石　禹，吉宏張，包小峰

(南通大學1.附屬第三人民醫(yī)院臨床藥學室、2．藥學院，江蘇南通　226006)

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N末端Strep蛋白標簽表達載體的構(gòu)建和應(yīng)用

石禹1，2，吉宏張2，包小峰2

(南通大學1.附屬第三人民醫(yī)院臨床藥學室、2．藥學院，江蘇南通226006)

中國圖書分類號: R341; R345．57; R374; R394．2; R977. 6

摘要:目的構(gòu)建攜帶N末端Strep( NS)蛋白標簽的表達載體;在表達載體中構(gòu)建衣原體RNA聚合酶亞基重組蛋白并表達。方法采用PCR的方法，通過引物引入NS蛋白標簽和新的多克隆位點替代pET21c-DH質(zhì)粒中原有的T7蛋白標簽和多克隆位點，選擇新引入的Not I酶切位點進行PCR產(chǎn)物的環(huán)化自連，轉(zhuǎn)化DH-5α細菌后篩選陽性菌株，PCR法和基因測序法鑒定新構(gòu)建的表達載體;在新構(gòu)建表達載體的BamH I和Sal I位點之間分別插入衣原體RNA聚合酶核心酶的α、β、β'亞基，獲得表達NS-α、NS-β、NS-β'融合蛋白的表達載體，轉(zhuǎn)化表達菌株ArcticExpress，篩選陽性表達菌株，并用考馬斯亮藍染色、Western blot等法鑒定融合蛋白的表達情況。結(jié)果成功構(gòu)建了攜帶NS蛋白標簽的pET21c-NSMCS載體，并成功將其應(yīng)用于衣原體RNA聚合酶核心酶亞基融合蛋白的構(gòu)建及表達。結(jié)論獲得穩(wěn)定表達NS-α、NS-β、NS-β'融合蛋白的表達載體，為研究衣原體基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:Strep蛋白標簽;表達載體;融合蛋白;克隆; RNA聚合酶;衣原體

包小峰( 1979－)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:衣原體轉(zhuǎn)錄調(diào)控與抗衣原體化合物，通訊作者，E-mail: baoxi@ ntu．edu．cn

蛋白標簽是指利用DNA體外重組技術(shù)與目標蛋白基因融合表達的一種多肽或蛋白，常用于目標蛋白的構(gòu)建、表達、檢測、示蹤及純化［1］。在重組蛋白研究過程中，通常使用親和性標簽(如His、GST、Strep)等。主要因這些親和標簽?zāi)苁怪亟M蛋白的純化、檢測、固定等變得更方便易行。同時，蛋白的表達和純化都可以實現(xiàn)規(guī)?；?］。本文主要介紹蛋白質(zhì)N末端Strep標簽表達載體的構(gòu)建以及其在研究衣原體RNA聚合酶核心酶中的應(yīng)用。

1　材料

1．1質(zhì)粒、菌株質(zhì)粒pET21c-DH( His標簽被去除的pET21c，美國羅格斯-新澤西州立大學的范輝宙教授惠贈)，DH-5α化學感受態(tài)細胞購自于南京諾唯贊生物科技有限公司，ArcticExpress表達菌株的化學感受態(tài)細胞購自美國Stratagene公司。

1．2工具酶與主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購自NEB(北京)有限公司;高保真Phanta DNA聚合酶、ClonExpress II非連接依賴型快速克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司; SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、異丙基硫代半乳糖苷( IPTG)均購自上海生工生物工程有限公司; 2×Taq PCR MasterMix為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

2　N末端Strep蛋白標簽表達載體的構(gòu)建

2．1引物設(shè)計與合成根據(jù)pET21c-DH質(zhì)粒載體的序列，采用Primer Premier 6. 0軟件進行PCR引物設(shè)計，插入Strep標簽的同時將pET21c-DH( Fig 1A)中原有的多克隆位點( multiple cloning sites，MCS)替換為( Fig 1B)所示的多克隆位點，預(yù)計得到產(chǎn)物pET21c-NS-MCS質(zhì)粒。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列如下，上游引物: 5'-TATATGCGGCCGCAATTGAATTCCTCGAGTGAGATC CGGCTGCTAAC-3';下游引物:5'-TATATGCGGCCGCGTCGACCATGGATCCTTTTTCGAACTG-3'。其中GCGGCCGC為環(huán)化連接PCR產(chǎn)物所需的Not I酶切位點。按照以下體系進行PCR反應(yīng): 200 nmol ·L－1上游引物、200 nmol·L－1下游引物、30 ng pET21c-DH模板質(zhì)粒、0. 2 U Phanta DNA聚合酶，ddH2O補足至50 μL;在PCR儀上按照如下反應(yīng)條件進行擴增: 95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸6 min，共24個循環(huán)。得到的PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶指示約在5 400 bp( Fig 2A)，為預(yù)期的MCS序列片段帶。然后使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒膠回收得到帶有MCS序列的載體片段。

