韓俊萍，孫　敬，歐　元，劉　鵬，葉　健，趙雯雯，王雪倩，張譯文，劉　耀，李彩霞（.中國人民公安大學刑事科學技術(shù)學院，北京00038；2.公安部物證鑒定中心北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心，北京00038；3.公安部物證鑒定中心法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室，北京00038；.清華大學醫(yī)學系統(tǒng)生物學研究中心，北京0008）

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15重快速STR復合擴增體系的構(gòu)建

韓俊萍1，孫敬2，3，歐元2，3，劉鵬4，葉健2，3，趙雯雯2，3，王雪倩2，3，張譯文2，3，劉耀2，3，李彩霞2，3
（1.中國人民公安大學刑事科學技術(shù)學院，北京100038；2.公安部物證鑒定中心北京市現(xiàn)場物證檢驗工程技術(shù)研究中心，北京100038；3.公安部物證鑒定中心法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室，北京100038；4.清華大學醫(yī)學系統(tǒng)生物學研究中心，北京100084）

摘要：目的建立一套15重快速STR復合擴增體系。方法選擇14個常染色體基因座以及1個性別基因座，采用FastStart Taq DNA聚合酶系統(tǒng)，以DNA標準品9947A為模板，通過篩選擴增條件、選擇熱啟動酶用量、調(diào)整引物平衡、優(yōu)化快速擴增程序、篩選反應緩沖液、選擇反應體系以及篩選添加劑等一系列復合擴增實驗，比較各條件下等位基因丟失和非特異性擴增情況。結(jié)果在以1ng DNA為模板、0.4μL聚合酶及10×FastStart高保真反應緩沖液構(gòu)成10μL快速體系的條件下，32min即可獲得標準DNA全部15個STR基因座的完整分型，無等位基因丟失和非特異性擴增現(xiàn)象，等位基因均衡性良好。同時，5%甘油、0.01%明膠、0.05%明膠和5mmol/L硫酸銨可作為PCR擴增過程中擬加入的反應添加劑。結(jié)論本研究建立的15重快速STR復合擴增體系可以明顯縮短反應時間，提高樣品檢測效率。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學；短串聯(lián)重復序列；聚合酶鏈反應；體系建立

目前，法醫(yī)學STR檢驗往往需經(jīng)過DNA提取和PCR擴增之后才能進行DNA分析，這一過程需要4～ 5 h，其中PCR擴增需3.5 h，是檢驗過程中最耗時的步驟，為縮短反應時間提高檢驗效率，由此出現(xiàn)了快速PCR技術(shù)。目前，快速PCR的研究主要集中在DNA聚合酶的改進、添加劑的研發(fā)及熱循環(huán)儀的革新三個方面[1-6]。本研究選取14個常染色體STR基因座和1個性別基因座，從快速擴增酶、引物濃度、緩沖液、添加劑、擴增參數(shù)等角度進行系統(tǒng)優(yōu)化，試圖建立一套15重快速PCR復合擴增體系，為快速獲得個體STR分型提供實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實驗樣本

DNA標準品9947A（初始質(zhì)量濃度為10ng/μL），購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2主要試劑與儀器

FastStart Taq DNA聚合酶試劑盒、PCR優(yōu)化試劑盒購自美國Roche公司；DNA TyperTM15試劑盒購自公安部物證鑒定中心；DNA標準品9947A購自美國AB公司。9700型PCR擴增儀、3130XL型遺傳分析儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3基因座信息

本研究選取14個常染色體STR基因座（D6S1043、D21S11、D7S820、CSF1PO、D2S1338、D3S1358、D13S317、D8S1179、D16S539、Penta E、D5S818、vWA、D18S51、FGA）和1個性別基因座（Amelogenin）用于構(gòu)建復合擴增體系，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4擴增條件的初步選擇

將實驗分為3組，分別采用3個不同的擴增條件進行初步選擇。反應體系均為10 μL，包括10×Fast-Start高保真反應緩沖液（含MgCl2）1 μL，dNTP Mix （10mmol/L each）0.2μL，DNA TyperTM15引物混合物1 μL，熱啟動酶（5 U/μL）0.4 μL，模板（1 ng/μL）9947A 1μL，水補足至10μL。

