顏 謙，滕安平，李恩宏，楊 建，施文娟，黃先群*

(1.貴州省馬鈴薯研究所/貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，貴州 貴陽 550006；2.貴州省種子管理站，貴州 貴陽 550002)

貴州馬鈴薯推廣品種SSR分子標記及遺傳多樣性分析

顏 謙1，滕安平2，李恩宏2，楊 建1，施文娟2，黃先群1*

(1.貴州省馬鈴薯研究所/貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，貴州 貴陽 550006；2.貴州省種子管理站，貴州 貴陽 550002)

為了鑒定馬鈴薯品種的親緣關(guān)系，采用10對SSR分子標記引物，對19份貴州馬鈴薯生產(chǎn)品種進行SSR分子標記及遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：10對SSR引物中5對獲得60條清晰條帶，其中49條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為81.67﹪，平均每個引物的多態(tài)性條帶數(shù)為9.80條。19份馬鈴薯品種的遺傳相似性系數(shù)為0.43～1.00。經(jīng)聚類分析，在遺傳相似系數(shù)為0.56處全部參試材料聚在一起，在遺傳相似系數(shù)為0.63處可明顯聚為3個類群。第Ⅰ類群包括11份材料，第Ⅱ類群包括7份材料，第Ⅲ類群只有1個材料。在相似性系數(shù)0.65處，57.89 %的參加品種聚在一起，表明參試品種的遺傳背景較為狹窄。

馬鈴薯；品種；SSR標記；遺傳多樣性

馬鈴薯是貴州省的重要糧食、飼料、菜用和加工原料作物。貴州馬鈴薯種植面積和產(chǎn)量多年來居全國前列。近年來，隨著貴州省馬鈴薯育種進程加快，育成品種數(shù)量增加。優(yōu)良品種是作物高產(chǎn)的基礎(chǔ)，品種混雜和純度降低會明顯降低產(chǎn)量，影響產(chǎn)品質(zhì)量和商品價值，快速準確地鑒定品種和進行純度分析對于種子質(zhì)量標準化、品種審定、假種辨別和產(chǎn)權(quán)糾紛等具有重要意義。傳統(tǒng)的品種鑒定一般采用形態(tài)學(xué)標記方法，往往鑒定周期長，存在較大的誤差，一些性狀差異小的品種間鑒定困難。為了解各品種間的親緣關(guān)系和遺傳背景、規(guī)范馬鈴薯的分類管理、保證品種純度、保障馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的利益，有必要對馬鈴薯生產(chǎn)品種進行分子標記指紋圖譜分析，也為今后馬鈴薯品種選育的親本選擇、雜交組配、雜種優(yōu)勢預(yù)測提供分子水平的理論依據(jù)。

微衛(wèi)星(simple sequence repeat，SSR)標記具有共顯性，重復(fù)性好，多態(tài)性高，擴增結(jié)果穩(wěn)定，檢測手段簡便易行等特點，被廣泛應(yīng)用于馬鈴薯品種指紋圖譜構(gòu)建、遺傳關(guān)系分析、品種鑒定、多態(tài)性檢測等。目前，利用SSR標記對馬鈴薯品種和材料進行多態(tài)性鑒定和檢測的報道已有許多。在遺傳多樣性分析方面，Norero等[1]和Moisan-Thiery等[2]利用SSR引物分別區(qū)分36個和286個馬鈴薯品種；段艷鳳等[3]等利用10對SSR引物構(gòu)建中國2000-2007年審定的88個馬鈴薯品種的指紋圖譜并進行遺傳多樣性分析；李先平等[4-5]利用SSR引物分別鑒定30份和50份彩色馬鈴薯品種；唐銘霞等[6-7]利用SSR分子標記分別對42份和36份馬鈴薯品種多態(tài)性進行分析；甘曉燕等[8]利用SSR和SRAP 2種分子標記對寧夏地區(qū)47份主要馬鈴薯種質(zhì)材料進行遺傳多樣性分析；黃團等[9]利用10對SSR引物對紫色馬鈴薯品種黑美人60Co-γ射線輻射材料進行DNA檢測并獲得了多態(tài)性條帶。在馬鈴薯品種純度鑒定方面，謝春梅等[10]應(yīng)用9對SSR引物鑒定馬鈴薯雜交實生種子的純度；于卓等[11]利用SSR分子標記技術(shù)鑒定馬鈴薯F1雜種。上述研究表明，SSR分子標記已成為馬鈴薯遺傳多樣性分析和品種純度鑒定的常規(guī)技術(shù)和手段。因此，為了鑒定貴州省農(nóng)業(yè)委員會提供的20個馬鈴薯生產(chǎn)品種(系)之間的遺傳背景和親緣關(guān)系，本研究利用段艷鳳等[3]從138對SSR引物中篩選出的10對多態(tài)性高、條帶清晰的引物對參試材料進行遺傳多樣性分析，以期為馬鈴薯品種的開發(fā)與利用、種質(zhì)資源的管理、品種產(chǎn)權(quán)保護等方面提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2014年取分析樣本20個，每份2個種薯，發(fā)芽程度不一，最長的可達10～15 mm，有5個處理未發(fā)芽(表1)，有1個材料J20140807(為簡便僅以后面4位數(shù)代替，如J20140807簡稱為0807，下同)的2個種薯中僅1個萌發(fā)出芽。將所有未萌芽的種薯用10 mg/L濃度的GA3浸種10 min進行催芽。由于一些種薯的休眠期難以打破，催芽時間較長，種薯較長時間處于高溫高濕環(huán)境，個別種薯有腐爛現(xiàn)象，如0946 (洋人洋盤縣1，前為品種名稱，后為育種單位簡稱)未獲得植株不進行 DNA檢測結(jié)果。

