陳德西，何忠全，向運(yùn)佳，胡榮平

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

大蒜葉凝集素基因ASAL的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

陳德西，何忠全*，向運(yùn)佳，胡榮平

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066)

大蒜葉凝集素基因(Alliumsativumleaf agglutinin,ASAL)是一種高活性的凝集素基因，且具顯著的抗蟲性?？寺〈笏釧SAL基因?qū)槠湓谵D(zhuǎn)基因作物中抗蟲特性研究奠定基礎(chǔ)。本文以GenBank 公布的ASAL基因序列設(shè)計(jì)特異引物，采用 RT-PCR 法從當(dāng)?shù)卮笏馄贩N二水早和新都軟葉的幼苗中克隆ASAL基因。結(jié)果表明，克隆的兩個(gè)ASAL基因與已知基因的堿基序列相似性分別為98.7 % 和98.9 %，氨基酸序列相似性為98.3 %。將其亞克隆至表達(dá)載體中，經(jīng)菌落 PCR 和酶切鑒定，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒。將該載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA5ɑ進(jìn)行保存。

ASAL基因；刺吸式害蟲；基因克??；表達(dá)載體；構(gòu)建

植物凝集素是來(lái)源于植物的一類能凝集細(xì)胞和沉淀單糖或多糖復(fù)合物的非免疫來(lái)源的非酶蛋白質(zhì)。其研究始1888年，距今已有120多年的歷史。1982年Hoffman等[1]克隆出了第一個(gè)凝集素基因?yàn)椴硕鼓鼗?pha)，目前已經(jīng)分離出多種如豌豆凝集素 (Pea lectin,PL)、雪花蓮凝集素 (Galanthus nivalis agglutinin,GNA)、麥胚凝集素 (Wheat germ agglutinin,WGA)、半夏凝集素 (Pinellia ternata agglutinin，PTA) 等植物外源凝集素基因[2]。由于植物凝集素對(duì)于單糖或糖復(fù)合物特異性結(jié)合的能力，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、植物防御等諸多信號(hào)過(guò)程中均具有重要作用；同時(shí)也具有細(xì)胞凝集、抗病毒、抗真菌及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬等多種能力，因此在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)等諸多方面有較好的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。其中在害蟲防治方面，植物凝集素具有對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目特別是對(duì)同翅目蚜蟲、飛虱、葉蟬等刺吸式口器害蟲及一些微生物有防效[3-7]，同時(shí)具有對(duì)環(huán)境無(wú)污染，穩(wěn)定性好及對(duì)高等動(dòng)物相對(duì)安全等優(yōu)點(diǎn)，因此，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用植物凝集素基因來(lái)防治病害獲得抗性品種已成為研究熱點(diǎn)。成功用于植物抗病蟲害基因工程的植物凝集素基因有雪花蓮凝集素基因、豌豆凝集素基因、麥胚凝集素基因、大蒜葉片凝集素基因等，這些大都為單子葉甘露糖結(jié)合凝集素。其中雪花蓮?fù)庠茨?、豌豆外源凝集素和大蒜葉片凝集素(ASAL)對(duì)哺乳動(dòng)物的毒性低，對(duì)害蟲卻有極強(qiáng)的抑制作用而倍受青睞。到目前為止，油菜、番茄、水稻、甘蔗、甘薯、向日葵、煙草、馬鈴薯、大豆和葡萄等多種植物獲得了轉(zhuǎn)GNA基因抗蟲植株，均表現(xiàn)出一定的抗蟲性，該基因在后代中能穩(wěn)定遺傳，符合孟德爾遺傳規(guī)律。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)ASAL在濃度比GNA低100～400倍時(shí)，即0.0025 %(w/v)，即可影響刺吸式口器昆蟲的生長(zhǎng)和繁殖能力[8]。ASAL對(duì)褐飛虱和大葉青蟬致死率高于GNA，在轉(zhuǎn)基因水稻中與對(duì)照相比死亡率分別高達(dá)83 %和84 %；GNA對(duì)白背飛虱更有效果，致死率達(dá)90 %[9-11]。

