孟　遙，張冬玲，夏　泉，2，葛金芳，陳飛虎

(安徽醫(yī)科大學1．藥學院;2．第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽合肥　230032)

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4 -氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯對人白血病K562細胞的蛋白質組學研究

孟遙1，張冬玲1，夏泉1，2，葛金芳1，陳飛虎1

(安徽醫(yī)科大學1．藥學院;2．第一附屬醫(yī)院藥劑科，安徽合肥230032)

中國圖書分類號: R341; R329．25; R733．7; R977. 6; R979. 1

摘要:目的研究新型維甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯( 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate，ATPR)誘導人白血病K562細胞分化作用的蛋白質組學機制。方法1×10－6mol·L－1的ATPR及ATRA分別作用于人白血病K562細胞48 h后，收集細胞并提取總蛋白，純化之后使用胰蛋白酶酶解，固相萃取法脫鹽，高分辨率液相色譜質譜聯(lián)用儀檢測肽段，使用Proteome Discoverer 1. 2軟件尋找出差異表達的蛋白質，利用生物信息學DAVID數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫、STRING數(shù)據(jù)庫，分析鑒定出的差異蛋白質所具有的分子功能、所參與的生物學過程等信息。結果ATPR組特異性的蛋白質鑒定出120個，ATRA組特異性蛋白質有143個，兩者共有蛋白422個。DAVID分析顯示ATPR特異性蛋白質主要參與39個生物學過程，包括蛋白質和大分子的代謝、蛋白質轉運和定位等。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，ATPR組特異性蛋白質主要參與新陳代謝過程、PI3K-Akt信號通路、TGF-β信號通路等其他癌癥相關信號通路。STRING蛋白相互作用網絡分析顯示ATPR特異性蛋白質，如EIF3A、EIF6、RPL3、RPL8、RPL13、RPL7A、RPL21、RPS3、RPS14、NACA、BTF3、NHP2L1、PPP2CA蛋白與其他≥10個相關蛋白存在直接相互作用關系。結論ATPR組特異性中心蛋白質均參與對細胞生長增殖、誘導細胞分化和凋亡等過程的調控，這些蛋白質間的相互作用網絡及特異性中心蛋白質是ATPR誘導K562細胞分化作用的可能機制。

關鍵詞:4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯;全反式維甲酸;人白血病K562細胞;蛋白質組學;抑制增殖;誘導分化

陳飛虎( 1962－)，男，博士，教授，博士生導師，通訊作者，研究方向:抗炎免疫藥理學及分子藥理學，Tel: 0551-65161116，E-mail: cfhchina@ sohu．com

全反式維甲酸可誘導急性早幼粒細胞白血病( acute promyelocytic leukemia，APL)細胞分化成熟，療效明顯，其基本特點在于不直接殺傷腫瘤細胞而是誘導其分化為正?；蚪咏５募毎?。但由于ATRA會出現(xiàn)維甲酸綜合癥［1］、耐藥性［2］等問題使其在臨床上的應用受到了限制。本課題組以ATRA為先導化合物，通過對其碳鏈末端極性基團進行結構修飾，合成并經過體外藥效學篩選發(fā)現(xiàn)4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯( ATPR)具有較強的抑制腫瘤細胞增殖并誘導其分化的活性［3－7］。目前，ATPR已經申請自主知識產權(專利號: CN101591280、CN102008443A)，有望成為一種新型抗腫瘤藥物，為腫瘤患者帶來希望。

蛋白質組( proteome)的概念最先由Marc Wilkins在1994年提出的，是指由一個基因組，或一個細胞、組織表達的所有蛋白質。近年來蛋白質組學技術被廣泛應用到生命科學領域，并已成為尋找疾病分子標志和藥物靶點最有效的方法之一。本研究以人白血病K562細胞為研究對象，通過蛋白質組學的方法，研究ATPR與ATRA分別作用于K562細胞后蛋白質的表達變化情況，并通過生物信息學分析來解釋ATPR對K562細胞作用的特異性可能機制及分子靶點。

