華麗霞, 張 姝, 蘇 菁

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 四川 成都 610066; 2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，四川 成都 610300; 3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 廣東 廣州 510640; 4.廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510640)

稻瘟病抗性基因Pita特異性分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用

華麗霞1,2, 張 姝1, 蘇 菁3,4

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 四川 成都 610066; 2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，四川 成都 610300; 3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 廣東 廣州 510640; 4.廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510640)

Pita是一個(gè)具有廣譜抗性的稻瘟病抗性基因，已經(jīng)被引入到各稻區(qū)的抗性育種工作中。在基于分子標(biāo)記輔助選擇的水稻抗性育種工作中，為了提高對(duì)Pita的篩選效率，本研究以導(dǎo)致Pita第918個(gè)氨基酸發(fā)生變異的單堿基差異為靶標(biāo)，開發(fā)得到Pita基因特異性分子標(biāo)記，Pita918。研究結(jié)果表明，Pita基因特異性分子標(biāo)記能準(zhǔn)確地將Pita與各抗性基因及感病等位基因區(qū)分開，這將為育種家提供了直接而高效的Pita篩選標(biāo)記。同時(shí)，本研究還利用該標(biāo)記對(duì)收集自華南及西南稻區(qū)的13個(gè)水稻地方抗性品進(jìn)行基因檢測(cè)，結(jié)果顯示這13個(gè)品種均不攜帶有抗性基因Pita，表明Pita基因特異性分子標(biāo)記在水稻抗性材料的基因型鑒定中具有應(yīng)用價(jià)值，有助于育種家挖掘新的抗性基因材料。

水稻；稻瘟??；抗性育種；分子標(biāo)記；MAS

植物病害可以對(duì)產(chǎn)量造成直接的影響，嚴(yán)重的時(shí)候可以引起糧食危機(jī)，如1845年發(fā)生在歐洲的馬鈴薯晚疫病。為此，育種家們一直致力于對(duì)不同的作物進(jìn)行抗性改良。水稻(OryzasativaL.)是世界范圍內(nèi)重要的糧食作物之一，成為世界上過半人口的主要口糧[1]。然而，水稻的產(chǎn)量每年都受到各種水稻病害的威脅，其中由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae；無(wú)性態(tài)：Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病對(duì)水稻的產(chǎn)量產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，造成嚴(yán)重的糧食損失[2-3]?？剐云贩N的使用被公認(rèn)為是控制稻瘟病大流行最環(huán)保、最經(jīng)濟(jì)有效的方法[2, 4-5]。然而，稻瘟病菌生理小種的遺傳易變性嚴(yán)重妨礙了抗性品種的使用壽命，攜帶單個(gè)主效抗性基因的水稻品種在推廣3～5年后，由于毒性菌株逐漸成為優(yōu)勢(shì)小種，最終使品種抗性喪失[6]。因此，育種家需要不斷挖掘新的抗性材料，培育出具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的抗性品種。然而，通過傳統(tǒng)的表型鑒定來(lái)篩選新抗源材料不僅周期長(zhǎng)，而且容易受環(huán)境因素的影響。因此，如何從大量的水稻種質(zhì)資源中快速有效地篩選出新的抗源材料是育種家需要解決的一個(gè)問題。

水稻的2個(gè)亞種，粳稻及秈稻全基因組測(cè)序的相繼完成[7-8]，為水稻的基因組學(xué)研究提供了豐富的序列信息，加快了多態(tài)性分子標(biāo)記，特別是基于PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)的分子標(biāo)記的開發(fā)，加速了控制包括稻瘟病抗性在內(nèi)的重要農(nóng)藝性狀基因的定位、分離及克隆等工作。分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)則是在分子標(biāo)記快速發(fā)展的情況下衍生出來(lái)的，這一技術(shù)的出現(xiàn)大大提高了對(duì)目標(biāo)性狀的定向選擇效率[9]。