2．2酶切和連接反應(yīng)將以上膠回收后的序列片段進行單酶切反應(yīng)，體系如下:序列片段30 μL，10× CutSmart緩沖液5 μL，Not I限制性內(nèi)切酶1 μL，加ddH2O至50 μL，37℃水浴酶切3 h。使用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒對酶切產(chǎn)物進行回收，得到酶切序列片段。對該酶切序列片段使用T4連接酶進行自連反應(yīng)，體系如下:酶切序列片段8 μL，10 ×T4連接酶緩沖液1 μL，T4連接酶1 μL，16℃連接過夜。

Fig 1 pET21c-DH plasmid sequence to be replaced( A) and newly introduced Strep-tag and MCS sequence in pET21c-NS-MCS Plasmid( B)

2．3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定將連接產(chǎn)物與DH-5α化學感受態(tài)細菌混合，42℃熱休克60 s后，涂布到含氨芐青霉素(終濃度為100 mg·L－1)的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)14 h，挑選得到的菌落進行PCR驗證，驗證上游引物: 5'-GCGAAATTAATACGACTCAC-3'［pET-21c-Reverse ( 313-332)］;下游引物: 5'-GGGGTTATGCTAGTTATTGC-3'［pET-21c-Forward ( 61-80)］，反應(yīng)酶為2× Taq PCR Master Mix共25 μL體系。在PCR儀上按照如下程序進行處理: 94℃3 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，26個循環(huán)。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約220 bp大小的條帶( Fig 2B)，與預(yù)期大小相符。

Fig 2 Vector fragment containing new MCS sequence( A) and identification of pET21c-NS-MCS clone( B) detected by agarose gel electrophoresis

2．4重組質(zhì)粒的測序分析挑取經(jīng)PCR鑒定的陽性菌落，接種到10 mL含100 mg·L－1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng)12 h放大后送上海生工公司進行測序鑒定。測序結(jié)果顯示，本實驗得到的重組質(zhì)粒pET21c-NS-MCS 中NS標簽和多克隆位點序列和位置與預(yù)先設(shè)計的完全一致( Fig 3)。

3　N末端Strep標簽表達載體在研究衣原體RNA聚合酶核心酶中的應(yīng)用

衣原體是一類真核細胞內(nèi)寄生，具有獨特發(fā)育周期，并能通過細菌濾器的原核細胞型微生物［4］。在自然界中傳播很廣泛，常寄生于人類、鳥類及哺乳動物，并可引起多種疾病。其特殊的生長條件和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控所需要的遺傳基礎(chǔ)系統(tǒng)的缺少妨礙了對衣原體的深入研究［5］。

現(xiàn)代分子生物學證實轉(zhuǎn)錄是基因表達的第一步，也是最關(guān)鍵的一步，其中催化轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中占有重要的地位［6］。通常的RNA聚合酶是一種由多個蛋白亞基組成的復(fù)合酶，包括α、β、β'、σ等亞基。其中α亞基決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄;β亞基含有三磷酸核苷的結(jié)合位點; β'亞基含有與DNA模板相結(jié)合的位點;σ亞基與轉(zhuǎn)錄起始點的識別有關(guān)［7］。通過質(zhì)粒載體的研究我們已經(jīng)證實GrgA是衣原體獨有的轉(zhuǎn)錄激活因子，在衣原體生長發(fā)育周期中扮演著十分重要的角色［3］。但目前關(guān)于GrgA與衣原體RNA聚合酶關(guān)系的文獻報道很少，已發(fā)現(xiàn)GrgA可以和衣原體DNA和RNA聚合酶的σ66亞基結(jié)合［3，8］，但與RNA聚合酶核心酶亞基的關(guān)系都是未知的。本文通過構(gòu)建N末端Strep標簽表達載體，為我們研究GrgA與衣原體RNA聚合酶核心酶各亞基間的相互關(guān)系提供了實驗基礎(chǔ)。