表1 參試的馬鈴薯品種(系)名稱及種薯性狀

注：品種后括號為育種單位簡稱，金龍為貴州金龍馬鈴薯有限公司，威寧1為威寧縣南方馬鈴薯專業(yè)合作社，威寧2為威寧縣泰豐科技實業(yè)有限責(zé)任公司，盤縣1為盤縣四格坡上馬鈴薯專業(yè)合作社，盤縣2為盤縣農(nóng)科所；扶貧：貴州省扶貧開發(fā)技術(shù)指導(dǎo)中心，遵義為遵義縣華富農(nóng)業(yè)生物科技有限公司，思南為思南縣華豐果蔬專業(yè)合作社，安順為安順市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，水城為水城縣大山種業(yè)有限公司。

表2 試驗所用的SSR引物名稱和序列

1.2 播種

試驗于2014年10月中旬播種。將滅菌后的混合土壤裝盆浸潤，直接將發(fā)芽馬鈴薯塊莖種入土壤中，播種完畢后置于實驗室陽臺上自然條件下培養(yǎng)。每3～5 d澆水1次，待長出葉片后施以少量復(fù)合肥。

1.3 分子標記引物

試驗選用引物是段艷鳳等[3]在鑒定中國88個馬鈴薯審定品種時從138對SSR引物中篩選的10對多態(tài)性高、譜帶清晰的引物(表2)，引物由上海捷瑞公司合成。

1.4 DNA提取及檢測

參試品種播種后，由于栽種的種薯部分死亡，后來又補種。播種45 d后開始提取DNA。剪取苗期各參試品種幼嫩健壯葉片各約100 mg置于2 mL離心管中，直接加入液氮快速冷凍。采用快捷型植物基因組DNA提取系統(tǒng)(Tiangen公司生產(chǎn))提取馬鈴薯供試品種的基因組DNA，操作程序按說明書進行。用1.0 %瓊脂糖凝膠檢測其完整性。

1.5 SSR-PCR擴增

20 μl SSR-PCR反應(yīng)體系參見黃團等[12]的報道。SSR-PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸42 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用15 %的變性PAGE電泳進行檢測。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳所得的譜帶采用0/1系統(tǒng)記錄，有條帶記為1，無條帶記為0，得到原始矩陣。多態(tài)性位點百分p=(k/n)×100 %，式中，k為多態(tài)性位點條帶數(shù)，n為所測總條帶數(shù)。使用NTSYS-pc2.10e軟件計算試驗材料間的遺傳距離，并用軟件中Qualitative Date計算遺傳相似系數(shù)，非加權(quán)平均法(UPGMA)進行聚類分析，通過TreeP lot模塊構(gòu)建樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 參試品種的多態(tài)性

對19份馬鈴薯樣品進行PCR擴增，10對SSR引物中僅有5對獲得清晰可讀條帶(圖1)，分別是S170、S151、S184、S118、S25共獲得60條DNA條帶，其中49條為多樣性條帶，多態(tài)比率是81.67 %，平均每個引物的多態(tài)性條帶數(shù)為9.8條。