1　材料與方法

1．1材料4-氨基-2-三氟甲基苯基維甲酸酯( Fig 1)由安徽醫(yī)科大學藥學院合成，純度為99. 66%，用無水乙醇溶解成濃度為20 mmol·L－1的貯存液，－20℃避光保存。K562細胞株購自中科院上海細胞庫。RPMI 1640為Hyclone公司產品，小牛血清為杭州四季青公司產品。ATRA、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺為美國Sigma公司產品;總蛋白提取試劑盒購自Vazyme公司;蛋白純化試劑盒( 2D Clean-Up Kit)、蛋白定量試劑盒( 2D Quant Kit)購自GE healthcare; Trypsin Gold(貨號V5280)購自美國Promega公司;丙酮、乙腈、醋酸、甲醇、甲酸、三氟乙酸均為色譜級。高速冷凍離心機購自Beckman公司; ACCELA 600 Pump液相色譜和傅立葉變換靜電場軌道肼質譜( LTQ Orbitrap XL)購自美國Thermo fisher公司; Xcalibur 2．1軟件和Proteome Discoverer軟件購自美國Thermo公司。

Fig 1 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate structural formula

1．2細胞培養(yǎng)和加藥處理K562細胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640并加入青霉素1×105IU·L－1和鏈霉素100 mg·L－1的培養(yǎng)體系培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱，每2天更換1次細胞培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。隨機分為對照組、ATPR及ATRA組，ATPR和ATRA的終濃度均為1×10－6mol·L－1，培養(yǎng)箱中孵育48 h后收集細胞。

1．3制備蛋白質組學樣品離心收集細胞，加入500 μL細胞裂解液(臨用前加入2 μL蛋白酶抑制劑)，搖床震蕩15 min后，離心15 min，吸出上清液即為細胞總蛋白。蛋白定量后取含200 μg總蛋白的裂解液，加入4倍體積的丙酮過夜沉淀。離心收集沉淀后加入12. 5 μL復溶液(尿素7 mol，硫脲2 mol，3-［( 3-膽固醇氨丙基)二甲基氨基］-1-丙磺酸65 mmol)，完全溶解后加入87. 5 μL 50 mmol碳酸氫銨混勻。稀釋后的蛋白溶解液加入4 μL 100 mmol的二硫蘇糖醇，金屬浴50℃15 min;避光，加入4 μL 300 mmol的碘乙酰胺，放置15 min，加入4 μg胰酶(酶∶蛋白= 1∶50)混勻，于37℃恒溫水浴，孵育過夜。1 500×g離心2 min，收集液體。使用Strata-X柱樹脂脫鹽后收集洗脫液，于旋轉蒸發(fā)儀中干燥樣品。

1．4高效液相色譜－串聯(lián)質譜( ESI-LC-MS/MS)分析干燥后的樣品用30 μL 0. 1%甲酸溶解后進入ESI-LC-MS/MS檢測，流動相A為0. 1%甲酸水溶液，流動相B為100%乙腈溶液，180 min梯度洗脫樣品，過程為0～10 min，B相為10%; 10～110 min，B相從10%上升至40%; 110～140 min，B相從40%上升至95%; 140～165 min，B相維持95%; 165 ～170 min，A相從5%上升至90%; 170～180 min，A相維持90%。洗脫的肽段經納升級電噴霧離子源接口噴出，進入LTQ Orbitrap XL高分辨率質譜儀后分析。質譜掃描條件如下:采用數(shù)據(jù)依賴模式，在正離子模式下進行掃描，電噴霧電壓: 3. 8 kV;質量掃描范圍: 300～2 000;離子傳輸毛細管溫度為200℃;一級質譜Orbitrap分辨率: 60 000;母離子窗口: 2 u;串級質譜碰撞歸一化能量: 35。

1．5蛋白質鑒定和生物信息學分析對質譜輸出的原始文件通過Proteome Discovery 1. 2軟件進行Sequest搜索，數(shù)據(jù)庫為人源的蛋白序列數(shù)據(jù)庫，來源于ftp: / /ftp．uniprot．org/pub/databases/uniprot/ current_release/knowledgebase/proteomes/。檢索參數(shù)如下: M/Z為350～5 000 u，母離子容忍度為10 ppm，碎片離子容忍度為0. 8 u，肽段和蛋白質鑒定FDR均小于1%。利用生物信息學DAVID、KEGG、STRING數(shù)據(jù)庫，分析鑒定出的差異蛋白質所具有的分子功能、所參與的生物學過程等信息。