到目前為止，已經(jīng)克隆的稻瘟病抗性基因達(dá)26個(gè)(http://www.ricedata.cn/)。在這些已克隆的稻瘟病抗性基因中，部分是以復(fù)等位基因的形式存在于不同水稻品種的同一染色體位置中，這些等位基因雖然在序列上只有少數(shù)幾個(gè)堿基的差異，但是能夠抵抗不同的稻瘟病生理小種，典型的如Pik位點(diǎn)上的等位基因簇，該位點(diǎn)上包含了Pik-m、Pik、Pik-p、Pi1、Pik-h等幾個(gè)序列高度相似，抗譜卻有所不同的等位基因[10-14]。稻瘟病抗性基因的克隆及序列信息的公布使基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)成為可能?；蛱禺愋苑肿訕?biāo)記是指基于基因內(nèi)部多態(tài)性序列所開發(fā)的分子標(biāo)記[15]。與緊密連鎖的分子標(biāo)記相比，基因特異性分子標(biāo)記在抗性基因的篩查以及基于MAS技術(shù)的抗性育種工作中更具優(yōu)勢(shì)。Hayashi 等[16]在Pit啟動(dòng)子區(qū)域、編碼區(qū)分別開發(fā)得到稻瘟病抗性基因Pit的特異性分子標(biāo)記，通過分子標(biāo)記鑒定，在種資質(zhì)源篩選得到5個(gè)Pit類型的抗性基因。華麗霞等[15]成功開發(fā)得到Pi2/9/zt的基因特異性分子標(biāo)記，完成對(duì)101個(gè)水稻品種的基因型篩查，為育種家對(duì)抗源材料的選擇提供重要的參考信息。Pita是一個(gè)具有廣譜抗性的稻瘟病抗性基因，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水稻抗性育種工作中[17-18]。雖然國(guó)內(nèi)外關(guān)于Pita分子標(biāo)記開發(fā)的研究已經(jīng)有報(bào)道，但是這些分子標(biāo)記抑或是位于Pita側(cè)翼，抑或是顯性標(biāo)記，在應(yīng)用過程中容易對(duì)目標(biāo)基因造成錯(cuò)選或漏選[19]。研究結(jié)果表明，Pita所編碼的氨基酸第918個(gè)位點(diǎn)由丙氨酸突變?yōu)槌山z氨酸將引起基因功能的喪失，并且該突變?cè)谒痉N質(zhì)資源中具有普遍性[20-21]。基于前期的研究結(jié)果，本文將以導(dǎo)致Pita第918個(gè)氨基酸發(fā)生變異的SNP(Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸差異)為靶標(biāo)位點(diǎn)，以此開發(fā)得到稻瘟病抗性基因Pita特異性共顯性分子，旨在為水稻育種學(xué)家在稻瘟病抗性育種工作方面提供直接而有效的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

本研究所用的材料有：Pita供體品種IRBLta-K1；攜帶有不同抗性基因的水稻品種IRBL9-W (Pi9)、 C101A51 (Pi2)、IRBLzt-T (Piz-t)、C101LAC (Pi1)、IRBLa-A(Pia)、 IRBLk-Ka (Pik)作為陽(yáng)性對(duì)照；感病品種Nipponbare、CO39以及麗江新團(tuán)黑谷LTH作為陰性對(duì)照。

1.2 引物設(shè)計(jì)

Pita全基因序列來(lái)自Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)(收錄號(hào)：AF207842)；感病等位基因序列來(lái)自日本晴基因組上的參考序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；序列比對(duì)用DNAStar (http://www.dnastar.com/)的子軟件Seqman進(jìn)行。CAPS/dCAPS標(biāo)記通過在線軟件dCAPS finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)[22]來(lái)開發(fā)。

1.3 分子標(biāo)記的檢測(cè)方法

用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(BioTeke, cat#DP3112)提取水稻葉片總DNA；引物序列由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；PCR反應(yīng)體系總體積為20 μl，其中包括2 μl的10×PCR buffer (Mg2+Plus)，1.6 μl的dNTPs (2.5 mM each，TAKARA)，各1 μl正反向引物(10 μM)，0.1 μl的TaKaRaTaqTM(5 U/μl)，水稻基因組DNA 50 ng/μl；反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

用限制性內(nèi)切酶PvuII (15 U/μl，TAKARA)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切體系總體積為12 μl，其中包括1.2 μl的10×M buffer，6 μl的PCR產(chǎn)物，1 μl的內(nèi)切酶，酶切反應(yīng)條件為37 ℃酶切3 h。酶切產(chǎn)物用8 %的聚丙烯酰胺變性電泳凝膠中電泳檢測(cè)，90 V，120 min。

