黃惠芳，王麗萍，黃秋偉，檀小輝，曾黎明

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

超聲提取廣西白木香葉黃酮的工藝研究

黃惠芳，王麗萍，黃秋偉，檀小輝，曾黎明

(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

探討白木香葉中黃酮的提取工藝，以廣西白木香葉為原料，通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究不同提取時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度以及料液比對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響，并采用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲提取白木香葉黃酮的工藝條件參數(shù)。結(jié)果表明，超聲提取白木香葉黃酮的最佳工藝條件為提取時(shí)間25 min 、超聲功率250 W、乙醇濃度80 %、料液比1∶40，在此條件下提取率為6.3096 %；超聲提取工藝優(yōu)于常規(guī)提取工藝。

超聲提??；白木香葉；黃酮

白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Spreng)] 是沉香屬瑞香科的植物，別稱沉香、土沉香、牙香樹(shù)等，是中國(guó)珍貴藥用植物，分布在我國(guó)海南、廣東、廣西、云南、福建等地區(qū)。白木香生長(zhǎng)過(guò)程中受外界刺激會(huì)局部形成含黑色樹(shù)脂的樹(shù)材，可以入藥，是國(guó)產(chǎn)中藥沉香的唯一資源[1-2]。白木香葉為沉香的非藥用部分，白木香葉醇提取物具有鎮(zhèn)痛、抗炎、平喘、促進(jìn)小腸運(yùn)動(dòng)、瀉下、止血、抗腦缺血缺氧、降血糖、抗腫瘤等活性[3-5]；同時(shí)，白木香葉茶具有理胃氣、潤(rùn)腸通便、安神助眠、益氣益精等保健功效[6]。廣西是白木香的重要產(chǎn)區(qū)，白木香的生理生化特性會(huì)因地區(qū)有差異，這種差異不僅表現(xiàn)在沉香的品質(zhì)上，白木香葉中的活性成分含量也會(huì)因地理區(qū)域、氣候土質(zhì)條件而表現(xiàn)出差異。白木香葉黃酮超聲提取工藝研究未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道，對(duì)廣西白木香葉黃酮的研究亦未見(jiàn)有研究報(bào)道。

植物中黃酮的提取方法常用的有回流加熱提取法、常規(guī)溶劑浸提法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法等。超聲提取在中草藥有效成分提取工藝中具有提取率高、提取時(shí)間短和低溫提取有利于保護(hù)有效成分等簡(jiǎn)單高效的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用[7-9]，采用單因素實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)研究超聲提取廣西白木香葉黃酮的最佳工藝，并采用AlC13比色法測(cè)定廣西白木香葉中黃酮含量，為白木香葉開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白木香葉采自廣西靈山縣武利鎮(zhèn)沉香種植基地。白木香葉于50 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥，粉碎，過(guò)40目篩，得白木香葉干粉，用于提取白木香葉黃酮。乙醇、氯化鋁、乙酸鈉采用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭J?。荷虾＞G葉生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)KBS-250(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)，電子天平GR200(日本A&D有限公司)，F(xiàn)Z102微型植物粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；低速冷凍離心機(jī)DL-6000B(上海安亭科學(xué)儀器廠)，Lambda35紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)PerkinElmer公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 白木香葉黃酮提取方法 取粉碎后的沉香葉干粉，放進(jìn)50 mL圓底玻璃離心管中，加入提取溶劑，置于超聲波粉碎儀中，離心管下部套入冷水浴中，設(shè)定超聲工作模式為超聲5 s，間歇5 s，設(shè)定超聲工作時(shí)間及超聲功率，超聲結(jié)束后取出冷水冷卻，6000 r/min冷凍離心20 min。取上清液，用60 %乙醇稀釋至適當(dāng)濃度，于420 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸收度，計(jì)算黃酮含量。

