熊鳳霄，楊志英，王少貴，陳　誠，黃河清

(中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗室，廣東廣州　510006)

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膽汁酸膜受體TGR5對高糖培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞FN、TGF-β1的調(diào)控作用

熊鳳霄，楊志英，王少貴，陳誠，黃河清

(中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗室，廣東廣州510006)

中國圖書分類號: R-332; R322．61; R341; R692．39; R977. 6

摘要:目的探究G蛋白偶聯(lián)受體TGR5在大鼠腎小球系膜細(xì)胞中的表達(dá)以及高糖條件下對纖維連接蛋白( fibronectin，F(xiàn)N)以及轉(zhuǎn)化生長因子( transforming growth factor-β1，TGF-β1)蛋白水平的影響，探索其在糖尿病腎病中可能發(fā)揮的作用。方法高糖( 30 mmol·L－1glucose，HG)條件下，用特異性激動劑INT-777激活TGR5，或者對TGR5進(jìn)行過表達(dá)、干擾處理，通過Western blot來檢測大鼠腎小球系膜細(xì)胞中TGR5的表達(dá)情況以及FN、TGF-β1蛋白水平的變化。結(jié)果

在大鼠腎小球系膜細(xì)胞中存在TGR5的表達(dá);與對照組相比，激活TGR5后，由高糖引起的FN、TGF-β1蛋白水平的上升受到抑制( P＜0. 01，P＜0. 05) ;另一方面，干擾TGR5后，F(xiàn)N、TGF-β1的蛋白水平與對照組相比異常升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0. 01，P＜0. 05)。結(jié)論在大鼠腎小球系膜細(xì)胞中，TGR5可以抑制由高糖引起的FN、TGF-β1蛋白水平的升高，在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞:G蛋白偶聯(lián)受體; TGR5;高糖;腎小球系膜細(xì)胞;纖維連接蛋白;轉(zhuǎn)化生長因子; INT－777;糖尿病腎病

黃河清( 1965－)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:中藥心血管及糖尿病藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: huangheq @ mail．sysu．edu．cn

TGR5，也稱M-BAR、GPBAR或者GPR131。由330個氨基酸組成，包含7個跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，是一種新型膽汁酸受體［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，激活TGR5可以減少巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制單核細(xì)胞中促炎癥因子的表達(dá)［2－3］，另外，還可以促進(jìn)胰高血糖素樣肽-1( GLP-1)的分泌，使胰島素水平增加［4］，調(diào)控能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)，改善胰島素抵抗等［5］。TGR5在炎癥、糖脂代謝等方面均有非常重要的調(diào)節(jié)作用，但目前尚未見它在糖尿病腎病方面的報道。

糖尿病腎病( diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，是終末期腎病發(fā)生的主要原因。病理特征主要表現(xiàn)為腎臟纖維化、系膜細(xì)胞增生、細(xì)胞外基質(zhì)的堆積以及系膜區(qū)增寬等［6］。纖維連接蛋白( fibronectin，F(xiàn)N)是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，能有效反映其堆積程度［7－8］;而轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1可以促進(jìn)胞外基質(zhì)的合成，加速腎臟纖維化［9－10］，兩者都是糖尿病腎病的重要指標(biāo)。

為此，實(shí)驗以大鼠腎小球系膜細(xì)胞為研究對象，予以高糖刺激模擬糖尿病腎病的體內(nèi)環(huán)境，檢測了TGR5的表達(dá)情況，并運(yùn)用特異性激動劑INT-777激活TGR5，或者使用過表達(dá)、干擾TGR5的方法，檢測FN、TGF-β1的變化，進(jìn)而探索TGR5在糖尿病腎病中發(fā)揮的作用。

1　材料與方法

1．1細(xì)胞的傳代和培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)按以前的實(shí)驗方法進(jìn)行［11］。細(xì)胞鑒定后，取5～12代的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗。培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2，每2 ～3 d使用5%胰酶消化傳代。細(xì)胞生長至匯合時，用無血清培養(yǎng)基處理24 h，之后再予以不同的分組處理。

1．2實(shí)驗試劑D－( + )－葡萄糖和胰蛋白酶( Sigma) ;胎牛血清( HyClone) ; DMEM培養(yǎng)基( Gibco) ;識別FN，TGR5的抗體( Santa Cruz Biotechnology)，識別TGF-β1的抗體( Cell Signaling Technology)和識別α-tubulin的抗體( Sigma) ;辣根過氧化物酶偶合的兔、鼠二抗( Promega) ; INT-777( MedChem Express)。

1．3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒TGR5以及空載購自O(shè)rigene。將系膜細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞生長近融合至60%～80%時，即可開始轉(zhuǎn)染實(shí)驗。轉(zhuǎn)染試劑按LipofectamineTMLTX＆Plus Reagent( Life Technologies)的說明書進(jìn)行使用。轉(zhuǎn)染24 h后，無血清培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化，再給予高糖和INT-777刺激24 h，收集細(xì)胞用于Western blot檢測。

