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        姜黃素與順鉑聯(lián)合應用對胃癌SGC-7901的體外抑制作用

        2016-03-19 00:49:29范雙娜
        實用藥物與臨床 2016年2期
        關鍵詞:姜黃胃癌化療

        范雙娜,盧 潔

        浙江省舟山醫(yī)院藥劑科,浙江 舟山 316021

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        姜黃素與順鉑聯(lián)合應用對胃癌SGC-7901的體外抑制作用

        范雙娜,盧潔

        浙江省舟山醫(yī)院藥劑科,浙江 舟山 316021

        [摘要]目的觀察姜黃素、順鉑對胃癌SGC-7901細胞的生長抑制作用,并探究其機制。方法體外培養(yǎng)胃癌SGC-7901細胞,姜黃素、順鉑分別單獨應用及聯(lián)合應用后,采用MTT法檢測細胞凋亡情況;RT-PCR檢測T-Akt、p-Akt、p53 mRNA表達水平的變化;Western blot檢測Bcl-2蛋白表達水平變化。結果MTT結果顯示,姜黃素、順鉑均可抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖,且呈濃度和時間依賴性(P<0.05),且聯(lián)合組腫瘤細胞的凋亡率明顯高于單藥組(P<0.01);RT-PCR檢測顯示,與單獨給藥組相比,聯(lián)合用藥在顯著上調T-Akt和p53 mRNA表達的同時,降低p-Akt mRNA的表達(P<0.01)。Western blot結果顯示,單獨給藥、聯(lián)合用藥均能降低SGC-7901細胞中Bcl-2蛋白的表達。結論姜黃素與順鉑均能通過誘導細胞凋亡,抑制胃癌SGC-7901細胞生長,聯(lián)合用藥抑制SGC-7901細胞的增殖可能是通過抑制p-Akt基因、Bcl-2蛋白表達,同時上調T-Akt和p53基因的表達來實現的。

        [關鍵詞]胃癌SGC-7901細胞;順鉑;姜黃素;T-Akt;p-Akt;p53;Bcl-2

        0引言

        胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,因其高死亡率而備受關注。目前臨床使用的化療藥物如順鉑對胃癌有一定療效,但由于存在較嚴重的毒副作用,可導致患者身體無法耐受而影響臨床治療效果。因此,尋找更有效、毒副反應更輕的治療方案是迫切需要解決的問題。姜黃素(Curcumin)是一種酚類色素,是中藥姜黃的主要活性成分之一,因其所具有的抗炎、抗氧化、促進細胞凋亡、抗腫瘤等作用,在多種惡性腫瘤(如肝癌、胃癌、肺癌等)的治療中均發(fā)揮了重要作用[1-4]。目前姜黃素與化療藥物聯(lián)合應用對胃癌的作用研究較少,本文擬探討姜黃素與化療藥物-順鉑的相互作用關系,為臨床應用提供實驗室依據。

        1材料與方法

        1.1儀器和試劑HEPA二氧化碳培養(yǎng)箱:美國Thermo公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT):美國Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)液:美國Gibco公司;小牛血清(FBS):杭州天杭生物科技有限公司;胰酶:美國Sigma公司;二甲基亞砜(DMSO):分析純,天津市永大化學試劑有限公司;兔抗人Bcl-2單抗購自Abcam公司;SYBR Green 熒光定量試劑盒:杭州寶賽生物公司;細胞株:胃癌SGC-7901細胞,購自南京凱基生物科技有限公司。

        1.2SGC-7901細胞培養(yǎng)胃癌SGC-7901細胞用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液(含雙抗),于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng),每2 d更換培養(yǎng)液,以0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化細胞并傳代,所有實驗均在細胞對數生長期進行。

        1.3姜黃素溶液的配制取少量DMSO溶解姜黃素粉末,使制成濃度為10 mg/mL的儲備液,于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.4MTT 測定