ASAL基因是來(lái)自大蒜葉片的一種植物凝集素基因，其包含546 bp 開放閱讀框，編碼110個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為25 kDa，序列與GNA高度相似。ASAL只是中等豐度的蛋白，但通過(guò)凝集素與兔血清分析實(shí)驗(yàn)表明，ASAL活性比來(lái)自大蒜球莖的凝集素ASAI高50倍。大蒜凝集素(ASAL)對(duì)人體腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的毒害作用，能強(qiáng)烈抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和DNA合成，并誘發(fā)其凋亡，增強(qiáng)人體自身免疫功能。ASAL通過(guò)獨(dú)特的結(jié)合昆蟲上皮細(xì)胞，抑制昆蟲中腸營(yíng)養(yǎng)的攝取，其上的受體細(xì)胞也被鑒定出。ASAL凝集素這種受體-配體能力與殺蟲劑的特征相關(guān)，在昆蟲的內(nèi)臟也十分穩(wěn)定。ASAL基因在CaMV35S啟動(dòng)下表達(dá)的煙草中，檢測(cè)有2 %總?cè)芙獾鞍祝D(zhuǎn)基因煙草減少蚜蟲的存活和育性分別為17 %和34 %[12]大大高于轉(zhuǎn)GNA煙草[13]；同樣，芥菜蚜蟲吃食了轉(zhuǎn)ASAL基因的芥菜植株，死亡率達(dá)到89 %，育性減少60 %～64 %[14]；轉(zhuǎn)ASAL基因的水稻使褐飛虱(BPH)死亡率達(dá)到36 %和綠葉蟬(GLH)死亡率達(dá)到32 %，褐飛虱和綠葉蟬育性分別減少59.5 % 和70.5 %，比轉(zhuǎn)GNA的植株BPH 和 GLH 存活率降低近10 %[15]。

目前，我國(guó)轉(zhuǎn)ASAL基因作物報(bào)道十分少見，本項(xiàng)目通過(guò)克隆并構(gòu)建該基因的合適的表達(dá)載體，以便該基因在轉(zhuǎn)基因作物中廣泛應(yīng)用，提高植物的抗蟲性和減少病毒對(duì)作物的危害，減少農(nóng)藥的施用量、保護(hù)有益昆蟲、減輕對(duì)環(huán)境的污染。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大蒜品種為二水早、新都軟葉。克隆載體pMD 20-T購(gòu)自寶生物；大腸桿菌DH 5a、根癌農(nóng)桿菌EHA105和植物表達(dá)載體Pzh01為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、Taq酶購(gòu)自TaKaRa公司；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司,其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 蒜苗長(zhǎng)至3葉1心時(shí)，取干凈的葉片用鋁箔包好，液氮速凍，放-80 ℃保存。大蒜總RNA的提取采用TRIzol試劑進(jìn)行植物總RNA提取，按試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。利用寶生物公司的Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成cDNA第一鏈。

1.2.2ASAL基因克隆 根據(jù)已知大蒜的cDNA克隆 (Smeets et al. 1997a[16]，登陸號(hào)：No. AY866499)設(shè)計(jì)引物。上游引物為BamHI-d:5′GGATTCATGG GTCCTACTACTTCATCTCCT3′下游引物EcoRI-d:5′GAATTCTCAAGCAG CACCGGTGCCAACCTT 3′和SacI-d:5′ GAGCTCTCAAGCAGCA CCGGTGCCAACCTT 3′，分別加酶切位點(diǎn)為BamH I、EcoR I和SacI。引物由上海捷瑞生物有限公司合成。先進(jìn)行大蒜ASAL基因的CDNA合成，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行。隨后進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系為： cDNA 2μl，dNTP Mixture 各2.5 mM，正反引物10 μΜ各1μl溶液10×LA PCR Buffer II(Mg2+)5 μl，TaKaRa LATaq(5 U/μl)0.5 μl，用去離子水補(bǔ)足50 μl。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃變性5 min，94 ℃變性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

1.2.3 凝集素基因的克隆及鑒定 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后，并按DNA凝膠回收試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit回收純化，與pMD20-T載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)DH5a中，挑取單菌落，在含有X-Gal、IPTG、Amp的瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。用載體引物做菌落PCR檢測(cè)，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送至上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用DNAMAN軟件，對(duì)所克隆的基因序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。

1.2.5 植物表達(dá)載體pzH01-ASAL的構(gòu)建 以測(cè)序后的pMD20-T重組質(zhì)粒和pZH01載體為模板，用EcoR I進(jìn)行單酶切，利用產(chǎn)物純化試劑盒純化后再用BamH I再次進(jìn)行酶切，電泳后切膠，用膠回收試劑盒回收ASAL基因片段和pZH01載體片段。