第1個擴增條件根據(jù)FastStart Taq DNA聚合酶試劑盒說明書設(shè)為：95℃4 min；95℃1 min，59℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃7min；25℃保溫。第2個擴增條件參照GlobalFilerTMExpress試劑盒程序設(shè)為：95℃1min；94℃3s，59℃30 s，30個循環(huán)；60℃8min；25℃保溫。第3個擴增條件采用下列程序：95℃4min；95℃20s，59℃20s，72℃20s，30個循環(huán)；72℃3min；25℃保溫。

反應均在9700型PCR擴增儀上進行。產(chǎn)物在3130XL型遺傳分析儀上電泳，結(jié)果采用GeneMapper? ID v3.2軟件進行分析。實驗重復3次。

1.5熱啟動酶用量的篩選

將熱啟動酶用量篩選實驗分為2組，參照FastStart Taq DNA聚合酶試劑盒說明書建立10μL反應體系，第1組PCR反應體系中加0.1 μL熱啟動酶，第2組加0.4μL熱啟動酶，根據(jù)1.4節(jié)實驗結(jié)果選取合適的條件作為擴增程序，用水代替9947A模板作為陰性對照。實驗重復3次。

1.6引物平衡調(diào)整

將15個基因座引物等比混合制成引物混合物（起始濃度均為100 μmol/L），采用1.4節(jié)中10 μL體系及優(yōu)選的擴增程序進行實驗，根據(jù)各個基因座等位基因熒光信號強度的高低，調(diào)整各基因座引物配比濃度，直至15個基因座全部擴出且峰高較為均衡，最終確定各基因座引物濃度。

1.7快速復合PCR擴增程序的優(yōu)化

根據(jù)1.6節(jié)實驗結(jié)果配制10×引物混合物，采用1.4節(jié)建立的反應體系進行快速復合擴增程序的優(yōu)化。

循環(huán)次數(shù)：將循環(huán)次數(shù)分為5組，分別為26、27、28、29、30次，其他步驟同1.4節(jié)優(yōu)選的程序。

變性時間：將循環(huán)中95℃變性時間分為4組，分別為5、10、30、60 s，循環(huán)次數(shù)由上節(jié)優(yōu)選的確定，其他步驟同1.4節(jié)優(yōu)選的程序。

退火時間：將循環(huán)中59℃退火時間分為4組，分別為10、20、30、60s，變性時間由上節(jié)優(yōu)選的確定，其他步驟同1.4節(jié)優(yōu)選的程序。

延伸時間：將循環(huán)中72℃延伸時間分為4組，分別為10、20、30、60s，退火時間由上節(jié)優(yōu)選的確定，其他步驟同1.4節(jié)優(yōu)選的程序。

終延伸時間：將終延伸時間分為4組，分別為1、3、5、7min，延伸時間由上節(jié)優(yōu)選的確定，其他步驟同1.4節(jié)優(yōu)選的程序。

1.8 PCR緩沖液的篩選

利用PCR優(yōu)化試劑盒中提供的16種緩沖液（表1）以及10×FastStart高保真反應緩沖液，采用1.4節(jié)中建立的10μL反應體系，擴增程序采用1.7節(jié)建立的快速PCR條件，平行比對17種緩沖液的擴增性能，根據(jù)擴增結(jié)果選取最優(yōu)者作為快速PCR的擴增緩沖液。

表1 16種緩沖液pH值及其所含MgCl2含量

1.9反應體系的選擇

將反應體系分為4組，分別為10、15、20、25 μL，體系配制見表2。采用1.7節(jié)建立的快速PCR條件，平行比對4種反應體系的擴增效果，選擇最優(yōu)者作為快速PCR的反應體系。

1.10 PCR添加劑的篩選

根據(jù)PCR優(yōu)化試劑盒提供的100%二甲基亞砜、50%甘油、1%明膠、500 mmol/L硫酸銨四種添加劑，參照FastStart Taq DNA聚合酶試劑盒說明書建立10 μL反應體系，分別加入上述4種添加劑，采用1.7節(jié)建立的快速PCR條件進行擴增，按照表2配制10μL擴增體系，添加劑的具體濃度見表3。平行比較各個添加劑的擴增效果，選擇合適的添加劑作為PCR輔助因子。