        1.4.1不同濃度姜黃素干預不同時間對SGC-7901細胞增殖的影響收集對數生長期的SGC-7901細胞,棄舊培養(yǎng)液,洗滌,0.25%胰蛋白酶消化后計數,收集并用RPMI-1640培養(yǎng)液調整細胞濃度為1×105個/mL,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔150 μL,置CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng);正常培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后,分別設空白對照組(不加藥物的培養(yǎng)基)、藥物組,每組8個復孔。藥物組為含有不同濃度姜黃素的培養(yǎng)液,姜黃素濃度分別為5、10、20、40、80 μg/mL。置37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、48 h后,每孔加MTT 20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出,傾去孔內液體,每孔加200 μL DMSO,充分振蕩混勻使結晶物充分溶解,于酶標儀570 nm處測定各孔吸收值(A),空白孔調零,以正常組吸收值為對照,取平均值,計算各孔細胞抑制率(Inhibitory rate,IR%)=(1-實驗組/正常組)×100%。

        1.4.2不同濃度順鉑干預不同時間對SGC-7901細胞增殖的影響設順鉑組終濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μg/mL。其余實驗步驟同“1.4.1”。

        1.4.3姜黃素與順鉑聯(lián)合應用干預不同時間對SGC-7901細胞增殖的影響取對數生長期的SGC-7901細胞消化后,制成1×105個/mL細胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔150 μL,培養(yǎng)24 h后,根據“1.4.1”與“1.4.2”的實驗結果,選擇適宜濃度的姜黃素與順鉑聯(lián)合給藥。分別設空白對照組、聯(lián)合給藥組。其余實驗步驟同“1.4.1”。

        1.5RT-PCR檢測細胞內T-Akt、p-Akt、p53 mRNA水平收集并調整細胞濃度為5×105個/mL,接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,設正常組、姜黃素組、順鉑組、聯(lián)合給藥組,培養(yǎng)48 h后,收集各組細胞,按照Trizol試劑說明書提取細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA,之后進行PCR反應。引物設計見表1。

        表1 擴增用的引物序列

        1.6Western blot 檢測MMP-2蛋白的表達收集并調整細胞濃度為5×105個/mL,接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,設空白對照組、藥物組,培養(yǎng)48 h后,收集各組細胞,提取各組細胞總蛋白,BCA法進行蛋白定量,將蛋白樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔后電泳,轉膜,封閉液室溫封閉2 h,加入一抗(1∶500),4 ℃孵育過夜,洗膜后加入二抗室溫孵育2 h,滴加ECL液沖洗顯色檢測Bcl-2蛋白條帶。同時以β-actin作為內參照。

        2結果

        2.1姜黃素對SGC-7901細胞生長抑制作用不同濃度姜黃素干預SGC-7901細胞12、24、48 h后,SGC-7901細胞的生長繁殖均受到不同程度的抑制,抑制程度呈濃度、時間依賴性。見表2。由表2可見,與空白組比較,5 μg/mL姜黃素作用24 h后,SGC-7901細胞活力明顯受到抑制(P<0.05),達17.4%;作用48 h后,抑制作用更加顯著(P<0.01),達32.3%;姜黃素濃度為80 μg/mL時,作用48 h后,抑制作用更加顯著(P<0.01),達76.9%。結果顯示,隨著姜黃素濃度的增加及作用時間的延長,SGC-7901細胞的損傷程度越明顯。

        表2 不同濃度姜黃素對SGC-7901細胞生長抑制作用(n=8)

        注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01

        2.2化療藥物對SGC-7901細胞的生長抑制作用隨著化療藥物濃度的增加及作用時間的延長,SGC-7901細胞的生長均受到不同程度的抑制,0.5 μg/mL順鉑作用24 h后,SGC-7901細胞活力明顯受到抑制(P<0.05),達21.2%;8.0 μg/mL順鉑作用48 h后,抑制作用更加顯著,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),達77.3%,且呈劑量、時間依賴性。見表3。

        表3 不同濃度順鉑對SGC-7901細胞生長抑制作用(n=8)

        注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01

        2.3聯(lián)合用藥對SGC-7901細胞生長抑制作用姜黃素(10 μg/mL)與順鉑(2.0 μg/mL)聯(lián)合作用于SGC-7901細胞,隨著作用時間的延長,SGC-7901細胞的增殖明顯受到抑制,且與單獨應用姜黃素和順鉑相比,聯(lián)合用藥對SGC-7901細胞增殖的抑制作用更加顯著(P<0.01)。見表4。