將以上2種處理好的回收產(chǎn)物在T4連接酶作用下進(jìn)行連接并用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后用40 mg/L卡那霉素的LB平板培養(yǎng)篩選單菌落。挑選轉(zhuǎn)化后形成的單菌落，用小量提取試劑盒小量提取質(zhì)粒，用酶切和PCR檢測(cè)，得到陽(yáng)性克隆。并將最終獲得的ASAL基因的重組子命名為pzH01-ASAL。通過(guò)熱激法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA5ɑ中。

M為DL2000；1和2為大蒜總RNA M:Marker DL2000;1,2:Toltal RNA of garlic leaf圖1 大蒜總RNA Fig.1 Total RNA of garlic leaves

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)

提取總RNA之后，經(jīng)分光光度計(jì)和凝膠電泳分析，總RNA電泳檢測(cè)(圖1)所示，從圖1可以看出，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，總RNA純度較高而且沒有發(fā)生嚴(yán)重降解。可用于RT-PCR實(shí)驗(yàn)。根據(jù)大蒜ASAL cDNA序列合成的引物PCR反應(yīng)后得到一段長(zhǎng)約560 bp的DNA片段，如圖2所示。

2.2 目的基因片段的克隆與測(cè)序

RT-PCR產(chǎn)物切膠回收后，將目的片段連接到PMDTM-20載體上，以重組質(zhì)粒為模板，以特異性序列為引物經(jīng)PCR擴(kuò)增可得一條長(zhǎng)約560 bp的片段，表明PMD-ASAL中有完整的ASAL片段。經(jīng)過(guò)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其與Genebank中報(bào)道的大蒜ASAL基因比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)二水早和新都軟葉的堿基序列同源性達(dá)到99.8 %，而與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提交的ASAL堿基序列的相似性分別為98.7 % 和98.9 %(圖3)，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明二水早和新都軟葉的氨基酸相似性達(dá)到100 %，與已知ASAL氨基酸的相似性達(dá)到98.3 %，主要的不同體現(xiàn)在第33位的氨基酸由已知的纈氨酸變?yōu)榱涟彼?，?68位的賴氨酸變?yōu)樘於０罚?69位的天冬氨酸變?yōu)槔i氨酸?；虻腸DNA序列同源性為98.64 %(圖4)。

M為DL2000；1,5為RT-PCR擴(kuò)增的片段M：DL2000;1,5:The amplified RT-PCR fragments圖2 RT-PCR 的ASAL產(chǎn)物Fig.2 RT-PCR product of ASAL by agarose gel electrophoresis

圖3 已知ASAL基因序列與大蒜二水早和新都軟葉的ASAL DNA序列比對(duì)Fig.3 Known ASAL gene DNA sequence alignment with the ASAL gene from the Ershuizao and Xindu soft leaf

圖4 已知ASAL蛋白與大蒜二水早和新都軟葉的ASAL氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Comparison of the known amino acid sequences with the cloned ASAL sequences from the Ershuizao and Xindu soft leaf

2.3 構(gòu)建植物表達(dá)載體pzH01-ASAL

選擇常用的植物表達(dá)載體pzH01，首先用EcoR I和BamH I切除其GUS基因(圖5)，然后用已獲得的ASAL基因的cDNA片段進(jìn)行替換，最終構(gòu)建出一個(gè)以CaMV35S啟動(dòng)子調(diào)控的ASAL基因的植物表達(dá)載體pzH01-ASAL(圖6)，酶切鑒定。

3 討 論

害蟲是造成農(nóng)林業(yè)減產(chǎn)的重要因素之一，過(guò)多的噴施化學(xué)農(nóng)藥不僅會(huì)造成環(huán)境污染，且害蟲及容易產(chǎn)生抗性。生物殺蟲劑成本較高，見效慢。轉(zhuǎn)基因抗病蟲作物的出現(xiàn)為人們防治植物病蟲害開拓了新的思路。植物凝集素對(duì)鱗翅目特別是同翅目蚜蟲、飛虱、葉蟬等刺吸式口器害蟲及一些微生物有明顯的致死作用，減少蟲傳病毒且具有對(duì)環(huán)境無(wú)污染、穩(wěn)定性好及對(duì)高等動(dòng)物相對(duì)安全等優(yōu)點(diǎn)，成為目前的重要研究對(duì)象。