1.3.2 沉香葉黃酮的測(cè)定 采用AlC13比色法測(cè)定黃酮，黃酮類化合物的甲醇(或乙醇)溶液中加入三氯化鋁試劑時(shí)，能使黃酮的酚羥基離解或形成絡(luò)合物，導(dǎo)致光譜發(fā)生變化[10-11]。沉香葉中黃酮主要包括洋芹素-7，4，-二甲醚、木犀草素-7，3，4-三甲醚、 木犀草素-7，4，-二甲醚、芫花素、木犀草素、羥基芫花素等[5,12]，具有4-羰基和5-羥基結(jié)構(gòu)，因此，本研究采用丁明玉等[13]的AlC13比色法分析白木香葉黃酮含量。取1 mL樣品溶液于10 mL容量瓶中，加2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和 3 mL 1 mol/L NaAc溶液，用 60 %乙醇定容至刻度，空白對(duì)照中加入同樣體積的反應(yīng)液，不足部分以60 %乙醇補(bǔ)足，搖勻后于室溫下反應(yīng)20 min，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在420 nm 處測(cè)定吸收度，通過(guò)回歸方程計(jì)算樣品中黃酮含量，從而計(jì)算出樣品中黃酮百分含量，計(jì)算公式如下：

式中，C：提取液中黃酮含量(mg)，V1：總樣品體積(mL)，W：樣品重量(g)，V2：測(cè)定樣品體積(mL)，N：稀釋倍數(shù)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 20 mg，置 100 mL容量瓶中，用60 %乙醇定容至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 mL 分別置 10 mL容量瓶中，分別加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和 3 mL 1mol/L NaAc溶液，用 60 %乙醇稀釋至刻度，空白對(duì)照加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液、3 mL 1mol/L NaAc溶液和60 %乙醇5 mL，在室溫下反應(yīng)20 min，于420 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度(OD420)。

1.3.4 乙醇濃度對(duì)白木香葉提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1.0 g粉碎后的白木香葉干粉，放進(jìn)50 mL圓底玻璃離心管中，加入不同濃度乙醇30 mL，試驗(yàn)不同乙醇濃度對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響，乙醇濃度為50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %，超聲提取15 min，超聲功率250 W。冷凍離心后取上清液測(cè)定OD420，計(jì)算樣品中黃酮含量。

1.3.5 提取時(shí)間對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1.0 g粉碎后的白木香葉干粉，放進(jìn)50 mL圓底玻璃離心管中，加入80 %乙醇30 mL，試驗(yàn)不同超聲提取時(shí)間對(duì)沉香葉黃酮提取率的影響，超聲提取時(shí)間分別為5、10、15、20和25 min，超聲功率250 W。冷凍離心后取上清液測(cè)定OD420，計(jì)算樣品中黃酮含量。

1.3.6 超聲功率對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1.0 g粉碎后的白木香葉干粉，放進(jìn)50 mL圓底玻璃離心管中，加入80 %乙醇30 mL，超聲提取15 min，試驗(yàn)不同超聲提取功率對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響，超聲功率分別為50、100、150、200和250 W。冷凍離心后取上清液測(cè)定OD420，計(jì)算樣品黃酮含量。

1.3.7 料液比對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響 準(zhǔn)確稱取1.0 g粉碎后的白木香葉干粉，放進(jìn)50 mL圓底玻璃離心管中，加入不同倍數(shù)的80 %乙醇，試驗(yàn)不同倍數(shù)溶劑對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響，80 %乙醇用量分別為20、25、30、35和40倍。超聲提取15 min，冷凍離心后取上清液測(cè)定OD420，通過(guò)回歸方程計(jì)算樣品中黃酮含量。

1.3.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、超聲功率(C)以及溶劑倍數(shù)(D)進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，因素水平設(shè)定如表1所示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、制圖，采用正交試驗(yàn)助手對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀分析及正交試驗(yàn)方差分析，同時(shí)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(Duncan’s新復(fù)極差法)。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

以O(shè)D420為橫坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)作圖，得回歸方程為：y=0.3304x+0.0084，R2=0.9991。