2　結果

2．1蛋白質的鑒定結果毛細管色譜柱分離樣品( Fig 2)，質譜鑒定顯示ATPR組共計542個蛋白質，ATRA組共計565個蛋白質。其中，ATPR組特異性的蛋白質有120個，ATRA組特異性的蛋白質有143個，ATPR和ATRA共有的蛋白質有422個( Fig 3)。

Fig 2 The total ion current of groups

2．2DAVID功能分析及KEGG通路分析結果使用DAVID數(shù)據(jù)庫分析ATPR、ATRA各自的特異性蛋白質所參與的生物進程( Fig 4)，ATPR特異性蛋白質參與39個生物學過程，主要有蛋白質和大分子的代謝、蛋白質轉運和定位、大分子和蛋白復合物組裝、翻譯、RNA剪接、氮化合物生物合成、核苷酸生物合成等生物學過程，ATRA特異性蛋白質參與了22個生物學過程，涉及到翻譯、激素代謝、9-順式維甲酸代謝過程、蛋白質折疊、核糖體小亞基的生物合成、細胞蛋白質代謝過程的負調控、蛋白復合物組裝、非編碼RNA代謝等過程。

Fig 3 Number of specific proteins in ATPR or ATRA groups and their common proteins

Fig 4 The biological processes involved in ATPR( A) or ATRA( B) specific proteins

同時，使用KEGG pathway對特異性蛋白質可能參與的信號通路進行分析發(fā)現(xiàn)，ATPR組蛋白質主要參與Metabolic pathways、Ribosome、RNA transport、 Spliceosome、Protein processing in endoplasmic reticulum、Purine metabolism、Parkinson’s disease、Proteoglycans in cancer、Pathways in cancer、PI3K-Akt signaling pathway、TGF-beta signaling pathway等信號通路，而ATRA組蛋白質則主要參與Ribosome、Metabolic pathways、RNA transport、Alzheimer’s disease、DNA replication、MAPK signaling pathway等信號通路。

2．3ATPR組特異性蛋白質的相互作用網絡分析

通過STRING在線工具分析ATPR特異性蛋白質間的蛋白－蛋白相互作用網絡( Fig 5)，結果顯示整個網絡里，同其他≥6個蛋白存在相互作用關系的至少有33個蛋白，其中以核糖體家族蛋白RPL3、RPL8、RPL13、RPL7A、RPL21、RPS3、RPS14、初期多肽相關復合體α亞基蛋白NACA、轉錄因子BTF3、真核翻譯起始因子家族蛋白EIF3A、EIF6、非組蛋白染色體蛋白NHP2L1、蛋白質磷酸酶PPP2CA蛋白與其他≥10個相關蛋白存在直接相互作用關系，為此蛋白相互作用網絡的中心蛋白，刪除這些中心蛋白后，互作網絡結構就變得比較渙散。

Fig 5 Protein-protein interaction map of ATPR group

3　討論

ATRA能夠明顯地抑制腫瘤細胞增殖并誘導其分化。但由于ATRA出現(xiàn)維甲酸綜合癥等問題，限制了其應用。課題組對ATRA進行結構修飾，合成了新型維甲酸衍生物ATPR。大量體內外研究表明［4～7］，新型維甲酸衍生物ATPR對多種腫瘤細胞具有一定的抑制增殖和誘導分化作用。前期研究［4］發(fā)現(xiàn)ATPR對K562細胞也具有抑制增殖和誘導分化作用。本研究通過對ATPR和ATRA分別作用于K562細胞后產生的蛋白質表達譜進行鑒定以及生物信息學分析，從整體上研究ATPR及ATRA 對K562細胞作用下蛋白質組學變化中的差異，研究ATPR特異性作用于K562細胞的分子機制和靶點。

DAVID數(shù)據(jù)庫分析結果說明，ATPR特異性蛋白質參與的生物學過程主要集中在蛋白質的組裝、翻譯、轉運和代謝，核苷酸的生物合成等方面，與ATRA特異性蛋白質涉及的過程存在差異性。同時，KEGG結果進一步證實ATPR組特異性蛋白質主要參與蛋白質處理，癌癥相關等通路，而ATRA組蛋白質則主要參與DNA復制和RNA轉運等通路。通過STRING數(shù)據(jù)庫分析ATPR特異性蛋白質的相互作用網絡，發(fā)現(xiàn)以EIF3A、EIF6、RPL3、RPL8、RPL13、RPL7A、RPL21、RPS3、RPS14、NACA、BTF3等蛋白為中心構成相互作用的網絡。