大蒜RNA的提取較水稻和玉米等禾本科植物的提取棘手，因?yàn)槔锩婧写罅康牡鞍缀投嗵牵~片細(xì)胞破粹后，多糖會(huì)與RNA提取時(shí)所用變性劑形成難溶的膠狀物與RNA共沉淀，而且多糖會(huì)抑制許多酶的活性，不利于后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。我們?cè)囘^(guò)的幾種試劑盒包括Total RNA提取試劑(TaKaRa RNAiso Reagent)、BIOROL Reagent和TRIZOL Reagent, 效果都不理想，都存在沉降過(guò)程中有難溶的膠狀物與RNA共沉淀。后來(lái)針對(duì)TotalRNA提取試劑配合使用去除多糖的RNAiso PLUS，仍然有難溶的膠狀物與RNA共沉淀。利用TRIZOL Reagent提取3葉1心的大蒜葉片并改進(jìn)了沉降方法，即加糖原后由異丙醇和RNA沉降劑沉降，提取效果大為改觀，質(zhì)量才能滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)。因此在大蒜葉片RNA提取應(yīng)該采用幼嫩葉片和合適的RNA沉降方法，才能獲得好的提取效果。

M為DL2000;1為未切的質(zhì)粒;2～9為已切開的質(zhì)粒M:Maker DL2000;1 was not digested by enzyme;2-9 were the digested plasmids 圖5 載體PZH01被BamH I和EcoR I雙切Fig.5 Vector PZH01 was digested by enzyme BamH I and EcoR I

圖6 pzH01-ASAL的表達(dá)載體圖譜Fig.6 Expression vector map of pzH01-ASAL

在大蒜ASAL基因的克隆過(guò)程中，筆者至少設(shè)計(jì)了8對(duì)引物，多數(shù)擴(kuò)增的效果不理想，為多條帶。后來(lái)通過(guò)加酶切位點(diǎn)，PCR的擴(kuò)增效果才得以改善。本研究構(gòu)建了含ASAL基因的植物表達(dá)載體Pzh01-ASAL，其含有 CaMV35S 啟動(dòng)子、ASAL基因、終止子表達(dá)單元和一個(gè) CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的HPT篩選基因。近年來(lái)，許多凝集素基因的成功克隆及成功轉(zhuǎn)至水稻，小麥，玉米等作物中，培育出了新的抗蟲植株，突顯了凝集素蛋白在作物育種方面重要的應(yīng)用價(jià)值[16]。本研究對(duì)我國(guó)大蒜本土品種的大蒜凝集素基因進(jìn)行克隆，并構(gòu)建了其植物表達(dá)載體，為深入研究大蒜葉凝集素的功能和進(jìn)一步進(jìn)行抗蟲基因轉(zhuǎn)化奠定了定了基礎(chǔ)。

[1]Hoffman L M, Ma Y, Barker R F. Molecular cloning of Phaseolus vulgaris lectin mRNA and use of cDNA as a probe to estimate lectin transcript levels in various tissues[J]. Nucleic Acids Res., 1982,10(23):7819-7828.

[2]馬員春, 馬維亮, 宋曉華. 植物凝集素在作物轉(zhuǎn)基因中的利用現(xiàn)狀[J]. 寧夏農(nóng)林科技, 2010(3):60-62.

[3]Schuler T H, Poppy G M, Kerry B R, et al. Insect resistant transgenic plants[J]. Trends Biotechnol, 1998,16:168-174.

[4]Nagadhara D, Ramesh S, Pasalu I C, et al. Transgenic indica rice resistant to sap sucking insects[J]. Plant Biotechnol J, 2003(1):231-240.

[5]Nagadhara D, Ramesh S, Pasalu I C, et al. Transgenic rice expressing the snowdrop lectin gene (gna) exhibit high-level resistance to the whitebacked planthopper (Sogatellafurcifera)[J]. Theor Appl Genet, 2004,109:1399-1405.

[6]Majumder P, Banerjee S, Das S. Identification of receptors responsible for binding of the mannose specific lectin to the gut epithelial membrane of the target insects[J]. Glycoconj J, 2004,20:525-530.