2.2 參試品種的遺傳相似性

從表3看出，19份馬鈴薯參試品種的遺傳相似系數(shù)為0.49～1.00。相似性系數(shù)≥0.90以上(含0.90)的品種：0602(黑美人金龍)與0603(黑美人威寧1)之間的遺傳相似系數(shù)為1.00，是參試材料中相似系數(shù)最大的組合；0611(費烏瑞它威寧1)與0613(費烏瑞它威寧1)之間、0803(黑美人思南)與0805(黑美人思南)之間的相似性系數(shù)均為0.94；0803(黑美人思南)與0602(黑美人金龍)、0603(黑美人威寧1)的相似性系數(shù)均為0.90；0807(費烏瑞它安順)與0611(費烏瑞它威寧1)、0613(費烏瑞它威寧1)的相似性系數(shù)分別為0.92和0.90；0909(費烏瑞它遵義)與0611(費烏瑞它威寧1)和0807(費烏瑞它安順)的相似性系數(shù)分別為0.90和0.98。表明，這些品種之間的遺傳背景差異小，親緣關(guān)系很近。

圖1 引物S170對19份參試馬鈴薯品種的擴增Fig.1 Amplified results of primer S170 to 19 test potato varieties

表3 19份馬鈴薯供試品種的遺傳相似性Table 3 Genetic similarity coefficients of 19 test potato varieties

有部分品種的相似性系數(shù)在0.50以下，如0928(威芋5號威寧2)與0909(費烏瑞它遵義)、0715(云師特遵義)的遺傳相似性分別為0.43和0.49；0702(青薯9號盤縣1)與0709(費烏瑞它扶貧)的相似性系數(shù)為0.49；0806(中薯3號安順)與0709(費烏瑞它扶貧)和0715(云師特遵義)的遺傳相似性分別為0.43和0.47。表明，這些品種的遺傳親緣關(guān)系較遠。

2.3 參試品種的遺傳聚類圖

從圖2可知，19份供試品種在遺傳相似系數(shù)為0.63處可明顯聚為3類。第Ⅰ類群包括11個品種，第Ⅱ類群包括7個品種，第Ⅲ類群只有1個品種。第Ⅰ類群在遺傳相似系數(shù)為0.78時可分為Ⅰ-A和Ⅰ-B﹑Ⅰ-C 3個亞簇。I-A亞簇包括3個子亞簇I-A-1、I-A-2、I-A-3，共7個品種。子亞簇I-A-1包含0601(青薯9號金龍)和0920(盤薯4號盤縣2)2個馬鈴薯品種。從種薯表型看，均是紅皮黃肉，圓形；0602(黑美人金龍)、0603(黑美人威寧1)、0803(黑美人思南)、0805(黑美人思南)子亞簇I-A-2包含4個馬鈴薯品種，這4個品種均為黑美人；從種薯表型看，均是紫皮紫肉，長形；子亞簇I-A-3只有0945(洋人洋盤縣)1個品種，紅皮白肉，長形。Ⅰ-B亞簇有3個品種0617(青薯9號威寧1)、0702(青薯9號盤縣1)、0806(中薯3號安順)，均是黃色薯肉，0617、0702為紅皮，遺傳關(guān)系較近，0806黃皮，遺傳關(guān)系相對較遠。Ⅰ-C亞簇僅為1個材料0929(宣薯2號威寧)，黃皮黃肉，橢圓形。

在第Ⅱ類群的7個品種中，0611(費烏瑞它威寧1)與0613(費烏瑞它威寧1)、0807(費烏瑞它安順)與0909(費烏瑞它遵義)親緣關(guān)系很近，薯皮薯肉均為黃色；其他3個品種0916(烏洋芋水城)、0709(費烏瑞它扶貧)、0715(云師特遵義)親緣關(guān)系相對較遠，0916(烏洋芋水城)紅皮白肉，0715(云師特遵義)皮為紫色，肉為白色帶星點紫色。第Ⅲ類群只有1個品種0928(威芋5號威寧2)，黃皮黃肉，這個類群與其他類群間的遺傳距離較大，表明與其他品種存在一定差異，親緣關(guān)系較遠?？傮w來說，參試馬鈴薯品種分子標記結(jié)果，與馬鈴薯品種種薯間的性狀有相關(guān)性和一致性。

3 結(jié) 論

(1)王紹鵬等[13]利用4對引物對黑龍江省7個主栽品種進行SSR標記，共獲得144條多態(tài)性條帶，平均每對引物擴增出36條特異性條帶。SSR 標記試驗重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可作為馬鈴薯品種純度鑒定的方法在實踐中應(yīng)用。本次試驗采用段艷鳳等[3]從138對SSR引物中篩選出的10對多態(tài)性高、譜帶清晰的引物，大部分參試材料均可被分開，說明采用SSR標記構(gòu)建馬鈴薯品種DNA指紋圖譜鑒定可行，這有助于馬鈴薯遺傳資源的進一步挖掘和利用，能對馬鈴薯新品種的鑒定、管理和保護提供一定參考依據(jù)。