1．4TGR5干擾實(shí)驗消化重懸的系膜細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞生長近融合至60%～80%時即可開始干擾實(shí)驗。干擾序列購自Genepharma，正義鏈5'-GCUUCUUUCUAAGCCUACUTT-3';反義鏈5'-AGUAGGCUUAGAAAGAAGCTT-3'。干擾試劑按LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent( Life Technologies)的說明書進(jìn)行使用。48 h后收集細(xì)胞用于Western blot檢測。

1．5Werstern blot檢測大鼠腎小球系膜細(xì)胞FN以及TGF-β1的蛋白水平細(xì)胞終止培養(yǎng)后，棄培養(yǎng)基，在冰上用預(yù)冷的PBS漂洗2次，棄去PBS，加去污裂解液，刮下細(xì)胞收集裂解液至1. 5 mL EP管，裂解完畢后離心取上清，用BCA法測定蛋白含量。之后將提取蛋白進(jìn)行凝膠電泳，每個泳道上樣量為20 μg總蛋白。電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜或者NC膜( Millipore)上。一抗4℃孵育12～16 h，之后分別用對應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。洗膜后曝光，顯影。利用圖像分析軟件Quantity One( Bio-Rad)確定目的條帶的光密度值。

1．6統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5. 0進(jìn)行分析，組間比較、組內(nèi)比較用t檢驗，多組比較用方差分析(單因素方差分析、LSD法)，結(jié)果用±s表示。

2　結(jié)果

2．1TGR5在大鼠腎小球系膜細(xì)胞的表達(dá)從Fig 1可以看出，大鼠腎小球系膜細(xì)胞中存在TGR5的表達(dá)，為進(jìn)一步實(shí)驗提供了基礎(chǔ)。與正常對照組相比，高糖組TGR5的蛋白表達(dá)水平下降，提示TGR5可能參與了糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程，具體作用有待進(jìn)一步探討。

2．2特異性激動TGR5對于大鼠腎小球系膜細(xì)胞中FN及TGF-β1的影響INT-777是TGR5的一種特異性激動劑［12］。如Fig 2所示，與正常對照組相比，高糖組的FN及TGF-β1蛋白水平均明顯上升。在此基礎(chǔ)上加入特異性激動劑INT-777(終濃度為10 μmol·L－1)處理，F(xiàn)N蛋白水平下調(diào)( P＜0. 01)，TGF-β1的表達(dá)也明顯減少( P＜0. 05)。由此可見，激動TGR5可以抑制由高糖引起的FN、TGF-β1蛋白水平的異常升高。

Fig 1 Protein level of TGR5 in rat glomerular mesangial cells

Fig 2 Effects of INT-777 on protein expression of FN and TGF-β1 in high glucose-treated rat glomerular mesangial cells

2．3過表達(dá)TGR5對于大鼠腎小球系膜細(xì)胞中FN及TGF-β1的影響為進(jìn)一步確定TGR5發(fā)揮的作用，采用TGR5過表達(dá)的方法，并于過表達(dá)后進(jìn)一步予以INT-777刺激來檢測FN及TGF-β1的表達(dá)情況。從Fig 3A可以看出，與對照組相比，過表達(dá)組的TGR5蛋白表達(dá)明顯升高( P＜0. 05)。如Fig 3B-C所示，與高糖組相比，TGR5過表達(dá)組的FN、TGF-β1的蛋白水平已經(jīng)有下降的趨勢。在此基礎(chǔ)上予以INT-777刺激，F(xiàn)N與TGF-β1的蛋白水平均更進(jìn)一步下調(diào)( P＜0. 01，P＜0. 05)。

2．4干擾TGR5對于大鼠腎小球系膜細(xì)胞中FN 及TGF-β1的影響另一方面，對TGR5進(jìn)行干擾，以驗證它對于FN及TGF-β1的調(diào)控作用。從Fig 4A中可以看出，TGR5干擾序列的干擾效率達(dá)到70%。如Fig 4B-C所示，與對照組相比，干擾TGR5后，F(xiàn)N及TGF-β1的蛋白水平均異常升高( P＜0. 01，P＜0. 05)，遠(yuǎn)高于正常水平，說明TGR5在腎小球系膜細(xì)胞中確實(shí)可以阻止FN、TGF-β1的蛋白異常表達(dá)。

3　討論

Fig 3 Effects of TGR5 overpression on protein expression of FN and TGF-β1 in high glucose-treated rat glomerular mesangial cells

Fig 4 Effects of TGR5 knockdown on protein expression of FN and TGF-β1 in rat glomerular mesangial cells