3．1構(gòu)建攜帶NS標簽的衣原體RNA聚合酶的α、β和β'亞基為了提高效率，我們采用ClonExpress技術(shù)，它是一種簡單、快速并且高效的DNA定向克隆技術(shù)，可將插入片段PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點。首先根據(jù)GenBank中已收錄的沙眼衣原體L2血清型來源的衣原體RNA聚合酶的α亞基基因( GenBank Accession: NC_010287. 1 903145-904278)、β亞基基因( GenBank Accession: NC_010287. 1 673171-676929)、β'亞基基因( Gen-Bank Accession: NC_010287. 1 668956-673146)，由Primer Premier 6. 0軟件進行PCR引物設(shè)計。α亞基引物序列如下:上游引物: BamH I-RpoA-5'f: 5'-CCTCAGTTCGAAAAAGGATCCATGTCGGATAGTTC ACACA-3';下游引物: Sal I-RpoA-3' f: 5'-TTCAATT GCGGCCGCGTCGACTTATCCCTTGGTATTTTTACTC-3'。β亞基引物序列如下:上游引物: BamH I-RpoB-5' f:5'-CCTCAGTTCGAAAAAGGATCCATGTTCAAG TGCCCGG-3';下游引物: Sal I-RpoB-3'f: 5'-TTCAATTGCGGCCGCGTCGACTTAAGCATCTACTACCATAGG G-3'。β'亞基引物序列如下:上游引物: BamHIRpoC-5' f:5'-CCTCAGTTCGAAAAAGGATCCATGTTCAGAGAAGGTTCTCG-3';下游引物: Sal I-RpoC-3' f:5'-TTCAATTGCGGCCGCGTCGAC GGCAGATCTTTAACCTG-3'。以上引物中GGATCC為BamH I識別位點; GTCGAC為Sal I識別位點;模板為沙眼衣原體L2血清型基因組DNA( genomic DNA，gDNA)。PCR反應(yīng)體系與條件同上。得到的PCR擴增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測( Fig 4A)，膠回收后作為插入片段。

將上述pET21c-NS-MCS質(zhì)粒進行BamH I、Sal I限制性內(nèi)切酶雙酶切，37℃水浴酶切3 h后，將酶切產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳分離純化( Fig 4B)，膠回收得到載體片段。

Fig 3 pET21c-NS-MCS Plasmid sequencing results( A) and sequence comparison( B)

Fig 4 Insertion fragment( A) and vector fragment( B) of construction NS-α of NS-β、NS-β' detected by Agarose gel electrophoresis

將以上3個插入片段分別與載體片段按摩爾比4: 1進行混合，加入Clon-Express重組酶ExnaseTMII 37℃水浴反應(yīng)30 min。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH-5α化學感受態(tài)細菌后，涂布到相應(yīng)抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)14 h，挑選得到的菌落進行PCR驗證。各挑選一株經(jīng)鑒定為陽性的菌落接種放大后送測序，測序結(jié)果無突變(驗證結(jié)果此處省略)。

3．2衣原體NS-α、NS-β和NS-β'融合蛋白的表達

將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到表達菌株ArcticE-xpress，涂布于含相應(yīng)抗性和慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。d 2挑選陽性克隆，接種到5 mL含相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng)12 h至對數(shù)成長期后按1∶100的比例取2. 5 mL至250 mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng)約3 h放大至光密度( OD)為0. 8后，加入1 mmol·L－1IPTG，180 r· min－113℃低溫振蕩表達12 h。高速離心8 000 r· min－1收集細菌沉淀，加入含25 mmol·L－14-羥乙基哌嗪乙磺酸( Hepes)、300 mmol·L－1氯化鈉的非變性細菌裂解液10 mL，超聲裂解細菌后12 000 r· min－1離心收集上清，即得到目標蛋白粗樣品，Western blot( Fig 5A)及考馬斯亮藍染色( Fig 5B)檢測結(jié)果顯示相應(yīng)亞基的融合蛋白，表明攜帶NS標簽的衣原體RNA聚合酶的α、β和β'亞基表達載體成功構(gòu)建并表達。

Fig 5 Western blot( A) and Coomassie bright blue staining( B) used to detect expression of NS-α，NS-β，NS-β' Fusion Protein