2 結(jié)果與分析

2.1Pita基因特異性分子標(biāo)記的開發(fā)

通過序列比對(duì)，找到抗感等位基因之間導(dǎo)致Pita第918位氨基酸發(fā)生突變的SNP，如圖1所示。利用dCAP標(biāo)記開發(fā)原理，在正向引物3'末端引入錯(cuò)配堿基(圖1，小寫字母)，與Pita特異SNP構(gòu)成一個(gè)可以被限制性內(nèi)切酶PvuII識(shí)別的位點(diǎn)CAGCTG(圖1)。在SNP下游設(shè)計(jì)反向引物，擴(kuò)增獲得可用于酶切鑒定的擴(kuò)增產(chǎn)物(表1)。

表1 Pita特異性分子標(biāo)記相關(guān)信息

注：F：正向引物；R：反向引物。

Note：F:Forward primer; R:Reverse primer.

斜體字母代表導(dǎo)致Pita第918個(gè)氨基酸發(fā)生突變的SNP，下劃線所代表的是編碼第918個(gè)氨基酸的三聯(lián)密碼子，其中GTC編碼氨酸(Alanine),TCT編碼絲氨酸(Serine)；雙下劃線代表正向引物，小寫字母為3'，未端引入的錯(cuò)配編堿基圖1 Pita與感病等位基因之間的序列對(duì)比Fig.1 Sequence align ment of Pita and its orth logs

2.2Pita基因特異性分子標(biāo)記的驗(yàn)證

以攜帶不同抗性基因的水稻品種作為陽(yáng)性對(duì)照，以感病品種作為陰性對(duì)照，對(duì)該標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。用上述引物對(duì)各水稻品種總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，用限制性內(nèi)切酶PvuII對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果表明，該標(biāo)記能清楚地將Pita與各抗性基因及感病等位基因區(qū)分開(圖2)。

2.3 用Pita基因特異性分子標(biāo)記對(duì)抗性材料進(jìn)行檢測(cè)

為了減少抗性育種工作的盲目性，提供育種效率，在育種初期應(yīng)該對(duì)水稻材料進(jìn)行抗性遺傳背景的分析，因此用基因特異性分子標(biāo)記對(duì)水稻品種資源進(jìn)行抗性基因篩查便顯得十分重要。Pita是一個(gè)具有廣譜抗性的稻瘟病抗性基因，適合引入到各稻區(qū)的抗性育種工作中。本研究用所開發(fā)的Pita基因特異性分子標(biāo)記對(duì)收集自華南及西南稻區(qū)的13個(gè)水稻地方品進(jìn)行基因檢測(cè)。這13個(gè)地方品種在自然條件對(duì)稻瘟病具有一定的抗性，對(duì)抗性育種工作及新抗性基因的挖掘具有一定的應(yīng)用價(jià)值。然而，在這13個(gè)地方品種中，并沒有檢測(cè)到Pita基因，說明這13個(gè)地方品種的稻瘟病抗性并不是由稻瘟病抗性基因Pita所介導(dǎo)的(圖3)，這些抗源材料可能攜帶有其它稻瘟病抗性基因。

M:DL2000;Line 1:cv.IRBLta-K1(Pita);Line 2:cv.IRBL9-W(Pi9);Line 3:cv.C101A51(Pi2);Line 4:cv.IRBLzt-T(Piz-t);Line 5:cv.C101LAC(Pi1);Line 6:cv.IRBLa-A(Pia);Line 7:cv.IRBLk-Ka(Pik);Line 8:cv.Nipponbare;Line 9:cv.CO39.Line 10:cv.LTH.圖2 Pita特異性分子標(biāo)記的多態(tài)性檢測(cè)Fig.2 Polymorphsim validation of Pita-specific marker

M:DL2000; Line 1:cv. IRBLta-K1 (Pita); Line 2-14:Resistance rice landraces圖3 Pita特異性分子標(biāo)記對(duì)水稻抗性材料的基因型檢測(cè)Fig.3 Genotype analysis of resistance rice materials by Pita-specific DNA marker