表2 PCR擴增各反應體系的配制　?。é蘈）

表3不同添加劑的含量及終濃度　　（μL）

2結(jié)　果

2.1擴增條件的初步優(yōu)化

采用3個擴增條件分別進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳檢測后的結(jié)果如圖1所示，第1個擴增條件可擴增得到15個基因座完整的分型結(jié)果，第2個擴增條件未得到任何產(chǎn)物，第3個擴增條件獲得部分基因座分型結(jié)果。

因此，選擇第1個擴增程序作為起始研究的擴增條件，定義為標準程序。

2.2熱啟動酶用量的優(yōu)化

在標準擴增程序下，比較不同熱啟動酶量對擴增效果的影響，結(jié)果顯示，采用0.4μL熱啟動酶擴增產(chǎn)物峰高略高于0.1μL。兩個加量均能得到完整基因分型，未見等位基因丟失，未出現(xiàn)非特異擴增現(xiàn)象，為保證反應中酶量充足，后續(xù)實驗反應體系中均加入0.4 μL熱啟動酶。10μL標準反應體系為10×FastStart高保真反應緩沖液（含MgCl2）1μL，dNTP Mix（10mmol/L each）0.2μL，10×引物混合物1μL，熱啟動酶（5U/μL）0.4μL，模板（1ng/μL）9947A 1μL，水6.4μL。

2.3引物平衡性優(yōu)化

經(jīng)過多次平衡性調(diào)整實驗，15對引物復合擴增最終檢測結(jié)果：各基因座等位基因譜帶清晰，且各基因座間擴增產(chǎn)物峰高較為均衡，峰型對稱尖銳，無干擾峰，分型結(jié)果準確。各基因座引物終濃度配比見表4。

表4各基因座引物濃度

2.4快速復合PCR擴增程序的優(yōu)化

2.4.1循環(huán)次數(shù)

利用標準程序及10 μL標準體系對循環(huán)次數(shù)進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，循環(huán)次數(shù)從26至30均可得到完整的基因分型結(jié)果，產(chǎn)物信號強度隨著循環(huán)數(shù)的增加而增加。26、27個循環(huán)時產(chǎn)物峰較低，30個循環(huán)出現(xiàn)非特異峰，因而根據(jù)實驗結(jié)果選擇28或29作為PCR循環(huán)次數(shù)。

2.4.2變性時間

利用標準程序及10μL標準體系（28個循環(huán)）對循環(huán)中變性時間進行優(yōu)化，結(jié)果顯示，變性時間從5s延長至60s均可得到完整的基因分型結(jié)果，擴增產(chǎn)物峰高、等位基因均衡性均未見明顯變化，故選擇5s作為PCR擴增循環(huán)中的變性時間。

2.4.3退火時間

利用標準程序及10μL標準體系（28個循環(huán)）對循環(huán)中退火時間進行優(yōu)選，結(jié)果顯示，退火時間從10s至60s等位基因丟失逐漸減少，產(chǎn)物信號強度逐漸增大，退火30 s和60 s的擴增產(chǎn)物峰高和等位基因峰值均衡性相差無幾，故選擇30 s作為PCR擴增循環(huán)中的退火時間。

2.4.4延伸時間

利用標準程序及10μL標準體系（28個循環(huán)）對循環(huán)中延伸時間進行優(yōu)選，結(jié)果顯示，延伸時間從10 s到60 s，擴增產(chǎn)物峰高、基因座間等位基因峰值均衡性均未見明顯變化，未出現(xiàn)非特異性擴增，故選擇10s作為PCR擴增循環(huán)中的延伸時間。

2.4.5終延伸時間

利用標準程序及10μL標準體系（28個循環(huán)）對循環(huán)中延伸時間進行優(yōu)選，結(jié)果顯示，終延伸時間從1min到7min均未出現(xiàn)等位基因丟失，但終延伸1min 和3 min在D5S818基因座出現(xiàn)分叉峰（即加A不完全現(xiàn)象），5min和7min未見此現(xiàn)象且擴增產(chǎn)物峰高和等位基因峰值均衡性均有所提高，故選擇7min作為PCR擴增循環(huán)中的終延伸時間。

因此，最終確立快速PCR條件為95℃4 min；95℃5s，59℃30s，72℃10s，28或29個循環(huán)；72℃7min；25℃保溫。共需32min。

