)論:手術(shù)可導(dǎo)致老年大鼠海馬炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細(xì)胞損傷，引發(fā)老年大鼠早期記憶水平下降，使用依達(dá)拉奉可減輕手術(shù)引起的老年大鼠海馬炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細(xì)胞損傷，減輕手術(shù)引起的老年大鼠早期記憶水平下降。

[關(guān)鍵詞]依達(dá)拉奉； 記憶； 炎癥； 手術(shù)； 神經(jīng)細(xì)胞； 老年大鼠

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是臨床常見并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)為以記憶下降為主的認(rèn)知功能下降，現(xiàn)在可確定的唯一危險(xiǎn)因數(shù)為高齡[1]。研究發(fā)現(xiàn)圍手術(shù)期手術(shù)麻醉等各種原因引發(fā)的應(yīng)激反應(yīng)可以導(dǎo)致中樞炎癥反應(yīng)，而中樞炎癥反應(yīng)引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷在POCD的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[2]。依達(dá)拉奉是一種自由基清除劑，具有抗炎癥反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[3- 6]。本實(shí)驗(yàn)觀察老年大鼠手術(shù)后海馬炎癥反應(yīng)及神經(jīng)細(xì)胞損傷，同時(shí)檢測(cè)老年大鼠術(shù)后早期記憶水平，旨在發(fā)現(xiàn)依達(dá)拉奉能否通過其抗炎、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用，起到預(yù)防POCD發(fā)病的作用。

1材料和方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的18~20月齡雄性SD大鼠。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備[7]

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為空白對(duì)照(C)組、手術(shù)(S)組、依達(dá)拉奉處理(E)組，每組12只。C組大鼠不進(jìn)行手術(shù)，肌肉注射生理鹽水1ml·kg-1以模擬抓拿及注射刺激。使用5%水合氯醛(4~6ml·kg-1)給S組及E組老年大鼠麻醉。老年大鼠達(dá)到夾尾實(shí)驗(yàn)陰性的麻醉深度后，消毒腹部皮膚，取正中切口，長(zhǎng)約2cm，止血后依次探查腹腔器官，每5min探查1次，每次約1min，共探查6次后依次縫合腹腔。手術(shù)共進(jìn)行約40min。手術(shù)結(jié)束時(shí)，E組老年大鼠肌注依達(dá)拉奉3mg·kg-1(3mg·ml-1)[8]。

1.3條件恐怖適應(yīng)實(shí)驗(yàn)[7]

使用條件恐怖適應(yīng)實(shí)驗(yàn)中追蹤適應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠術(shù)后早期記憶。實(shí)驗(yàn)于手術(shù)前3d開始，訓(xùn)練房間與記錄房間隔開，將大鼠單只置于訓(xùn)練房電擊籠內(nèi)，由揚(yáng)聲器發(fā)出16s噪聲，在噪聲持續(xù)的最后2s內(nèi)加以1mA電擊老年大鼠足底。12s后進(jìn)行第二次訓(xùn)練，每只大鼠每日進(jìn)行10次訓(xùn)練。共進(jìn)行3d。3d后S組及E組大鼠進(jìn)行剖腹探查手術(shù)，C組給予肌肉注射生理鹽水1ml·kg-1。術(shù)后24h各組大鼠依次單只置于電擊籠內(nèi)，只使用噪音，不使用電擊，記錄大鼠僵直時(shí)間占總時(shí)間百分比。電腦軟件(bio- will～，上海軟隆)分析僵直時(shí)間占總時(shí)間百分比。

1.4S100β蛋白、NSE含量檢測(cè)

3組大鼠于術(shù)后12、24、72h使用尾靜脈采靜脈血漿，使用S100β蛋白、NSE檢測(cè)試劑盒進(jìn)行血漿S100β蛋白、NSE含量檢測(cè)，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.5IL- 1β、TNF-α含量檢測(cè)

3組大鼠于術(shù)后72h最后一次取血后斷頭取腦，分離海馬，將海馬勻漿，使用ELISA試劑盒檢測(cè)海馬組織IL- 1β、TNF-α含量，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1條件恐怖適應(yīng)實(shí)驗(yàn)

