何培新，吳雙雙，許春平（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

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楊樹桑黃胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化及形態(tài)學(xué)研究

何培新，吳雙雙，許春平*
（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

摘要：采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了楊樹桑黃搖瓶產(chǎn)胞外多糖（EPS）的培養(yǎng)條件，并研究了優(yōu)化培養(yǎng)基中菌絲體的形態(tài)變化。單因素試驗結(jié)果表明，楊樹桑黃產(chǎn)EPS的最適生長周期為8 d，最佳碳源、氮源和無機鹽分別為蔗糖、玉米粉和KH2PO4，最適環(huán)境條件為溫度28℃，pH7。在此基礎(chǔ)上，選用碳源、氮源和無機鹽3個因素，應(yīng)用正交試驗優(yōu)化出楊黃產(chǎn)EPS的最佳培養(yǎng)基配方為：40 g/L蔗糖，4 g/L玉米粉，4 mmol/L KH2PO4。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，胞外多糖產(chǎn)量為0.352g/L。優(yōu)化培養(yǎng)基的形態(tài)學(xué)結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，菌絲球逐漸增大，平均直徑、緊密度均逐漸增加，圓度先增加后急劇減小，粗糙度與圓度呈負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)為先減小后增加的趨勢。

關(guān)鍵詞：楊樹桑黃；優(yōu)化；胞外多糖；形態(tài)學(xué)

楊樹桑黃即瓦尼木層孔菌（Phellinus vaninii Ljup），又名楊黃，屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomyeotina），層菌綱（Hymenomycetes），非褶菌目（Aphyllophorales），銹革孔菌科（Hymenochaetaceae），木（針）層孔菌屬（Phellinus）[1]，有“森林黃金”之美稱。瓦尼木層孔菌以生長在天然林中老齡的楊樹上，且子實體孔口表面呈黃色菌蓋邊緣為黃色帶狀環(huán)紋而得名[2]，人工林中很難找到。該菌具有抗腫瘤、抗炎、抗血管生成活性等多種藥理作用[3-5]。2005年以來，人們對瓦尼木層孔菌的馴化栽培已經(jīng)獲得成功[6-8]，但是關(guān)于瓦尼木層孔菌活性物質(zhì)提取的研究相對較少，鮮有與其多糖相關(guān)的報道。

本文主要優(yōu)化楊樹桑黃發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)胞外多糖條件，進(jìn)行菌株的活化培養(yǎng)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以EPS產(chǎn)量為觀察指標(biāo)，采用正交試驗優(yōu)化碳源、氮源等人工培養(yǎng)條件，并研究了其形態(tài)學(xué)。研究結(jié)果為楊樹桑黃胞外多糖的產(chǎn)品開發(fā)奠定了扎實的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，對其他真菌的相關(guān)研究也具有一定的借鑒價值。

1材料和方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種

楊樹桑黃：來源于鄭州輕工業(yè)學(xué)院發(fā)酵工程研究室，于斜面培養(yǎng)基上4℃保存。

1.1.2主要儀器

ΜV-17001C紫外分光光度計：上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；SFLY-100B臺式小容量恒溫培養(yǎng)搖床、DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海申賢恒溫設(shè)備廠；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-III循環(huán)水多用真空泵：西安太康生物科技有限公司；Nikon E-100顯微鏡（配有DT2000圖像分析軟件）：尼康儀器有限公司。

1.1.3試劑

葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、牛肉膏、蛋白胨、多價胨、胰蛋白胨、玉米粉、酵母粉、尿素、（NH4）2SO4、NaNO3、FeSO4、CuSO4、MgSO4、CaCl2、K2HPO4、NaCl、HCl、NaOH、乙醇、濃硫酸、苯酚均為分析純，購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：200 g去皮土豆，20 g葡萄糖，108 g瓊脂，蒸餾水補至1 000 mL，pH自然。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：30 g葡萄糖，3 g蛋白胨，蒸餾水補至1 000 mL，pH自然。

1.2方法

1.2.1菌種活化

將保存的試管斜面菌種轉(zhuǎn)接PDA平板，26℃恒溫培養(yǎng)7 d。

1.2.2種子液的制備

用打孔器打取活化好的真菌菌絲塊（約1cm2）兩塊接入含50 mL種子培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，搖瓶轉(zhuǎn)速為160 r/min，于26℃振蕩搖床中培養(yǎng)4 d。然后加入無菌玻璃珠，置于磁力攪拌器上將菌絲球打碎后備用。

1.2.3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[9-10]

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1.02g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻，即為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液。精確量取1 mL母液移至100 mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，即為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分別置于具塞試管中，分別補蒸餾水至1 mL，再各加入5 %的苯酚水溶液1 mL和濃硫酸5 mL振蕩搖勻，先在沸水浴中15 min，取出后立即置于冰水浴中15 min。以加入0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)液作為空白對照調(diào)零，于490 nm下測各反應(yīng)液的吸光度值，回歸分析數(shù)據(jù)。