2.2 超聲提取時(shí)間對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響

超聲提取時(shí)間在5～25 min時(shí)，白木香葉黃酮提取率逐漸增大，5～10 min增幅十分明顯，提取時(shí)間增加到30 min時(shí)，提取率有所下降(圖1)。這是由于提取剛開(kāi)始時(shí)，超聲波對(duì)細(xì)胞壁的破碎不充分，細(xì)胞內(nèi)黃酮沒(méi)有充分溶解在溶液中，提取時(shí)間達(dá)到10 min后，細(xì)胞中的黃酮基本解離出來(lái)。進(jìn)一步延長(zhǎng)超聲提取時(shí)間，黃酮提取率增加幅度逐漸趨于穩(wěn)定，至30 min時(shí)提取率略有降低，可能是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致溶出的有效成分被分解所致。在實(shí)際生產(chǎn)中，增加超聲提取時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)生產(chǎn)周期，增加生產(chǎn)能源消耗，提高生產(chǎn)成本，還可能引起活性成分被氧化分解，從而導(dǎo)致提取率降低、產(chǎn)品收率降低，最終降低產(chǎn)品品質(zhì)。

2.3 乙醇濃度對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響

在乙醇濃度為50 %～80 %時(shí)，隨著乙醇濃度提高，白木香葉黃酮提取率逐漸提高，超過(guò)80 %，進(jìn)一步提高乙醇濃度，黃酮提取率下降(圖2)。這是因?yàn)榇?水濃度變化會(huì)引起溶劑極性的變化，從而導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)的溶解率也發(fā)生變化，且過(guò)高乙醇濃度容易引起蛋白質(zhì)凝聚作用，滯留在顆粒內(nèi)部孔道中，使組織的微孔堵塞，增加了黃酮類化合物擴(kuò)散的阻力，同時(shí)水分減少也削弱了對(duì)細(xì)胞的溶脹能力。因此乙醇濃度增加到一定程度，黃酮溶出率會(huì)反而減少，提取率降低。

圖1 超聲提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on extraction yield of flavonoids

2.4 超聲提取功率對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響

超聲功率在50～200 W時(shí)，白木香葉黃酮提取率也逐漸提高(圖3)。其原因在于超聲功率過(guò)低，細(xì)胞破碎率不足，黃酮溶出不充分，導(dǎo)致提取率偏低，而隨著超聲功率的提高，細(xì)胞破碎完全，黃酮已基本溶出，提取率趨于穩(wěn)定。

2.5 料液比對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響

當(dāng)提取溶劑在1∶20～1∶30倍時(shí)，隨著溶劑用量的增加，黃酮的提取率明顯增加(圖4)。這是因?yàn)槿軇┑挠昧吭酱?，黃酮溶解越充分，提取率就越高。當(dāng)提取溶劑為30倍之后提取率的增加速率趨于平緩。這是因?yàn)楫?dāng)溶劑的用量達(dá)到一定程度時(shí)，溶劑已將有效成分基本溶出，使得率趨于穩(wěn)定，即使增加溶劑用量，黃酮提取率也不會(huì)有明顯變化。同時(shí)，溶劑用量的增加，會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本增大，也會(huì)增加后續(xù)濃縮工藝的能耗成本。

圖2 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of flavonoids

圖3 超聲提取功率對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction power on extraction yield of flavonoids

圖4 料液比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of material to liquid on extraction yield of flavonoids

2.6 正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲提取工藝

為全面研究超聲提取白木香葉黃酮各因素對(duì)白木香葉黃酮提取率的的影響，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以確定白木香葉黃酮提取的最佳工藝條件。

由表2～3可以看出，在實(shí)驗(yàn)選定因素水平范圍內(nèi)，選擇的4個(gè)因素對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響程度由大到小依次為A乙醇濃度﹥C超聲功率﹥D料液比﹥B超聲時(shí)間，且4個(gè)因素對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響均不顯著(α=0.05)。由于A因素，均值K2>K1>K3；B因素，均值K3>K2>K1；C因素，均值K3>K2>K1；D因素，K3>K2>K1；所以得出超聲提取白木香葉黃酮的最佳工藝參數(shù)組合為A2B3C3D3，即乙醇濃度80 %，超聲提取時(shí)間25 min，超聲提取功率250 W，料液比1∶40。