2.1.1在無任何刺激環(huán)境中老年大鼠僵直時(shí)間占總時(shí)間比C組老年大鼠在無任何刺激環(huán)境中的僵直時(shí)間占總時(shí)間比為(6.12±1.1)%，S組老年大鼠在無任何刺激環(huán)境中的僵直時(shí)間占總時(shí)間比為(6.12±1.2)%，E組老年大鼠在無任何刺激環(huán)境中的僵直時(shí)間占總時(shí)間比為(6.11±1.4)%，3組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.1.2老年大鼠僵直時(shí)間占總時(shí)間比剖腹探查手術(shù)后24h， C組老年大鼠僵直時(shí)間占總時(shí)間比為(941.6±4.3)%，S組老年大鼠僵直時(shí)間占總時(shí)間比為(7.83±0.9)%，E組老年大鼠僵直時(shí)間占總時(shí)間比為(28.52±2.9)%。S組老年大鼠與C組比較，僵直時(shí)間占總時(shí)間比明顯減少，表明老年大鼠手術(shù)后后記憶水平下降(P< 0. 01)。E組老年大鼠僵直時(shí)間占總時(shí)間比相比S組明顯上升，表明E組老年大鼠相比手術(shù)組老年大鼠記憶水平改善(P< 0.01)。

2.2老年大鼠術(shù)后靜脈血漿神經(jīng)損傷標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果

手術(shù)后12、24、72h，S組、E組大鼠血漿神經(jīng)損傷標(biāo)志物S100β蛋白、NSE表達(dá)都較C組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；E組表達(dá)較S組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。說明手術(shù)可損傷神經(jīng)細(xì)胞，使用依達(dá)拉奉可降低手術(shù)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。

組 別S100β/ng·L-1NSE/ng·L-1術(shù)后12h術(shù)后24h術(shù)后72h術(shù)后12h術(shù)后24h術(shù)后72hC組0.34±0.010.35±0.030.34±0.03209.62±31.01212.22±30.69210.31±31.82S組1.29±0.13a1.39±0.11a0.89±0.14a454.42±47.93a416.91±32.15a290.76±32.87aE組0.85±0.13ab0.67±0.19ab0.52±0.11ab339.11±51.41ab329.32±43.41ab238.6±32.92ab

與C組比較，aP<0.01；與S組比較，bP<0.01

2.3老年大鼠海馬炎癥因子表達(dá)結(jié)果

術(shù)后72h，S組、E組老年大鼠海馬TNF-α和IL- 1β蛋白表達(dá)都較C組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；E組表達(dá)較S組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。說明手術(shù)可引發(fā)老年大鼠中樞海馬炎癥反應(yīng)，使用依達(dá)拉奉可減輕手術(shù)引發(fā)的老年大鼠中樞海馬炎癥反應(yīng)。

ng·L-1

與C組比較，aP<0.01;與S組比較，bP<0.01

3討論

POCD主要發(fā)生于老年人，發(fā)病率較高[1，9]。 據(jù)國(guó)際術(shù)后認(rèn)知功能障礙協(xié)會(huì)一項(xiàng)大樣本、多中心報(bào)道，65歲以上老年人術(shù)后1周POCD發(fā)病率約為25.8%，3個(gè)月后發(fā)病率為9.9%[1]。POCD發(fā)病機(jī)制不清，發(fā)病原因不明[3]。目前研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)是POCD發(fā)病機(jī)制研究，特別是早期POCD發(fā)病研究的中心環(huán)節(jié)，可引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡[5]。中樞炎癥反應(yīng)時(shí)，TNF-α和IL- 1β釋放增加，吸引中性粒細(xì)胞聚集，激活免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的基因表達(dá)及分泌，促進(jìn)神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放[10- 11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)手術(shù)應(yīng)激后3d，老年大鼠海馬TNF-α和IL- 1β釋放增加，說明手術(shù)應(yīng)激早期可引發(fā)老年大鼠中樞炎癥反應(yīng)。

當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)膜受損時(shí)，NSE和S100β蛋白可釋放至細(xì)胞外間隙，通過受損的血腦屏障進(jìn)入腦脊液和血液，因而測(cè)定其變化可以反映中樞神經(jīng)損傷。腦脊液中NSE和S100β蛋白的變化與患者的年齡、性別有關(guān)，而血液中的變化與年齡、性別無關(guān)。S100β蛋白、NSE是目前常用檢測(cè)腦損傷及腦功能損傷指標(biāo)[12- 13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，術(shù)后12、24、72h，手術(shù)組大鼠NSE和S100β蛋白表達(dá)都上升，說明手術(shù)應(yīng)激早期可造成神經(jīng)細(xì)胞損傷。