1.2.4菌絲干重和EPS產(chǎn)量的測定

用抽濾法[11]將菌絲和發(fā)酵液分離，將濾紙和菌絲置于70℃的烘箱烘至干燥后稱量，除去濾紙干重即為菌絲干重。

菌絲體含量（g/L）=菌絲干重（g）/發(fā)酵液體積（mL）×1 000

把發(fā)酵液濃縮后加入4倍乙醇，置于4℃冰箱過夜處理，第2天把處理液放在轉(zhuǎn)速為10 000 r/min離心機中離心15 min后棄去上清，用蒸餾水溶解沉淀定容至250 mL，然后用苯酚硫酸法[12]測發(fā)酵液中的多糖含量。

1.2.5最適生長周期的確定

將楊樹桑黃培養(yǎng)14 d，每隔2天測定其菌絲干重和EPS產(chǎn)量。

1.2.6單因素試驗確定最佳搖瓶培養(yǎng)條件

碳源優(yōu)化試驗：分別用30 g/L的果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、木糖代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，26℃、160 r/min培養(yǎng)，測其菌絲干重和胞外多糖產(chǎn)量。

氮源優(yōu)化試驗：采用以上的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以3 g/L牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米粉、酵母粉、尿素、（NH4）2SO4、NaNO3為氮源，26℃、160 r/min培養(yǎng)，測其菌絲干重和胞外多糖產(chǎn)量。

無機鹽優(yōu)化試驗：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加5 mmol/L的MgSO4、KH2PO4、CuSO4、NaCl、CaCl2、FeSO4，以不加無機鹽的為空白，26℃、160 r/min培養(yǎng)，測其菌絲干重和胞外多糖產(chǎn)量。

pH試驗：使用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10，26℃，160 r/min培養(yǎng)，測其菌絲干重和EPS產(chǎn)量。

溫度試驗：將接種好的培養(yǎng)基分別置于24、26、28、30、32℃搖床中，160 r/min培養(yǎng)，測定不同溫度條件下楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產(chǎn)量。

1.2.7正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗確定楊樹桑黃在搖瓶培養(yǎng)中獲得最高EPS產(chǎn)量的條件。為了綜合確定培養(yǎng)基中碳源、氮源和無機鹽的最佳濃度組合，本試驗設(shè)計了L9（34）正交表，各因素和水平詳見表1。

表1正交試驗的因素和水平Table 1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.8形態(tài)學(xué)研究

每兩天取一次優(yōu)化培養(yǎng)基中的菌絲球，顯微鏡下拍攝菌絲球形態(tài)后，通過DT2000圖像分析軟件分析，根據(jù)菌絲球的平均直徑、菌核面積、菌絲球面積、菌絲球周長、圓度等參數(shù)計算出緊密度、粗糙度。公式如下所示：緊密度=菌核面積/菌絲球面積；粗糙度=（菌絲球的周長）2/（菌絲球面積×4）[13]。菌絲球染色時，先加入與發(fā)酵液等體積的固定劑和少許染色劑，4℃冰箱放置1 d，然后用蒸餾水多次沖洗染色的菌絲體，將其放在載玻片上，待晾干后在40倍下顯微拍照。

2試驗結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以葡萄糖濃度對吸光度的影響變化繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y = 8.428 33x - 0.055 6，相關(guān)系數(shù)R2= 0.999 3。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2最適生長周期的確定

在培養(yǎng)時間內(nèi)，每2天測量一次楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產(chǎn)量，用sigmaplot軟件做圖。培養(yǎng)時間對楊樹桑黃菌絲干重和EPS產(chǎn)量的影響見圖2。隨著培養(yǎng)時間的增加，楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產(chǎn)量均有所增長，但第8天以后菌絲干重仍在增加，而EPS產(chǎn)量明顯下降，這可能是由于菌絲量達(dá)到一定生長高峰期后，多糖成分作為養(yǎng)分供應(yīng)菌絲增長而被消耗[14]。綜合考慮，確定楊樹桑黃的生長周期為8 d，此時胞外多糖的產(chǎn)量最高。

2.3最佳碳源的優(yōu)化

碳源對楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產(chǎn)量均有顯著影響，結(jié)果如圖3所示。

圖2培養(yǎng)時間對楊樹桑黃菌絲干重和EPS產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of culture time on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

圖3碳源對楊樹桑黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of carbon source on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

楊黃對葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖的利用率均較好，以葡萄糖為碳源時菌絲生物量最高，但EPS產(chǎn)量低于蔗糖的，綜合考慮，確定最佳碳源為蔗糖。