[7]Sadeghi A, Smagghe G, Broeders S, et al. Ectopically expressed leaf and bulb lectins from garlic (AlliumsativumL.) protect transgenic tobacco plants against cotton leafworm (Spodopteralittoralis)[J]. Transgenic Res, 2008,17:9-18.

[8]Saha P, Majumder P, Dutta I, et al. Transgenic rice expressing Allium sativum leaf lectin with enhanced resistance against sap-sucking insect pests[J]. Planta, 2006, 223:1329-1343.

[9]Yarasi1 B, Sadumpati V, Immanni C P. Dasavantha reddy vudem1 and venkateswara rao khareedu, transgenic rice expressingAlliumsativumleaf agglutinin (ASAL) exhibits high-level resistance against major sap-sucking pests[J]. BMC Plant Biol, 2008,102:1470-1483.

[10]Nagadhara D, Ramesh S, Pasalu I C, et al. Transgenic indica rice resistant to sap sucking insects[J]. Plant Biotechnol J, 2003(1):231-240.

[11]Nagadhara D, Ramesh S, Pasalu I C, et al. Transgenic rice plants expressing the snowdrop lectin gene (gna) exhibit high-level resistance to the white backed planthopper (Sogatellafurcifera)[J]. Theor Appl Genet, 2004,109:1399-1405.

[12]Dutta I, Saha P, Majumder P, et al.The efficacy of a novel insecticidal protein, Allium sativum leaf lectin (ASAL), against homopteran insects monitored in transgenic tobacco[J]. Plant Biology, 2005(3):601-611.

[13]Hilder V A, Powell K S, Gatehuse A M R. Expression of snowdrop lectin in transgenic tobacco plants results in added protectin againstaphids[J]. Transgenic Research, 1995,4(1):18-25.

[14]Dutta I, Majumder P, Saha P, et al. Constitutive and phloem specific expression ofAlliumsativumleaf lectin(ASAL) to engineer aphid (Lipaphiserysimi) resistance in transgenic Indian mustard (Brassiajuncea)[J]. Plant Science, 2005(6):996-1007.

[15]Yarasi B,Sadumpati V,Immanni C P,et al. Transgenic rice expressingAlliumsativumleaf agglutinin(ASAL) exhibits high-level resistance against major sap-sucking pests[J]. BMC Plant Biol., 2008,102:1470-83.

[16]Smeets K, Van Damme E J, Van Leuven F, et al. Isolation, characterization and molecular cloning of a leaf-specific lectin from ramsons (AlliumursinumL.)[J]. Plant Mol. Biol., 1997,35:531-535.

(責(zé)任編輯 陳 虹)

Cloning ofASALGene and Construction of Its Plant Expression Vector

CHEN De-xi, HE Zhong-quan*, XIANG Yun-jia, HU Rong-ping

(Institute of Plant Proteciton, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southwest,Minsitry of Agriculture,Sichuan Chengdu 610066,China)

ASALgene was a highly active gene in many plants and had high insect resistance. CloningASALgene isolated from garlic would lay the foundation for transgenic crops characteristic research in insect resistance. In this paper, a pair of specific primers was designed according to the sequence ofASALgene in GenBank, and using the total RNA of garlic seedlings of the local varieties Eershuizao and Xindu soft leaves as the templates, the complete cDNA sequences by RT-PCR were obtained. The results showed that the recombinant plasmids containingASALgene from Eershuizao and Xindu were similar to reach 98.7 % and 98.9 % respectively withASALgene in GenBank and the amino acid sequences were similar to reach 98.3 % .The recombinant plasmids were successfully constructed by PCR amplification and digestion with restriction endonucleases. The vectors were transformed into theAgrobactriumtumefaciensEHA5ɑ for preservation．

ASALgene; Sucking pest; Gene cloning；Plant expression vector; Construction

1001-4829(2016)10-2445-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.036

2015-09-15

國(guó)家科技支撐計(jì)劃西南稻區(qū)水稻重大病蟲防控技術(shù)研究與集成示范(2012BAD19B03-09)；四川省財(cái)政基因工程優(yōu)秀論文基金項(xiàng)目(2011LWJJ-005)

陳德西(1977-)，女，四川大竹人，副研究員，主要從事植物分子病理研究，*為通訊作者,E-mail:zhquhe6868@sina.com。

S633.4

A