        2.4T-Akt、p-Akt和p53 mRNA表達水平的變化姜黃素、順鉑及兩者聯(lián)合處理SGC-7901細胞48 h后,RT-PCR結果表明,給藥組p-Akt mRNA隨濃度增加呈現出下降趨勢,而T-Akt、p53呈上升趨勢。見圖1。姜黃素組、順鉑組及聯(lián)合用藥組p-Akt mRNA表達水平分別是空白組的(0.72±0.21)、(0.51±0.22)、(0.33±0.13)倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);T-Akt mRNA表達水平分別是空白組的(1.29±0.31)、(1.35±0.43)、(1.9±0.11)倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);p53 mRNA表達水平分別是空白組的(1.38±0.08)、(1.53±0.43)、(2.85±0.39)倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與單獨用藥組相比,聯(lián)合用藥組T-Akt、p-Akt和p53 mRNA表達差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.01)??傊S素聯(lián)合順鉑給藥可以下調SGC-7901細胞p-Akt mRNA的表達,上調p53和T-Akt mRNA的表達量。結果表明,姜黃素聯(lián)合順鉑對SGC-7901細胞p-Akt和p53 mRNA表達量的影響有可能通過調節(jié)Akt的活性來實現。

        表4 聯(lián)合用藥對SGC-7901細胞的生長抑制作用(n=8)

        注:與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與聯(lián)合用藥組比較,#P<0.05,##P<0.01

        圖1 RT-PCR檢測p-Akt、T-Akt及p53的mRNA 表達水平的變化

        2.5藥物干預對SGC-7901細胞中Bcl-2蛋白表達的影響姜黃素、順鉑及聯(lián)合用藥分別作用于SGC-7901細胞48 h后,均可使Bcl-2 蛋白表達水平下降,與空白組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);聯(lián)合用藥組與單獨用藥組比較,Bcl-2蛋白表達差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖2。

        圖2 藥物干預對SGC-7901細胞中Bcl-2蛋白表達的影響

        3討論

        腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多步驟、多基因突變累積的結果,細胞凋亡調控機制失常是引發(fā)腫瘤的重要原因。細胞凋亡分為內源性途徑和外源性途徑,兩個途徑均在細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用,是抗腫瘤藥物誘導腫瘤細胞死亡最常見的形式。細胞凋亡與激活某些基因的表達及調控信號通路密切相關,促進細胞凋亡可有效抑制腫瘤生長[5-6]。因此,通過調控基因及信號通路已成為抗腫瘤研究的新方向。