2.4最佳氮源的優(yōu)化

氮源對楊樹桑黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響見圖4。

圖4氮源對楊樹桑黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

由圖4可以得出，以玉米粉為氮源時，楊樹桑黃的菌絲干重和EPS產(chǎn)量均達(dá)到最大值，其次是酵母粉，且一般無機氮源不利于菌株的生長，有機氮源利于菌株的生長和胞外多糖的積累[15]。綜合考慮，確定最佳氮源為玉米粉[16]。

2.5最佳無機鹽的優(yōu)化

培養(yǎng)基中添加不同的無機鹽，目的為了增加菌絲干重和EPS產(chǎn)量。無機鹽對楊樹桑黃菌絲干重及胞外多糖產(chǎn)量的影響見圖5。

圖5無機鹽對楊樹桑黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inorganic salt on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

可以得出，添加無機鹽較沒有添加的多糖產(chǎn)量高，菌絲干重沒有明顯變化。添加MgSO4時楊樹桑黃的菌絲生物量達(dá)到最大，但添加KH2PO4時，EPS產(chǎn)量顯著增加，故選擇KH2PO4作為最適宜生長的無機鹽添加應(yīng)用。

2.6最適培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

選取5個溫度梯度，24、26、28、30、32℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測菌絲干重和EPS產(chǎn)量，結(jié)果見圖6。

圖6培養(yǎng)溫度對楊樹桑黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of culture temperature on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

可以得出，26℃時楊樹桑黃的菌絲產(chǎn)量最高，28℃~ 32℃菌絲干重沒有明顯的變化。而EPS產(chǎn)量在28℃時增加至最大值，以目標(biāo)產(chǎn)物為指標(biāo)，選取28℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.7培養(yǎng)基初始pH的優(yōu)化

培養(yǎng)基中pH的變化對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用、細(xì)胞的生長、EPS產(chǎn)量都有著很大的影響。以液體種子培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其他條件保持不變，培養(yǎng)基pH分別為3、4、5、6、7、8，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，確定最適pH，結(jié)果見圖7。

圖7培養(yǎng)基初始pH對楊黃菌絲干重及EPS產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of medium initial pH on mycelial dry weight and EPS production by Phellinus vaninii Ljup

可以得出，楊樹桑黃菌絲生長的最適pH為6.0，產(chǎn)胞外多糖的最適pH為7.0。

2.8正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，碳源選擇蔗糖，氮源選擇玉米粉，無機鹽選擇KH2PO4，進(jìn)行正交試驗考察，結(jié)果見表2。

表2楊樹桑黃正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test results of Phellinus vaninii Ljup

分析表2可知，以菌絲干重和EPS產(chǎn)量為指標(biāo)，影響因素的主次順序均為A＞C＞B，最優(yōu)組合為A3C1B3。表2 的9組試驗組合中沒有最優(yōu)組合為A3C1B3，因此選擇該組合進(jìn)行追加驗證試驗，獲得最佳條件下的胞外多糖產(chǎn)量為0.352g/L。楊樹桑黃的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為40g/L蔗糖，4 g/L玉米粉，4 mmol/L KH2PO4。

2.9形態(tài)學(xué)

在優(yōu)化培養(yǎng)基中，不同發(fā)酵時間的楊黃菌絲球形態(tài)變化和菌絲球平均直徑、圓度、緊密度和粗糙度的變化見圖8和圖9。

圖8楊樹桑黃隨發(fā)酵時間的形態(tài)變化（放大倍數(shù)40）Fig.8 The morphological changes of Phellinus vaninii Ljup during fermentation time（magnification 40）

圖9楊樹桑黃的形態(tài)學(xué)指標(biāo)Fig.9 The morphological indexs of Phellinus vaninii Ljup

由圖8可以看到，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌絲球逐漸增大，第2天已有明顯的菌核，外圍菌絲持續(xù)生長。到第6天菌絲生長最旺盛，發(fā)酵后期菌核較為致密，菌絲逐漸減少，這可能是由于發(fā)酵后期，菌絲生長到了穩(wěn)定期。菌絲球的直徑和緊密度隨著時間的延長均逐漸增加（圖9A和9C），圓度呈先增加后減小的趨勢，初期圓度小可能與發(fā)酵初期菌絲球為絲狀體有關(guān)，隨著發(fā)酵時間的增加，外圍菌絲增加圓度急劇下降（圖9B）。菌絲球的粗糙度（圖9D）先減小后增加，與圓度呈負(fù)相關(guān)。

3　結(jié)論

本研究結(jié)果表明：楊樹桑黃產(chǎn)胞外多糖的最優(yōu)環(huán)境條件為溫度28℃、pH 7、搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，最適生長周期為8 d，最佳碳源、氮源和無機鹽分別是蔗糖、玉米粉和KH2PO4。正交試驗優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基組合為：40 g/L蔗糖，4 g/L玉米粉，4 mmol/L KH2PO4，獲得的胞外多糖產(chǎn)量為0.352 g/L。優(yōu)化培養(yǎng)基中，菌絲球隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增大，其平均直徑、緊密度均逐漸增加，圓度先增加后急劇減小，粗糙度與圓度呈負(fù)相