2.5 PCR緩沖液的選擇

將16種緩沖液及10×FastStart高保真反應緩沖液加入確立的10 μL快速PCR擴增體系，對比擴增效果，結(jié)果顯示，16種緩沖液效果均明顯低于10× FastStart高保真反應緩沖液，均未得到完整分型，出現(xiàn)等位基因丟失。因而，10μL快速反應體系應選擇10×FastStart高保真反應緩沖液作為PCR反應的緩沖液。

2.6反應體系的選擇

通過比較4個反應體系的擴增結(jié)果，發(fā)現(xiàn)10μL體系下可獲得15個基因座的完整STR分型，其他3個反應體系均出現(xiàn)不同程度的等位基因丟失和非特異性擴增現(xiàn)象，且擴增產(chǎn)物峰高較低，故選擇10 μL作為快速反應的終體積。

2.7 PCR添加劑的優(yōu)選

將二甲基亞砜、甘油、明膠、硫酸銨4種添加劑按不同體積，分別加入10μL體系中進行快速復合擴增，結(jié)果顯示，終濃度為5%甘油，0.01%、0.05%明膠以及5mmol/L硫酸銨均可獲得完整的STR分型，未出現(xiàn)等位基因丟失和非特異性擴增現(xiàn)象，等位基因均衡性較好。二甲基亞砜以及其他體積的甘油、硫酸銨擴增產(chǎn)物中均出現(xiàn)STR基因座丟失、等位基因均衡性較差等現(xiàn)象。因此，5%甘油，0.01%、0.05%明膠和5mmol/L硫酸銨可作為PCR擴增過程中擬加入的反應添加劑。

3討　論

本研究選取了14個常染體STR基因座和1個性別基因座，旨在構(gòu)建快速復合擴增體系。為實現(xiàn)15對引物復合擴增，設(shè)計所有引物的Tm值在（56±2）℃，引物長度間的差異在2~5個核苷酸。在通過實驗選定的標準擴增程序下，10 μL反應體系中加0.1 μL和0.4μL熱啟動酶均可得到15個基因座的完整分型，但后者的峰高明顯高于前者，考慮到實際樣本可能存在微量模板或模板質(zhì)量不高的情況，為保證酶量充足以提高分型成功率，故最終選擇0.4μL。

通常PCR反應體系中引物的終濃度為0.1～1μmol/L[7]，引物濃度過高可能導致非特異性擴增，增加引物二聚體的形成；引物濃度過低則產(chǎn)物量減少。引物濃度對PCR產(chǎn)物的檢測信號強度及特異性也將產(chǎn)生影響。不同熒光染料檢測靈敏度不同，引物標記效率也有差異；同時，復合擴增各基因座引物之間存在競爭關(guān)系，導致其擴增結(jié)果的峰高有較大差異。因此，為了獲得較均衡的信號強度，調(diào)整引物濃度是必需的，在保證擴增產(chǎn)物量的同時應盡可能降低引物濃度[8]。本研究中，經(jīng)過反復多次實驗，根據(jù)擴增產(chǎn)物峰高不斷調(diào)整各引物濃度與配比，最終實現(xiàn)15個基因座同時擴增且各基因座等位基因間達到均衡。

在PCR循環(huán)中，延伸階段的持續(xù)時間主要取決于DNA聚合酶的延伸速率，采用高延伸活性和延伸速率的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，無疑會縮短整個PCR反應時間[9]。本研究采用Roche快速熱啟動酶，既可以耐受更高的變性溫度，也提高了延伸速度，首先初步篩選擴增條件，由于第2個條件為GlobalFilerTMExpress試劑盒提供，不適于Roche酶體系，故未得到任何產(chǎn)物，最終選擇第1個擴增條件。在此基礎(chǔ)上研究15重快速PCR，通過反復實驗確定了快速擴增中的各個參數(shù)，如變性、退火、延伸、終延伸時間、循環(huán)數(shù)等，使STR分型結(jié)果清晰準確，各基因座間峰高較為均衡，無等位基因丟失和非特異性擴增。