2.7 驗(yàn)證及對(duì)比實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證工藝組合A2B3C3D3是否最佳，故確定乙醇濃度80 %，超聲提取時(shí)間25 min，超聲提取功率250 W，料液比1∶40，在此條件下對(duì)白木香葉黃酮進(jìn)行3次超聲萃取，提取率分別為6.3059 %、6.2894 %和6.3334 %，平均提取率為6.3096 %。此結(jié)果大于正交試驗(yàn)任意組提取率，說(shuō)明正交試驗(yàn)結(jié)果可靠，即工藝組合A2B3C3D3為最佳工藝條件。為了比較超聲提取工藝與常規(guī)提取工藝，采用以下兩種常規(guī)方式提白木香葉黃酮：①室溫下在白木香葉粉中加入40倍80 %乙醇浸提24 h，重復(fù)3次，黃酮提取率為(5.6508±0.0458) %；②在白木香葉粉中加入40倍80 %乙醇，在熱水浴中回流提取1.5 h,重復(fù)3次，黃酮提取率為(5.5003±0.0191) %。兩種常規(guī)工藝黃酮提取率均低于超聲提取白木香葉黃酮的提取率。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

表3 方差分析

3 討論與結(jié)論

本研究在超聲提取廣西白木香葉黃酮的單因素試驗(yàn)中：①試驗(yàn)選取超聲提取時(shí)間為5～30 min，在5～25 min時(shí)，沉香葉黃酮提取率逐漸增大，5～10min增幅十分明顯，提取時(shí)間增加到30 min時(shí)，提取率有所下降；②在乙醇濃度為50 %～80 %范圍內(nèi)，隨著乙醇濃度提高，沉香葉黃酮提取率逐漸提高，進(jìn)一步提高乙醇濃度，乙醇濃度在80 %～100 %范圍內(nèi)，黃酮提取率下降；③超聲提取功率在50～200W范圍，白木香葉黃酮提取率隨功率增加也逐漸提高，并趨于穩(wěn)定；④當(dāng)料液比為1∶20～1∶30倍時(shí)，隨著溶劑用量的增加，黃酮的提取率明顯增加，當(dāng)提取溶劑30倍之后提取率的增加速率趨于平緩。在正交試驗(yàn)中，在實(shí)驗(yàn)選定因素水平范圍內(nèi)，選擇的四個(gè)因素對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響程度由大到小依次為：乙醇濃度﹥超聲功率﹥料液比﹥超聲時(shí)間；且四個(gè)因素對(duì)白木香葉黃酮提取率的影響均不顯著。正交試驗(yàn)最佳工藝參數(shù)條件下(乙醇濃度80 %，超聲提取時(shí)間25 min，超聲提取功率250W，料液比1∶40)，超聲提取廣西白木香葉黃酮的平均提取率為6.3096 %，均高于兩種常規(guī)工藝黃酮提取率。

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(責(zé)任編輯 王冠玉)

Ultrasonic Extraction Technology of Flavonoids from Leaves ofAquilariasinensisin Guangxi

HUANG Hui-fang, WANG Li-ping, HUANG Qiu-wei, TAN Xiao-hui, ZENG Li-ming

(Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Guangxi Nanning 530001, China)

In order to study extraction technology of flavonoids from the leaves ofAquilariasinensis, the influence of different extraction time, ultrasonic power, concentrations of ethanol and material to liquid radio on flavonoids extraction yield was evaluated using single-factor experiment method with leaves ofAquilariasinensisin Guangxi as raw materials. Then the orthogonal experimental design was used to optimize ultrasonic extraction parameters. The results showed that the best conditions for ultrasonic extraction of flavonoids from the leaves ofAquilariasinensiswere as follows:extraction time of 25 min, ultrasonic power of 250W, ethanol concentration of 80 % and material to liquid ratio of 1∶40. The yield of flavonoids was 6.3096 % under the best conditions. The ultrasonic extraction process is superior to the conventional extraction.

Ultrasound extraction; Leaves ofAquilariasinensis；Flavonoids

1001-4829(2016)10-2366-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.021

2016-04-01

廣西亞熱帶作物研究所專項(xiàng)資金項(xiàng)目(桂熱研201304，桂熱研201408)

黃惠芳(1969-)，女，廣西博白人，研究員，主要從事天然產(chǎn)物研究， E-mail：hhuif@126.com。

S567.19

A