真核翻譯起始因子( eukaryotic initiation factor，EIF)是參與真核生物翻譯過程的重要蛋白超家族。許多研究［8］表明，真核啟動因子EIF3A不僅在蛋白質翻譯起始過程中起重要調控作用，還參與了細胞周期的調控，它與細胞的生長、分化和增殖存在著重要聯(lián)系。EIF3A可以調控核糖核苷酸還原酶M2亞基( ribo nucleotide reductase M2，RRM2)和周期依賴性激酶抑制因子p27kip( cyclin dependent kinase inhibitor p27，p27kip)等因子。Liu等［9］證實，EIF3A對鼠結腸上皮細胞的分化發(fā)揮著重要的作用。這說明，EIF3A在不成熟的細胞中有表達，并且其功能很可能是促進這些細胞向成熟階段分化。另外，EIF3A與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后緊密相關。何暉等［10］認為EIF3A的表達可能與腫瘤細胞的進展過程負相關;對于化療藥物干預的腫瘤細胞，EIF3A的高表達使腫瘤細胞不易產生耐藥，患者的預后更好。之后的研究中發(fā)現(xiàn)分化程度高的腫瘤中，EIF3A的表達高于低分化的腫瘤組織，此外，EIF3A高表達的患者減少了腫瘤轉移。根據(jù)本課題組前期研究［4］，ATPR可使細胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E表達量減少，周期蛋白依賴性激酶CDK2、CDK4、CDK6也有不同程度的減少，細胞周期依賴激酶抑制因子p27kip1表達變化不明顯而抑制因子p57kip2的表達量則明顯增加，提示ATPR很可能是通過EIF3A的表達調控細胞周期，并誘導細胞分化，EIF3A可能是ATPR抑制K562細胞增殖并誘導其分化的靶點之一。

真核啟動因子6( EIF6)又叫ITGB4BP、p27BBP，作為一種核基質，可轉移至細胞核中調控翻譯起始。Wnt信號通路調控細胞增殖和遷移、分化、凋亡等過程，其中β-catenin是關鍵分子。Wnt蛋白與Wnt配體結合后，會促使胞質內游離出β-catenin進入核內，與T細胞因子/淋巴細胞增強因子( T cell factor/ lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)結合，進而啟動下游靶基因或蛋白(如c-myc、cyclin D1)的表達。一旦Wnt信號通路激活，可促進細胞增殖而不進入分化。EIF6可以明顯下調Wnt/β-catenin信號通路的活性［11］。Wang等［12］發(fā)現(xiàn)EIF6高表達于分化后的細胞，提示可能參與癌細胞分化。結合本課題組前期研究ATPR誘導NB4細胞分化過程中［13］，cmyc蛋白表達與端粒酶逆轉錄酶hTERT的表達水平均呈下降趨勢，所以預測ATPR可能是通過EIF6表達來抑制c-myc蛋白從而抑制hTERT及端粒酶活性，最終誘導NB4細胞分化，提示EIF6可能是ATPR作用于K562細胞的靶點。

已有研究表明［14］，核糖體蛋白不僅參與蛋白質合成，而且還參與其他功能，如細胞生長、分化、凋亡等。核糖體蛋白( ribosomal protein)表達下調及功能不全可導致腫瘤的發(fā)生。作為核糖體大亞基蛋白，核糖體蛋白RPL3可通過p53來調控細胞周期和凋亡，RPL3可致細胞G1/S期阻滯或細胞凋亡［15］。核糖體蛋白RPL8已被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、黑色素瘤等腫瘤中表達［16］。核糖體蛋白RPL13參與調控抑癌基因等過程［17］。核糖體蛋白RPL7A則與細胞的生長、發(fā)育、分化有關，且其所在9號染色體往往在骨肉瘤中缺失［14］，Burris等［18］報道，RPL7A還能特異性結合維甲酸受體( retinoic acid receptor，RAR)。而作為核糖體小亞基蛋白，在臨床上，RPS3的異常表達與白血病、乳腺癌、肺癌等相關。郭恒西等［19］研究顯示下調RPS3表達，會造成細胞G2/M期及S期阻滯等。另外，Ebert等［20］報道，減少造血干細胞內核糖體小亞基蛋白RPS14表達，可導致造血干細胞向紅系分化受阻。本研究結果表明，ATPR作用后，可誘導K562細胞核糖體大小亞基蛋白RPL3、RPL8、RPL13、RPL7A、RPL21、RPS3、RPS14表達，而在ATRA組沒有誘導這些蛋白表達，提示這些核糖體亞基蛋白也可能是ATPR特異性發(fā)揮作用的靶標。