Mg2+在PCR反應中發(fā)揮重要作用，適當?shù)腗g2+濃度，擴增反應的效率和特異性最高，濃度過低會減少產(chǎn)物量，濃度較高時易引起非特異性擴增[10]。Taq酶最適pH值在7.4左右，略偏堿性，緩沖液pH值也會影響酶的活性，進而影響PCR擴增效率。本研究比較了17種不同pH不同Mg2+濃度的緩沖液對快速PCR反應的影響，通過評價能否得到15個STR位點的完整分型、等位基因峰高、基因座間平衡性及特異性等，最終選定FastStart高保真反應緩沖液。

PCR添加劑是PCR反應中的一種增效劑，能夠在一定程度上提高PCR反應特異性、增加PCR擴增產(chǎn)量、防止無效擴增等。本研究觀察了不同濃度的二甲基亞砜、甘油、明膠、硫酸銨4種添加劑加入快速PCR體系時對擴增效果的影響，最終確定終濃度為5%甘油，0.01%、0.05%明膠以及5 mmol/L硫酸銨可以作為改善PCR擴增效率和特異性的擬選添加劑。需要注意的是，添加劑的種類繁多，對快速PCR的改善效果也不盡相同，有研究顯示，甜菜堿可以提高PCR目的產(chǎn)物量，防止聚合酶變性[11]，氯化四甲銨能增加PCR反應效率和提高反應特異性[12]等，因此后續(xù)研究可以嘗試其他添加劑作為有效的補充方法。

綜上，本研究通過對快速復合擴增反應體系及擴增條件進行優(yōu)化，研究并建立了15重快速PCR體系，在較短時間內(nèi)，快速獲得特異性高，等位基因峰值均衡，STR分型準確的DNA結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，下一步將針對該體系的種屬特異性、檢測準確性、穩(wěn)定性、靈敏度及對混合樣本的分析能力等展開性能驗證，為最終形成穩(wěn)定的商品化產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

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（本文編輯：李成濤）

·綜述·

Construction of a 15-plex Rapid STR Multiplex Amplification System

HAN Jun-ping1, SUN Jing2,3, OU Yuan2,3, LIU Peng4, YE Jian2,3, ZHAO Wen-wen2,3, WANG Xue-qian2,3, ZHANG Yi-wen2,3, LIU Yao2,3, LI Cai-xia2,3

（1. School of Criminal Science and Technology, Chinese People’s Public Security University, Beijing 100038, China; 2. Beijing Engineering Research Center of Crime Scene Evidence Examination, Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China; 3. Key Laboratory of Forensic Genetics, Institute of Forensic Science, Ministry of Public Security, Beijing 100038, China; 4. Medical System Biology Research Center, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, China）

Abstract：Objective To establish a 15-plex rapid STR multiplex amplification system. Methods Fourteen auto-chromosome loci and one sex-chromosome were selected to compare the situations of allelic losses and nonspecific amplication under different conditions. FastStart Taq DNA polymerase and DNA standard sample 9947A were used during amplification and optimization process.15-plex rapid STR amplification system was achieved by performing various experiments including selection of amplification conditions and the volume of DNA polymerase, adjustment of inter-locus balance, optimization of rapid amplification, screening of reaction buffers, selection of reaction volume, and a variety of additives. Results Using 10μL rapid PCR system, including 1ng DNA templates, 0.4μL polymerase and 10×FastStart high fidelity reaction buffer, a complete and well-balance DNA profile of 15 STR loci for standard genomic DNA was obtained in 32 minutes, without the allele drop-out and non-specific amplicons. Meanwhile, 5% glycerinum, 0.01% gelatin, 0.05% gelatin and 5mmol/L ammonium sulfate could be used as the reactive additive during the amplification procedure. Conclusion The 15-plex rapid STR multiplex amplification system can be used to decrease reaction time and enhance sample throughput.

Key words：forensic genetics; short tandem repeat; polymerase chain reaction; system establishment

收稿日期：（2015-02-09）

通信作者：劉耀，男，研究員，主要從事法醫(yī)毒物分析研究；E-mail：liuyaol123@yahoo.cn 李彩霞，女，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學研究及鑒定；E-mail：licaixia@tsinghua.org.cn

作者簡介：韓俊萍（1986—），女，博士研究生，主要從事法醫(yī)遺傳學研究；E-mail：pgww19861025@163.com

基金項目：中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金計劃（2012JB012）；公安部技術(shù)研究計劃（2014JSYJA011）

文章編號：1004-5619（2016）01-0049-05

中圖分類號：DF795.2

文獻標志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.01.011