        PI3K/Akt是人體細胞內重要的信號轉導通路之一,廣泛參與細胞的各項生理病理功能活動。PI3K/Akt通路的活化在腫瘤發(fā)生中表現為抑制細胞凋亡。p-Akt是Akt的功能活化狀態(tài),Akt只有在活化狀態(tài)時才具有生物學功能?;罨腁kt可以進一步活化促凋亡蛋白Bax等,釋放抗凋亡蛋白,增加胞漿中游離的抗凋亡蛋白Bcl-2的量[7]。Bcl-2和Bax基因均是一類癌基因家族成員,與腫瘤細胞的凋亡密切相關[8]。Bax是Bcl-2的同源基因,可與Bcl-2形成異源二聚體,促進凋亡[9]。Bcl-2/Bax比值維持在一定的范圍可以維持內環(huán)境的穩(wěn)定,當受到一定的外來刺激時可引起DNA損失,Bcl-2/Bax比值明顯上升,最終導致細胞凋亡[10]。一些化療藥物正是通過抑制Bcl-2和/或上調Bax基因表達發(fā)揮抗腫瘤效應。p53基因是重要的抑癌基因,p53蛋白磷酸化后即被激活,磷酸化p53蛋白通過調控細胞周期及誘導細胞凋亡發(fā)揮抑癌作用[11]。在臨床上對惡性腫瘤的治療多采用聯(lián)合用藥方案,以期減少用藥量,進而降低毒副作用。有研究表明,姜黃素可抑制腫瘤細胞的增殖,其抗腫瘤作用主要與其抑制腫瘤細胞增殖、轉移,誘導腫瘤細胞凋亡有關[12]。MTT結果表明,姜黃素、順鉑均能夠顯著抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖,并且隨著藥物濃度、作用時間的增加,姜黃素、順鉑對SGC-7901 細胞的抑制逐漸增強,姜黃素濃度達10 μg/mL時,作用12、24、48 h后,細胞凋亡率分別為11.2%、21.3%、40.6%;順鉑濃度達2.0 μg/mL時,作用12、24、48 h后,細胞凋亡率分別為28.9%、35.6%、47.0%。而姜黃素和順鉑聯(lián)合應用后細胞的凋亡率顯著增高,作用24、48 h后,SGC-7901 細胞凋亡率分別為55.7%、67.8%,說明聯(lián)合用藥可協(xié)同抑制胃癌細胞的增殖。本研究通過RT-PCR檢測p-Akt、T-Akt和p53 mRNA的表達,姜黃素組、順鉑組及聯(lián)合用藥組p-Akt mRNA表達水平分別是空白組的(0.72±0.21)、(0.51±0.22)、(0.33±0.13)倍;T-Akt mRNA表達水平分別是空白組的(1.29±0.31)、(1.35±0.43)、(1.90±0.11)倍;p53 mRNA表達水平分別是空白組的(1.38±0.08)、(1.53±0.43)、(2.85±0.39)倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與單獨用藥組、空白組比較,聯(lián)合用藥組p-Akt mRNA的表達明顯降低,p53和T-Akt mRNA的表達增高;Western blot檢測結果顯示,與單獨用藥組比較,聯(lián)合用藥組Bcl-2蛋白的表達顯著下調。結果表明,誘導SGC-7901細胞發(fā)生凋亡可能是姜黃素和順鉑聯(lián)合抑制胃癌細胞增殖的作用機制之一。

        總之,本研究結果表明,將姜黃素與化療藥物聯(lián)合使用,不僅可降低化療藥物的使用量,降低毒副反應,還能達到滿意的療效,這一發(fā)現為姜黃素應用于臨床提供了理論支持,而兩藥聯(lián)合應用抗胃癌的作用機制則需進行更深入的研究。

        參考文獻:

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        Inhibitory effect of curcumin combined with cisplatin on the proliferation of gastric cancer cells SGC-7901invitroFAN Shuang-na,LU Jie (Department of Pharmacy,Zhoushan Hospital,Zhoushan 316021,China)

        [Abstract]ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of curcumin combined with cisplatin on the proliferation of gastric cancer cells SGC-7901.MethodsSGC-7901 cells were cultured in vitro. The single use of curcumin and cisplatin and the combination use were applied on gastric cancer cells SGC-7901 respectively. The inhibitory rate of cells was measured by MTT assays. T-Akt,p-Akt and p53 mRNA expression levels were tested by real time PCR. Bcl-2 protein level was detected by Western blot.ResultsThe viability of SGC-7901 cells was reduced by curcumin and cisplatin in a concentration-/time-dependent manner (P<0.05). The tumor cell apoptosis rate of combination group was significantly higher than those of single drug groups (P<0.01). RT-PCR results showed that the expression levels of T-Akt and p53 mRNA in combination group were higher than those of single drug groups,while the expression level of p-Akt mRNA was lower. Expression levels of Bcl-2 protein in SGC-7901 cells of the three groups decreased.ConclusionBoth curcumin and cisplatin can inhibit the SGC-7901 cells growth by inducing apoptosis of cells. The inhibition on the proliferation of SGC-7901 cells treated by curcumin combined with cisplatin in vitro may be induced by inhibiting the expression of p-Akt gene and Bcl-2 protein,enhancing the expression of T-Akt and p53 gene.

        Key words:Gastric cancer cells SGC-7901;Cisplatin;Curcumin;T-Akt;p-Akt;p53;Bcl-2

        DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201602002

        收稿日期:2015-05-25

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