參考文獻(xiàn)：

[1]戴玉成．一種新的藥用真菌一瓦尼木層孔菌(楊黃)[J].中國食用菌,2003,22(5):7-8

[2]胡偉,王春生,張晶.楊黃代用料栽培初探[J].中國林副特產(chǎn),2007, 86(1):12-13

[3] Huang H Y,Chieh S Y,Tso T K, et al．Orally Administered Mycelial Culture of Phellinus Linteus Exhibits Antitumor Effects in Hepatoma Cell-Bearing Mice[J]. Iournal of Ethnopharmacology, 201l, 133(2):460-466

[4] Kim B C,Choi J W,Hong H Y,et al．Heme Oxygenase-l Mediates the Anti-Inflammatory Effect of Mushroom Phellinus Linteus in LPSStimulated RAW264.7 Macrophages[J]. Journal of Ethnopharmacol -ogy, 2006, 106(3):364-371

[5] Lee Y S, Kim Y H, Shin E K, et al．Anti-Angiogenic Activity of Methanol Extract of Phellinus Linteus and Its Fractions[J].Journal of Ethnopharmacology,2010,131(1):56-62

[6]劉作喜,王漢生,劉珊紅,等.楊黃栽培與管理技術(shù)[J].中國食用菌, 2005,24(5):28-29

[7]范宇光,秦立武,吳秀玲,等.瓦尼木層孔菌及其人工栽培技術(shù)[J].中國食用菌,2009,28(2):24-25

[8]李延生,趙婷,陳艷秋,等.瓦尼木層孔菌菌絲培養(yǎng)特性初探[J].食用菌,2008(4):7-8

[9]余曉雷,張可,鄭旭健．蘆薈中多糖含量測定方法的探討[J].營養(yǎng)學(xué)報,2003(2):149-152

[10]來永斌,王琦,孫月．蛹蟲草多糖含量的測定與分析[J].中成藥, 2001(7):517-518

[11]柯軼,巫文政,毛寧.一株蟲草類真菌的液體發(fā)酵產(chǎn)胞內(nèi)多糖培養(yǎng)基的優(yōu)化[J] .海峽科學(xué),2010(7):3-5

[12] DUBOIS M, GILLES K A and HAMILTON J K. Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances[J]. Analytical Chemistry, 1956, 28(3):350-356

[13]韓燕峰,梁建東,杜文,等.蛹蟲草幾個問題的最新研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報, 2009,36(9): 1423-1428

[14]陳佩洪,卞柏華,何強泰,等.幾種食、藥用真菌多糖的初步研究[J].江蘇食用菌, 1995,16(5):3-4

[15]周琴,蔣冬花,楊葉,等.合成聚β-羥基丁酸芽孢桿菌的篩選、鑒定及碳氮源優(yōu)化[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2010, 33 (2): 203-209

[16]唐芳,譚天偉,王芳．L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化菌發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].北京化工大學(xué)學(xué)報,2003,30(5):21-24

Optimization of Fermentation Conditions for Exopolysaccharide from Phellinus vaninii Ljup and Its Morphological Investigation

HE Pei-xin，WU Shuang-shuang，XU Chun-ping*
（College of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450002，Henan，China）

Abstract：In this study，the single-factor method and orthogonal design were used to optimize the flask culture conditions for exopolysaccharide（EPS）production by Phellinus vaninii Ljup. The morphological changes in optimal medium mycelia were also investigated. The results of single-factor experiment for EPS production showed the optimum growth cycle 8 days. And the best carbon source，nitrogen source and inorganic salts were sucrose，corn steep powder and KH2PO4，the optimal temperature of 28℃，pH 7. Then，the concentrations of three factors，i.e. carbon source，nitrogen source and inorganic salts was optimized using the orthogonal design and the optimum culture medium for EPS production were 40 g/L sucrose，4 g/L corn steep powder，4 mmol/L KH2PO4. Under the optimial culture conditions，EPS yield was 0.352 g/L. The morphology under the optimal medium was invesitaged during the fermentation period. The mycelial pellets increased gradually，and the average diameter and density also increased，but roundness increased first then decreases sharply. The roughness first decreased and then increased，which was negatively correlated with roundness.

Key words：Phellinus vaninii Ljup；optimization；exopolysaccharide；morphology

收稿日期：2014-08-02

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.044

*通信作者

作者簡介：何培新（1970—），男（漢），教授，博士，主要從事應(yīng)用真菌的研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金（21376227）；河南省科技創(chuàng)新杰出青年計劃（134100510017）