條件恐怖適應(yīng)實(shí)驗(yàn)是目前國(guó)際上常用的檢測(cè)記憶水平的實(shí)驗(yàn)工具[7]，由于其不受運(yùn)動(dòng)能力影響，因而適合術(shù)后檢測(cè)大鼠記憶水平。條件恐怖適應(yīng)實(shí)驗(yàn)分兩種，分別為追蹤適應(yīng)以及延遲適應(yīng)，追蹤適應(yīng)主要與海馬記憶相關(guān)，而延遲適應(yīng)主要與杏仁核相關(guān)[10]。本實(shí)驗(yàn)采用追蹤適應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠海馬記憶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后24h大鼠僵直時(shí)間明顯低于對(duì)照組，說明手術(shù)損傷了老年大鼠早期記憶水平。

依達(dá)拉奉作為一種強(qiáng)自由基清除劑，具有抗炎癥反應(yīng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，目前已用于急性腦損傷、腦梗死、腦出血等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療[3- 6]。但依達(dá)拉奉是否可通過其抗炎、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用預(yù)防早期POCD發(fā)病，目前研究甚少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)老年大鼠術(shù)后使用依達(dá)拉奉較不使用依達(dá)拉奉可降低其術(shù)后早期血漿神經(jīng)細(xì)胞損傷標(biāo)志物NSE和S100β蛋白表達(dá)，減輕其海馬炎癥反應(yīng)，同時(shí)改善其術(shù)后24h記憶水平，說明依達(dá)拉奉可能通過抗炎、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用起到預(yù)防老年大鼠早期POCD發(fā)病作用。

綜上所述，依達(dá)拉奉可能具有通過抑制中樞炎癥反應(yīng)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、預(yù)防早期POCD發(fā)病的作用，值得進(jìn)一步研究。

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Effects of edaravone on early memory of rats with its mechanism research

LUO Jiang- hui1，LI Wen- yao1，TAO Guo- cai2

(1.DepartmentofAnesthesiology，SichuanCancerHospital，Chengdu610041，China; 2.DepartmentofSurgeryandAnesthesiology，SouthwestHospital，theThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China)

[Abstract]Objective: To investigate the effects of edaravone on early memory of rats and its mechanonism. Methods: Aged rats were randomly allocated to the following contral(C)group， abdominal surgery alone(S)group， or intramuscular injection of edaravone after surgery(E)group. Rats received abdominal surgery in S group and E group. Rats in E group received intraperitoneally injection of edaravone (3mg·kg-1) after abdominal surgery. The concentration of S100β and NSE in plasma were measured by ELISA 12，24，72h after operation. Hippocampal IL- 1β，TNF- α were measured by ELISA 72h after operation.Rats’ memory was assessed by Fear Conditioning Test 24h after surgery. Results: Compared with that of control group， the concentration of S100β and NSE in plasma enhanced after surgery (P<0.01)but diminished if using edaravone(3mg·kg-1) (P<0.01).Compared with that of control group， the expression of IL- 1β，TNF- α in rats’ hippocampa enhanced after surgery (P<0.01)but diminished if using edaravone (3mg·kg-1) (P<0.01). Surgery could result in rats’ memory impairment(P<0.01)but diminished if using edaravone (3mg·kg-1) (P<0.01). Conclusion: Edaravone can restrain central inflamaton and injury of nerve to diminish the memory impairment after surgery in rats．

[Key words]edaravone; memory; inflammation; surgery; nerve cells； old rats

doi:10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.01.020

[中圖分類號(hào)]R96; R656

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671- 6264(2016)01- 0088- 04

[通信作者]陶國(guó)才E- mail:13908393339@vip.163.com

[作者簡(jiǎn)介]羅江輝(1972-)，男，四川瀘州人，主治醫(yī)師。 E- mail:temasek@qq.com

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81171034)

[收稿日期]2015- 06- 22[修回日期] 2015- 11- 22

[引文格式] 羅江輝，李文瑤，陶國(guó)才.依達(dá)拉奉對(duì)老年大鼠術(shù)后早期記憶水平的影響及其機(jī)制研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2016，35(1)：88- 91.

·論著·