鄭小婷，徐念來(lái)（.浙江省公安廳物證鑒定中心，浙江杭州30009；.杭州市公安局蕭山分局，浙江杭州300）

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硅珠法提取生物檢材DNA的影響因素

鄭小婷1，徐念來(lái)2
（1.浙江省公安廳物證鑒定中心，浙江杭州310009；2.杭州市公安局蕭山分局，浙江杭州311200）

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；DNA；硅珠法；生物檢材

在酚-氯仿有機(jī)法、Chelex-100法、磁珠法及硅珠法幾種DNA提取方法中，硅珠法在脫落細(xì)胞等微量生物檢材以及骨骼、牙齒等疑難生物檢材中的成功應(yīng)用得到了很多學(xué)者的認(rèn)可[1-3]。隨著硅珠法的不斷推廣應(yīng)用，有學(xué)者對(duì)傳統(tǒng)的硅珠法進(jìn)行了改良以提高其提取模板DNA的靈敏度[4]，也有人通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)加大檢材量能夠提高硅珠法在脫落細(xì)胞DNA中的提取濃度[5]。本研究系統(tǒng)地比較了硅珠量、硅珠懸浮時(shí)間以及懸浮方式對(duì)提取模板DNA質(zhì)量的影響，以期用最佳的組合提取方法來(lái)提高硅珠法的提取回收量。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器

7500熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國(guó)AB公司），金屬加熱混勻儀（德國(guó)Eppendorf公司），Quantifiler?Duo DNA Quantification試劑盒（美國(guó)AB公司），DNA標(biāo)準(zhǔn)品9947A（10ng/μL，美國(guó)AB公司），15%硅珠懸液；裂解緩沖液（lysis buffer，美國(guó)Promega公司），70%冷乙醇溶液。

1.2樣品制備

將對(duì)照品9947A（10 ng/μL）用無(wú)核酸酶水稀釋為1ng/μL，采用1.5 mL離心管分裝，每份100μL，共84份。并于每份稀釋液內(nèi)加入裂解緩沖液200μL，渦旋數(shù)秒混勻備用。

1.3方法

1.3.1硅珠量與懸浮時(shí)間的比較

取樣本稀釋液16份，編為A組、B組、C組和D組，每組4份，每份分別加入20、40、60、80μL硅珠懸液，然后渦旋數(shù)秒混勻，室溫條件下分別置于金屬加熱混勻儀上連續(xù)振蕩（900r/min），以保證硅珠微粒始終處于懸浮狀態(tài)。每組的4份樣本中硅珠微粒的懸浮時(shí)間依次為15、30、45和60min。懸浮時(shí)間結(jié)束后離心，并采用70%冷乙醇溶液洗滌2次，56℃揮干殘余乙醇，用純水洗脫結(jié)合在硅珠上的DNA，使DNA提取液終體積為30μL。上述實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.3.2懸浮方式與懸浮時(shí)間的比較

取樣本稀釋液12份，每份加入40 μL的硅珠懸液渦旋混勻后編為E組、F組和G組，每組4份。E組采用室溫靜置；F組采用室溫金屬加熱混勻儀上振蕩5 min（900 r/min）和靜置5 min的間隔振蕩懸浮方式；G組采用在室溫狀態(tài)下，在金屬加熱混勻儀上以900r/min的速度連續(xù)振蕩的懸浮方式。每組4份樣本中DNA與硅珠微粒的結(jié)合時(shí)間依次為15、30、45和60min。硅珠與DNA結(jié)合結(jié)束后離心，并采用70%冷乙醇溶液洗滌2次，56℃揮干殘余乙醇，用純水洗脫結(jié)合在硅珠上的DNA，使DNA提取液終體積為30μL。上述實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。

1.4 DNA定量

參照7500熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀操作手冊(cè)，采用25 μL反應(yīng)體系，其中混合物12.5 μL，引物10.5 μL，DNA模板2.0μL。

對(duì)7組共84份樣本回收所得的DNA全部進(jìn)行定量，采用7500 System SDS軟件分析數(shù)據(jù)。DNA回收率以終體積為30 μL的DNA回收量濃度與DNA標(biāo)準(zhǔn)液無(wú)損耗濃度的比值進(jìn)行計(jì)算。

2結(jié)　果

2.1硅珠量與懸浮時(shí)間的比較結(jié)果

如表1所示，在采用硅珠法提取模板DNA時(shí)，所加入的硅珠量、硅珠懸浮時(shí)間對(duì)提取到的最終DNA濃度有一定的影響。加入40μL硅珠懸液得到的DNA回收量最高，在加入相同硅珠量的情況下，硅珠與DNA的結(jié)合時(shí)間在15min所得到的DNA回收量最低，而在30min以上則無(wú)明顯差異。

2.2懸浮方式與懸浮時(shí)間的比較結(jié)果

在4個(gè)不同的時(shí)間段，硅珠微粒處于懸浮狀態(tài)比靜置所得到的DNA回收量高（表2）。連續(xù)振蕩后所得到的DNA回收量較間隔振蕩高。

表1硅珠量與懸浮時(shí)間的比較　?。╪=3，±s，ng/μL）

表1硅珠量與懸浮時(shí)間的比較　?。╪=3，±s，ng/μL）

注：1）與相同時(shí)間20μL硅珠量相比，P＜0.05；2）與相同硅珠量15min懸浮時(shí)間相比，P＜0.05；3）與相同時(shí)間40μL硅珠量相比，P＜0.05