圖2 19份馬鈴薯品種的SSR遺傳聚類圖Fig.2 Dendrogram of 19 potato varieties based on SSR marker

(2)從聚類圖結(jié)果看，參試4個不同來源的黑美人品種聚在一起，在參試5個不同來源的費烏瑞它品種中，除扶貧辦提供的品種相距稍遠一些，其余4個相距在一起；青薯9號的情況也類似，3個參試的、不同來源的青薯9號，2個聚在一起。由此可見，參試品種分子標記結(jié)果與馬鈴薯品種的性狀有相關(guān)性和一致性。而同一品種不能相距在一起，原因其一可能是馬鈴薯是塊莖繁殖，其雜合性高，在生產(chǎn)中易產(chǎn)生芽變而導(dǎo)致不同；其二樣品量太少(1～2個)，所取樣品難以代表整個品種，因此還要結(jié)合表型進一步判別。

(3)段艷鳳等[3]的研究表明，在相似系數(shù)0.62處，88個供試馬鈴薯材料被聚為一類，從分子水平上表明供試材料遺傳基礎(chǔ)非常狹窄。唐銘霞等[6]對42份馬鈴薯試驗材料的遺傳聚類分析表明，在遺傳相似系數(shù)0.64 處，42份馬鈴薯材料聚在一起，顯示四川省栽培的馬鈴薯品種遺傳多樣性水平較低，品種間的遺傳差異較小。李飛等[14]研究結(jié)果表明，在相似系數(shù)0.61處，參試的8個馬鈴薯品種(系)中7個品種(系)聚在一類，從分子水平上表明，供試材料的遺傳基礎(chǔ)較狹窄。李麗等[15]利用1O對SSR引物對38份貴州馬鈴薯審定品種和2012年區(qū)試材料進行遺傳多樣性分析表明，在遺傳相似系數(shù)0.61處，所有參試材料可明顯分為3個類群，貴州馬鈴薯不同品種間遺傳基礎(chǔ)較狹窄，同一單位育出的材料往往優(yōu)先聚為一類。黃先群等[16]利用9對SSR引物對引進品種和變異材料進行遺傳多樣性分析表明，24份參試材料在遺傳相似系數(shù)為0.65處可明顯分為4個類群，全部變異材料均聚在1個類群，品種間的多態(tài)性和遺傳距離大于變異材料。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)論基本一致，即從分子水平上表明國內(nèi)品種間的遺傳差異較小，遺傳基礎(chǔ)非常狹窄；同一品種或同一單位育成的品種親緣關(guān)系近。在今后育種工作中，應(yīng)選擇遺傳差異豐富的親本進行雜交，為拓寬遺傳基礎(chǔ)、豐富馬鈴薯種質(zhì)資源和培育新品種奠定基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 劉忠麗)

Genetic Diversity Analysis of Guizhou Potato Production Varieties by SSR Molecular Marker

YAN Qian1, TENG An-ping2, LI En-hong2, YANG Jian1, SHI Wen-juan2, HUANG Xian-qun1*

(1. Guizhou Institute of Potato/Guizhou Key Laboratory of Agricultural Biotechnology, Guizhou Guiyang 550006,China; 2. Seed Management Stations in Guizhou, Guizhou Guiyang 550002, China)

In order to identify the genetic relationship of potato varieties, the 19 potato production varieties in Guizhou were used to analyze the genetic diversity by 10 SSR molecular marker primers. The results showed that only 5 of the 10 SSR primers were obtained clear and readable bands by the PCR amplification. The 60 DNA bands were obtained, including 49 polymorphic bands with a polymorphism rate of 81.67 %, number of polymorphic bands per primer was 9.80. The genetic similarity coefficients of the 19 potato varieties were from 0.43 to 1.00. UPGMA cluster analysis showed that all tested varieties were got together in similarity coefficient 0.56. They were divided obviously into three groups in the genetic similarity coefficient 0.63. The group I included 11 varieties, the groupⅡ included 7 varieties, and group III only one variety. There were 57.89 % of the tested varieties still gathering together in the similarity coefficient 0.65. It meant that the genetic background of all tested varieties is relatively narrow.

Potato; Variety; SSR marker; Genetic diversity

1001-4829(2016)10-2294-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.008

2015-12-15

貴州省級財政馬鈴薯發(fā)展資金項目“貴州省中藥現(xiàn)代化專項‘葛根良種鑒選、規(guī)范化苗圃及示范體系建設(shè)’”[黔科合成字2013(5013)]

顏 謙(1965-)，男，高級實驗師，從事薯類脫毒及種薯繁育研究，E-mail:2711475258@qq.com，*為通訊作者：黃先群(1958-)，女，研究員，博士，從事農(nóng)作物生物技術(shù)工作,E-mail:xqhuang2005@163.com。

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