3 討 論

抗性育種的關(guān)鍵在于：①獲得抗源材料；②快速準(zhǔn)確地將目標(biāo)基因?qū)氲酱牧嫉钠贩N中。分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展而產(chǎn)生的分子技術(shù)，可以準(zhǔn)確快速地分析個(gè)體的遺傳組成，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)性狀的定向選擇，為作物的分子設(shè)計(jì)育種提供重要的技術(shù)工具。在水稻抗性育種方面，分子標(biāo)記輔助選擇已經(jīng)逐漸被用于優(yōu)良品種、不育系等品種的抗性改良中，主要集中在抗性基因的滲入及基因聚合等方面[23-25]。官華忠等[26]以水稻品系LAC23 (Pi1)作為抗性供體親本，保持系金23B為受體親本，以回交轉(zhuǎn)育為基礎(chǔ)，利用與Pi1連鎖的分子標(biāo)記RM224或MRG4766對(duì)后代進(jìn)行篩選，最終育成了抗稻瘟病秈型三系不育系金抗1A，其抗性不僅達(dá)到了LAC23 (Pi1)的抗性水平，而且還保持了金23A的優(yōu)良農(nóng)藝性狀。

在抗性育種工作中，分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖程度對(duì)MAS技術(shù)的效率有著重要的影響。而與緊密連鎖的分子標(biāo)記相比，基因特異性分子標(biāo)記與目的基因完全共分離，實(shí)現(xiàn)了對(duì)目的基因的直接選擇，不受遺傳背景以及遺傳重組的影響，適合的群體較廣，在應(yīng)用上更具優(yōu)勢(shì)[15]?；蛱禺愋苑肿訕?biāo)記有著重要的應(yīng)用價(jià)值，在分子育種中，還可用于對(duì)水稻種子資源進(jìn)行分子鑒定，了解各抗性基因在種質(zhì)資源中的分布情況，不僅為抗性育種工作的開展提供重要的參考信息，使主效抗性基因在抗性育種工作中實(shí)現(xiàn)合理地使用，同時(shí)還可以對(duì)抗源材料的抗性遺傳背景進(jìn)行分析，為育種家快速鑒定到新的抗源材料提供重要的技術(shù)手段。此外，用基因特異性分子標(biāo)記對(duì)大田水稻生產(chǎn)品種進(jìn)行抗性基因存在與缺失情況的監(jiān)測(cè)，可以及早地發(fā)現(xiàn)因不明原因而造成基因丟失的品種，這對(duì)預(yù)防稻瘟病的流行起到一定的作用。隨著越來(lái)越多的功能基因被分離克隆，基因特異性分子標(biāo)記的這些潛在應(yīng)用價(jià)值將促使其在未來(lái)研究中越來(lái)越受到重視。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Development and Application of Specific DNA Marker for Rice Blast Resistance Gene,Pita

HUA Li-xia1,2, ZHANG Shu1, SU Jing3,4

(1.Plant Protection Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066，China; 2.The Industrial Crop Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610300，China; 3.Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangdong Guangzhou 510640，China; 4.Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangdong Guangzhou 510640，China)

Pitais a broad-spectrum resistance gene for rice blast and has been applied in different rice resistance breeding programs. In order to improve the efficiency forPitaselection based on molecular marker-assistant selection (MAS), a gene-specific dCAPs marker, Pita918, targeted on single nucleotide polymorphism that result in single amino acid changed between resistant and susceptible allele ofPitaon 918th aa has been developed in this paper. The result showed thatPitaspecific DNA marker Pita918 can distinguishPitafrom otherRgenes and susceptible allele gene clearly, providing breeders an efficient and accurate marker forPitaselection. Additionally, Pita918 has been used for genotype characterization among 13 resistant rice landraces collected from south and southwest of China, the result showed that those landraces do not harboringPitafor their rice blast resistance, suggesting that Pita918 is a valuable DNA marker for genotype identification in rice germplasm, which will give breeders abundant genetic information in new resistance genes discovery.

Rice; Rice blast; Resistance breeding; Molecular marker; MAS

1001-4829(2016)10-2275-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.004

2015-12-30

四川省財(cái)政創(chuàng)新能力提升工程青年基金項(xiàng)目(2014CXSF-023)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31301304)；國(guó)家科技(轉(zhuǎn)基因)重大專項(xiàng)(2014ZX0800904B)；公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201203014)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-01-24)

華麗霞(1983 -)，女，廣東英德人，博士研究生，主要從事作物病害方面的研究, E-mail：newpage@stu.scau.edu.cn。

S511

A