硅珠量/μL　15min　30min　45min　60min 20　2.4105±0.1669　2.4000±0.0015　2.3470±0.0124　2.3928±0.0311 40　2.7046±0.0577　2.8649±0.02961）2）　2.8403±0.0837　2.8587±0.0626 60　2.6134±0.0437　2.6937±0.0600　2.7384±0.0159　2.7731±0.1047 80　2.7113±0.0646　2.6573±0.05203）　2.6095±0.1018　2.5075±0.0292

表2懸浮方式與懸浮時(shí)間的比較　?。╪=3，±s，ng/μL）

表2懸浮方式與懸浮時(shí)間的比較　　（n=3，±s，ng/μL）

注：1）與相同時(shí)間室溫靜置相比，P＜0.05；2）與相同時(shí)間間隔振蕩相比，P＜0.05；3）與相同懸浮方式懸浮15min相比，P＜0.05

懸浮方式　15min　30min　45min　60min室溫靜置　2.0688±0.1821　2.1538±0.1134　2.2365±0.0856　2.2523±0.0921間隔振蕩　2.4972±0.0533　2.4846±0.0762　2.5857±0.0213　2.6843±0.0034連續(xù)振蕩　2.7051±0.0021　2.8619±0.03141）2）3）　2.8427±0.0638　2.8613±0.0589

2.3 DNA回收量結(jié)果

按無(wú)損耗計(jì)算，100 μL質(zhì)量濃度為1 ng/μL的DNA標(biāo)準(zhǔn)稀釋液濃縮為30 μL后，其質(zhì)量濃度應(yīng)為3.3333ng/μL。采用三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值計(jì)算改良硅珠法提取DNA的回收量，所有樣本回收得到的DNA質(zhì)量濃度最低為2.0688ng/μL，最高為2.8649ng/μL。其回收率處于62.06%～85.95%。

3討　論

硅珠量、硅珠與DNA結(jié)合時(shí)間以及硅珠的懸浮方式是硅珠法提取DNA中的3個(gè)重要因素。有報(bào)道[2－3]稱，加大硅珠量以及減少洗脫體系可提高硅珠法回收模板DNA的濃度。

表1顯示，當(dāng)加入的硅珠量不足時(shí)，延長(zhǎng)結(jié)合時(shí)間并不能提高提取到的DNA的量；而當(dāng)加入過飽和的硅珠量時(shí)，DNA與硅珠的結(jié)合率反而下降，這可能與過多的硅珠微粒之間競(jìng)爭(zhēng)性爭(zhēng)奪DNA，而使DNA與硅珠的結(jié)合變得不那么牢固，在洗滌的過程中部分DNA被損耗有關(guān)。因此，在采用硅珠法提取微量生物檢材DNA的過程中，在加大檢材量的同時(shí)，也應(yīng)尋找最佳比例的硅珠量并適當(dāng)?shù)匮娱L(zhǎng)DNA與硅珠的結(jié)合時(shí)間。

表2結(jié)果表明，吸附過程中使硅珠處于懸浮狀態(tài)可以提高DNA的回收量，而且隨著懸浮時(shí)間的延長(zhǎng)，這種提高的效果更顯著。在日常案件檢驗(yàn)中，經(jīng)常提到并使用的是室溫靜置[4，6]，而通過本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這種方式得到的DNA量是最低的，這可能與室溫靜置過程中硅珠微粒由于重力作用下沉而引起的與溶液中DNA不能充分結(jié)合有關(guān)。本試驗(yàn)采用了900r/min的振蕩速度，既可以使硅珠微粒始終處于懸浮狀態(tài)又不會(huì)使結(jié)合在硅珠上的DNA被劇烈的分子撞擊而脫離硅珠微粒。連續(xù)振蕩與間隔振蕩所回收得到的DNA量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且間隔振蕩對(duì)于法醫(yī)工作者而言操作比較繁瑣，因此在實(shí)際檢案中建議采用連續(xù)振蕩的懸浮方式。

硅珠法提取生物檢材DNA的過程中，其提取DNA的回收率最低為62.06%，最高為85.95%，波動(dòng)幅度較大。并且相比較于磁珠法，硅珠法在提取、純化DNA時(shí)的損耗更大[7]。因此在采用硅珠法提取生物檢材DNA時(shí)，更應(yīng)注重提取過程中各個(gè)環(huán)節(jié)的優(yōu)化。綜上所述，在采用硅珠法提取微量生物檢材DNA時(shí)，使用適當(dāng)?shù)墓柚榱?，采用連續(xù)振蕩的懸浮方式，并適當(dāng)延長(zhǎng)DNA與硅珠的結(jié)合時(shí)間，可以提高模板DNA的濃度，從而相應(yīng)地提高微量生物檢材的檢出率及成功率，更好地為打擊犯罪服務(wù)。

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[7]李佑英，葉家喜，朱琳，等.不同純化濃縮方法對(duì)模板DNA回收量的影響研究[M]//法醫(yī)遺傳學(xué)進(jìn)展與應(yīng)用，北京：群眾出版社，2008.

（本文編輯：李成濤）

·醫(yī)療損害·

收稿日期：（2015－04－03）

作者簡(jiǎn)介：鄭小婷（1976—），女，碩士，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA分析技術(shù)應(yīng)用和研究；E-mail：turlina@sina.com

文章編號(hào)：1004-5619（2016）01-0063-02

中圖分類號(hào)：DF795.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.01.015