大量研究表明，高糖可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)化生長因子的增加，促進(jìn)胞外基質(zhì)的堆積，是糖尿病腎病發(fā)生的重要原因［9，13］。大鼠腎小球系膜細(xì)胞是腎小球的主要功能細(xì)胞［14］，細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、細(xì)胞因子的分泌等都與之有關(guān)，在腎臟的生理功能和組織結(jié)構(gòu)的維護(hù)中有著重要作用［8］。在糖尿病狀態(tài)下，大鼠腎小球系膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1等細(xì)胞因子的表達(dá)增加、FN等細(xì)胞外基質(zhì)的大量積聚，促進(jìn)腎臟纖維化，導(dǎo)致系膜區(qū)擴(kuò)張，促成了糖尿病腎病的病理變化［7，9］。本研究利用高糖培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，F(xiàn)N及TGF-β1的蛋白水平相對于正常對照組明顯上升，成功模擬了體內(nèi)糖尿病腎病的環(huán)境。

TGR5可以被一定濃度范圍內(nèi)的鵝去氧膽酸( CDCA)，石膽酸( LCA)，膽酸( CA)，脫氧膽酸( DCA)等激活，但均無較好的特異性［15］。本研究采用半合成膽酸衍生物INT-777作為TGR5的激動劑，它毒性低，有較高的效價和選擇特異性，可以排除膽汁酸核受體FXR的影響［12］。此外，我們使用了過表達(dá)的方法，并在此基礎(chǔ)上再次使用該激動劑，進(jìn)一步增強(qiáng)了TGR5的功能，有效地降低了由高糖引起的FN、TGF-β1蛋白水平升高，而干擾TGR5引起這些指標(biāo)的異常上升則從功能缺失的角度更好地突顯了TGR5對于FN、TGF-β1蛋白表達(dá)的抑制作用。

對于糖尿病腎病的治療，目前多采取控制血糖、調(diào)節(jié)血脂等方法進(jìn)行綜合治療，缺乏特異有效的方法。采取有針對性的方法阻止糖尿病腎病的發(fā)生，探討其有效靶點(diǎn)，具有重要的意義。近年來發(fā)現(xiàn)，膽汁酸受體不僅參與膽汁酸的合成與代謝，而且在糖脂代謝以及能量消耗中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［1］。TGR5作為一種新型膽汁酸膜受體，其發(fā)揮的生理功能有待積極探索。本研究在大鼠腎小球系膜細(xì)胞中檢測到了TGR5的表達(dá)，并在使用不同方法干預(yù)TGR5之后，檢測了糖尿病腎病進(jìn)程中的重要指標(biāo)FN、TGF-β1的表達(dá)變化，證實(shí)了TGR5可以抑制高糖狀態(tài)下這兩者的異常升高，在糖尿病腎病進(jìn)程中可能發(fā)揮著重要的保護(hù)作用，有望成為該疾病的新靶標(biāo)，為治療提供了新的思路。

(致謝:本研究在中山大學(xué)藥學(xué)院藥理與毒理學(xué)實(shí)驗室完成，實(shí)驗室老師和同學(xué)在課題的設(shè)計、實(shí)驗的具體操作上均給予了大力的支持與幫助，在此表示衷心的感謝! )

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Regulatory effects of the bile acid membrane receptor TGR5 on FN and TGF-β1 in rat glomerular mesangial cells cultured under high glucose condition

XIONG Feng-xiao，YANG Zhi-ying，WANG Shao-gui，CHEN Cheng，HUANG He-qing
( Laboratory of Pharmacology and Toxicology，School of Pharmaceutical Science of Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510006，China)

Abstract:AimTo investigate the expression of G protein-coupled receptor TGR5 and its effects on FN and TGF-β1 expression cultured under high glucose condition in rat glomerular mesangial cells，and then tobook=37,ebook=46explore the role of TGR5 in diabetic nephropathy．Methods INT-777 and TGR5 plasmid were used to activate TGR5 under high glucose( HG，30 mmol·L－1glucose) condition，and anti-TGR5 small interfering RNA( TGR5 siRNA) was used to knock down TGR5．The protein expression of FN and TGF-β1 in rat mesangial cells was detected by Western blot．Results TGR5 could be detected in rat glomerular mesangial cells．Both FN and TGF-β1 protein levels could be increased by high glucose compared with control group( P＜0. 05)，and be inhibited by activiation of TGR5( P＜0. 05)．On the other hand，knockdown of TGR5 could increase FN and TGF-β1 protein to abnormal levels( P ＜0. 01，P＜0. 05)．ConclusionTGR5 suppresses HG-induced FN and TGF-β1 expression in rat glomerular mesangial cells，suggesting a protective role in the process of diabetic nephropathy．

Key words:G protein-coupled receptor; TGR5; high glucose; glomerular mesangial cells; fibronectin; transforming growth factor-β1; INT-777; diabetic nephropathy

作者簡介:熊鳳霄( 1990－)，女，碩士生，研究方向:中藥心血管及糖尿病藥理學(xué)，E-mail: xiongfx@ mail2．sysu．edu．cn;

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目( No 81373457) ;教育部博士點(diǎn)基金資助項目( No 20130171110097) ;廣東省自然科學(xué)基金資助項目( No S2013010015765，S2012020010991)

收稿日期:2015－09－16，修回日期: 2015－11－26

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0033－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．008