4　討論

本實驗應(yīng)用的蛋白標簽技術(shù)在檢測和純化目的蛋白、蛋白定位和轉(zhuǎn)運、蛋白質(zhì)相互作用以及構(gòu)象改變等研究中發(fā)揮重要作用［9］。其中Strep蛋白標簽由僅8個氨基酸組成，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性通常沒有影響，同時具有高選擇性和易于控制的結(jié)合性，適合從真核或原核表達體系中純化strep標簽蛋白［10］。在此基礎(chǔ)上開發(fā)的Strep-tag/Strep-Tactin系統(tǒng)現(xiàn)已成為廣泛應(yīng)用的蛋白親和層析系統(tǒng)之一。其可與多種不同的基質(zhì)偶聯(lián)，使Strep-tag融合蛋白得以在生理條件下親和純化。與其他tag相比，這些溫和的純化參數(shù)能保存蛋白質(zhì)的生物活性，并經(jīng)進一步層析后即可產(chǎn)出超過99%的純度［11］。

設(shè)計pET21c-NS-MCS質(zhì)粒載體中新的多克隆位點時充分考慮覆蓋本研究課題所在實驗室常用并已購買的限制性內(nèi)切酶酶切位點，為進一步構(gòu)建缺失部分序列的衣原體RNA聚合酶亞基融合蛋白提供了一個相對“多能”的中介質(zhì)粒載體，同時我們在Strep蛋白標簽的前面加入一個新的Nde I酶切位點( Fig 1B)，這樣在構(gòu)建不帶Strep標簽甚至替換其它親和性標簽衣原體RNA聚合酶各亞基時也同樣可以利用這一質(zhì)粒載體［12］。另外本實驗在構(gòu)建pET21c-NS-MCS質(zhì)粒載體時利用的是Not I限制性內(nèi)切酶環(huán)化連接，新的多克隆位點Not I限制性內(nèi)切酶所處位置較有利于引物的設(shè)計，而原有多克隆位點會造成引物過長，這樣PCR產(chǎn)物的效率、目的融合蛋白的序列突變率可能會產(chǎn)生問題。

融合蛋白技術(shù)主要是為了獲得大量標準融合蛋白而進行的有目的性的基因融合和蛋白表達方法［13］。在實驗時，應(yīng)該多考慮幾種構(gòu)建融合蛋白常用的融合方式，從中篩選出效率比較高的連接方式。比如以上我們在構(gòu)建攜帶NS標簽的衣原體RNA聚合酶的α、β和β'亞基時所采用的ClonExpress技術(shù)就明顯比T4連接酶連接的方式效率高很多，具體表現(xiàn)在瓊脂糖膠回收的產(chǎn)物濃度、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌的效率、目的克隆的陽性率等方面。本次實驗很好的利用了融合蛋白和克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了N末端帶有Strep標簽的pET21c-NS-MCS質(zhì)粒，其含有適合進一步構(gòu)建融合蛋白的多克隆位點，并將其成功應(yīng)用于衣原體RNA聚合酶核心酶亞基重組表達載體的構(gòu)建，為我們研究GrgA與衣原體RNA聚合酶各亞基間的相互作用提供了良好的基礎(chǔ)。

(致謝:本研究課題主要在南通大學藥學院生物醫(yī)藥重點實驗室與南通大學附屬第三人民醫(yī)院肝病實驗室完成，感謝實驗室老師和同學的幫助與支持，尤其感謝包小峰老師的細心指導(dǎo)與大力支持，吉宏張同學的全力協(xié)助與參與! )

參考文獻:

［1］Wood D W，Camarero J A．Intein applications: from protein purification and labeling to metabolic control methods［J］．J Biol Chem，2014，289( 21) : 14512－9．

［2］Mizukami S，Hori Y，Kikuchi K，et al．Small-molecule-based protein-labeling technology in live cell studies: probe-design concepts and applications［J］．Acc Chem Res，2014，47( 1) : 247－56．

［3］Bao X F，Nickels B E，F(xiàn)an H，et al．Chlamydia trachomatis protein GrgA activates transcription by contacting the nonconserved region of σ66［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2012，109( 42) : 16870－5．

［4］Nunes A，Gomes J P．Evolution，phylogeny，and molecular epidemiology of Chlamydia［J］．Infect Gent Evol，2014，4( 23) : 49－64．

［5］Bachmann N L，Polkinghorne A，Timms P，et al．Chlamydia genomics: providing novel insights into chlamydial biology［J］．Trends Microbiol，2014，22( 8) : 464－72．