初期多肽相關復合體( nascent polypeptide-associated complex，NAC)是一種多功能的蛋白，其α亞基即NACA，能調控Fas相關死亡域蛋白( Fas associated with death domain protein，F(xiàn)ADD)等一系列相關的功能。Lopez等［21］研究了NACA在人體造血中的作用，發(fā)現(xiàn)NACA不僅能加快紅細胞的分化速度，還可以正向調控人紅細胞的分化。與NACA蛋白二聚化的對象為轉錄因子BTF3。Liu等［22］在胃癌SGC7901細胞中發(fā)現(xiàn)BTF3可使細胞發(fā)生G1期阻滯，下調BTF3導致細胞凋亡。還有研究［23］證實了蛋白質磷酸酶PPP2CA參與皮膚組織分化信號通路。

綜上所述，本研究結果表明，ATPR誘導的特異性中心蛋白質的改變均參與對細胞生長增殖、誘導細胞分化和凋亡等過程的調控，而ATRA作用下不具有這些蛋白質，這是兩者的差異性。另外，我們推斷，這些特異性蛋白質及其組建的相互作用網絡，是ATPR抑制K562細胞增殖并誘導其分化等作用的可能機制，而本研究也從整體上為ATPR誘導K562細胞分化作用的分子靶點提供理論基礎。

(致謝:本實驗在安徽醫(yī)科大學實驗室完成，衷心感謝導師陳飛虎教授對我的課題的悉心指導，感謝夏泉老師對我的課題及實驗的耐心傳授，感謝葛金芳老師課題的細心解答，感謝實驗室的同學們對我的實驗提供的幫助。)

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The proteomics research of 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate on human leukemia K562 cells

MENG Yao1，ZHANG Dong-ling1，XIA Quan1，2，GE Jin-fang1，CHEN Fei-hu1
( 1．College of Pharmacy，Anhui Medical University; 2．Dept of Pharmacy，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230032，China)

Abstract:AimTo explore the proteomics mechanism of the differentiation induction effect of 4-amino-2-trifluoromethyl-phenyl retinate( ATPR) on human leukemia K562 cells．Methods Human leukemia K562 cells were incubated with the same concentration ( 1×10－6mol·L－1) of ATPR or ATRA for 48 hours．The total cell proteins were collected，purified and digested by trypsin，solid phase extraction，and the peptides were detected by ESI-LC-MS/MS．The difference of the protein expression between the cells treated with ATPR and ATRA was compared by using the Discoverer Proteome 1. 2 software，and the molecular function，the biological process and other information of those proteins were analyzed based on the DAVID，KEGG，STRING databases．Results120 specific proteins were identified only in the ATPR group，143 only in the ATRA group，and 422 other proteins in both groups．Results of DAVID analysis showed that ATPR-induced specific proteins were mainly involved in 39 biological processes of proteins and macromolecules metabolism，protein transport and localization and so on．Results of KEGG analysis revealed that ATPR-induced proteins participated in signal pathways，mainly metabolic pathways，PI3K-Akt signal pathway，TGF-beta signal pathway and other pathways in cancer．String protein interaction network analysis displayed that ATPR-induced proteins，like EIF3A，EIF6，RPL3，RPL8，RPL13，RPL7A，RPL21，RPS3，RPS14，NACA，BTF3，NHP2L1，PPP2CA proteins had direct interactions with more than or equal to 10 associated proteins．ConclusionThe differentiation induction effect of ATPR on K562 cells might be ascribed to the ATPR-induced proteins interaction network and the specific central proteins it induced，which are involved in the regulation of cell proliferation，differentiation and apoptosis．

Key words:ATPR; ATRA; human leukemia K562 cells; proteomics; inhibition of proliferation; induced differentiation

作者簡介:孟遙( 1991－)，女，碩士生，研究方向:藥學，E-mail: mengyaochina@ gmail．com;

基金項目:國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項( No 2011 ZX09401-021)

收稿日期:2015－10－27，修回日期: 2015－11－16

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0027－06

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．007