［6］Mekler V，Minakhin L，Borukhov S，et al．Coupling of downstream RNA polymerase-promoter interactions with formation of catalytically competent transcription initiation complex［J］．J Mol Biol，2014，426( 24) : 3973－84．

［7］Rao X，Deighan P，Hua Z，et al．A regulator from Chlamydia trachomatis modulates the activity of RNA polymerase through direct interaction with the beta subunit and the primary sigma subunit ［J］．Genes Dev，2009，23( 15) : 1818－29．

［8］Bao X F，Pachikara N D，Oey C B，et al．Noncoding Nucleotides and Amino Acids near the Active Site Regulate Peptide Deformylase Expression and Inhibitor Susceptibility in Chlamydia trachomatis［J］．Microbiology，2011，157( Pt 9) : 2569－81．

［9］Cole N B．Site-specific protein labeling with SNAP-tags［J］．Curr Protoc Protein Sci，2013，73( 30) : 1001－4．

［10］Dammeyer T，Timmis K N，Tinnefeld P．Broad host range vectors for expression of proteins with ( Twin-) Strep-tag，His-tag and engineered，export optimized yellow fluorescent protein［J］．Microb Cell Fact，2013，12( 49) : 1186－97．

［11］Maertens B，Spriestersbach A，Kubicek J，et al．Strep-tagged protein purification［J］．Methods Enzymol，2015，14( 72) : 53－6．

［12］陳鐘琳，姜紅巖，洪曉冰，等．hi FGF2真核表達載體的構(gòu)建及其高表達對細胞凋亡的影響［J］．中國藥理學通報，2014，30 ( 11) : 1535－8．

［12］Chen Z L，Jiang H Y，Hong X B，et al．Construction of Hi FGF2 eukaryotic expression plasmids and its over-expression induced cell apoptosis［J］．Chin Pharmacol Bull，2014，30( 11) : 1535－8．

［13］Janczak M，Bukowski M，Górecki A，et al．A systematic investigation of the stability of green fluorescent protein fusion proteins［J］．Acta Biochim Pol，2015，62( 3) : 407－11．

Construction and application of N-terminal Strep-tagged protein expression vector

SHI Yu1，2，JI Hong-zhang2，BAO Xiao-feng2
( 1．Dept of Clinical Pharmacy，the Third People's Hospital of Nantong University，Nantong Jiangsu 226006，China; 2．School of Pharmacology，Nantong University，Nantong Jiangsu 226006，China)

Abstract:AimsTo construct the N-terminal Streptagged ( NS-tagged) fusion protein expression vector，and to apply the vector to express NS-tagged fusion proteins of Chlamydia RNA polymerase subunit．Methods By using PCR method，NS fusion protein tag and a new multiple cloning sites ( MCS) were inserted into pET21c-DH plasmid by primers to replace the original T7 protein tag and MCS．The newly introduced Not I cutting site was chosen for self-ligation of PCR product．Then，the cyclized PCR product was transformed into DH-5α competent cells．The positive clones were selected by PCR and sequencing．To get NS-tagged fusion proteins of chlamydial RNA polymerase subunits，the α，β and β' subunits were inserted between BamH I and Sal I cutting sites of the newly constructed expression vector．Then，the NS-α，NS-β and NS-β' expression vectors were transformed into ArcticExpress expression cells．The fusion protein expression statuses of transformed cells were identified by Commassie blue staining and Western blot．ResultsThe NS-tagged fusion protein expression vector pET21c-NS-MCS was successfully constructed，and NS-α，NS-β and NS-β' fusion proteins were obtained by using this newly constructed expression vector．Conclusions In this project，we constructed an NS-tagged fusion protein expression vector and applied it to express NS-α，NS-β and NS-β' fusion proteins．Our study can lay a solid foundation for the study of transcriptional regulation of Chlamydia genes．

Key words:Strep-tag; expression vector; fusion protein; cloning; RNA polymerase; chlamydia

作者簡介:石禹( 1984－)，男，碩士，主管藥師，研究方向:抗感染臨床藥學，E-mail: 935748481@ qq．com;

基金項目:國家自然科學基金資助項目( No 31370209，31400165) ;南通大學研究生科研創(chuàng)新計劃項目( No 13025166) ;“青藍工程”資助項目

收稿日期:2015－09－29，修回日期: 2015－11－29

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0098－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．021