崔亞玲，何　靜，張朝紳，郭曉歡，馬宏達(dá)

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·藥學(xué)研究·

解痙止痛酊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

崔亞玲，何靜，張朝紳，郭曉歡，馬宏達(dá)*

[摘要]目的建立解痙止痛酊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用TLC法鑒別薄荷腦及陳皮浸出液；采用理化法鑒別水楊酸甲酯；采用HPLC法測(cè)定水楊酸甲酯的含量及辣椒浸出液中辣椒素的含量。色譜條件：①水楊酸甲酯含量測(cè)定：色譜柱為T(mén)hermo C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(60∶40)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為305 nm；柱溫為25 ℃。②辣椒素含量測(cè)定：色譜柱為Welchrom C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(45∶55)，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；柱溫為25 ℃。結(jié)果薄層定性鑒別斑點(diǎn)清晰，分離效果良好，專(zhuān)屬性強(qiáng)；理化鑒別反應(yīng)靈敏，陰性對(duì)照無(wú)干擾。水楊酸甲酯含量在0.13~2.60 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=1.000 0)，平均加樣回收率為99.50%，RSD為0.43%(n=6)。辣椒素在0.091~2.912 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=1.000 0)，平均加樣回收率為101.06%，RSD為1.45%(n=6)。結(jié)論本方法結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單，專(zhuān)屬性和重復(fù)性良好，可作為該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

[關(guān)鍵詞]解痙止痛酊；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；高效液相色譜法；薄層色譜法

0引言

解痙止痛酊是中國(guó)人民解放軍第四六三醫(yī)院生產(chǎn)的醫(yī)院制劑，由辣椒、陳皮、薄荷腦及水楊酸甲酯組成。具有活血通經(jīng)、止痛等功效。主要用于治療軟組織損傷引起的頸、肩、腰、腿痛，對(duì)凍瘡也有一定療效，質(zhì)量穩(wěn)定，在臨床有很大的需求。目前解痙止痛酊制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不夠完善，為了控制該制劑的質(zhì)量，保證臨床用藥合理安全[1]，本研究采用TLC法對(duì)制劑中薄荷腦和陳皮浸出液進(jìn)行定性鑒別，采用理化法對(duì)水楊酸甲酯進(jìn)行定性鑒別。并以水楊酸甲酯作為指標(biāo)，采用HPLC法測(cè)定本品中水楊酸甲酯含量，同時(shí)以辣椒素作為指標(biāo)，采用HPLC法測(cè)定中間品辣椒浸出液中辣椒素的含量，方法快速簡(jiǎn)便、靈敏度高，可作為該制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1儀器與試藥

高效液相色譜儀(配備W600型泵，2996型紫外檢測(cè)器，Waters公司)；電子分析天平(120D型，北京島津公司)；微量定量點(diǎn)樣管(北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)；薄荷腦對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110728-200506)；橙皮苷對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110721-201316)；水楊酸甲酯對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110707-201413)；辣椒素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110839-201205)；薄層層析硅膠G(化學(xué)純，青島海洋化工有限公司)；解痙止痛酊(中國(guó)人民解放軍第四六三醫(yī)院，批號(hào)：20141013、20150317、20150423)；陳皮浸出液(中國(guó)人民解放軍第四六三醫(yī)院，批號(hào)：20141011、20150315、20150421)；辣椒浸出液(中國(guó)人民解放軍第四六三醫(yī)院，批號(hào)：20141011、20150315、20150421)；甲醇(色譜純，Sigma公司)，乙腈(色譜純，Sigma公司)，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1薄荷腦薄層鑒別[2]取本品5 mL，作為供試品溶液。按處方配比，取除薄荷腦外的其他藥材，按制備工藝制成酊劑，取5 mL作為陰性對(duì)照溶液。另取薄荷腦對(duì)照品加乙醇制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，分別吸取5 μL上述3種溶液，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑為甲苯-乙酸乙酯(19∶1)，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液。在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照不干擾薄荷腦薄層鑒別。3批樣品的供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1　薄荷腦薄層色譜鑒別

3.供試品3(批號(hào)：20150423)，4.薄荷腦對(duì)照品(中檢所，批號(hào)：110728-200506)，5.薄荷腦陰性樣品

2.2陳皮浸出液薄層鑒別[3-5]取陳皮浸出液5 mL，作為供試品溶液。按處方配比，取除陳皮浸出液外的其他藥材，按制備工藝制成酊劑，取5 mL作為陰性對(duì)照溶液。另取橙皮苷對(duì)照品加甲醇制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，分別吸取5 μL上述3種溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑為二氯甲烷-甲醇-水(32∶17∶5)的下層溶液，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁甲醇試液，在105 ℃加熱2~3 min，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品不干擾陳皮薄層鑒別。3批樣品的供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2　陳皮浸出液薄層色譜鑒別

批號(hào)：110721-201316)，2.供試品1(批號(hào)：20141011)，3.供試品2(批號(hào)：20150315)，4.供試品3(批號(hào)：20150421)，5.陰性樣品

2.3水楊酸甲酯理化鑒別取本品5 mL置試管中，按處方配比，取除水楊酸甲酯外的其他藥材，按制備工藝制成酊劑，取5 mL作為陰性樣品溶液。加水3 mL搖勻，下層顯鮮紅色。棄去上層液后，加三氯化鐵飽和溶液1滴，顯紫色。再加水5 mL下層顯紅色，上層顯紫色，陰性樣品無(wú)干擾(圖3)。3批樣品的供試品均顯相同顏色的反應(yīng)(圖4)。

2.4含量測(cè)定

2.4.1水楊酸甲酯含量測(cè)定[6-8]①色譜條件。色譜柱：Thermo C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(60∶40)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：305 nm；進(jìn)樣量：20 μL。②對(duì)照

圖3　水楊酸甲酯專(zhuān)屬性理化鑒別

圖4　水楊酸甲酯重復(fù)性理化鑒別

批號(hào)：20150317)，3.供試品溶液3(批號(hào)：20150423)

品溶液的配制：精密稱(chēng)定水楊酸甲酯對(duì)照品適量，加甲醇使溶解，制成濃度為65 μg/mL的溶液，即得。③供試品溶液的配制：精密量取本品1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。④陰性樣品溶液的制備：按處方取除水楊酸甲酯外的各味藥材，按制備工藝制得樣品，再按“2.4.1”項(xiàng)供試品溶液制備方法，制得陰性樣品溶液。色譜圖見(jiàn)圖5。⑤標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取濃度為65 μg/mL的水楊酸甲酯對(duì)照品溶液各2、5、10、20、40 μL，注入液相色譜儀，按“2.4.1”項(xiàng)色譜條件分析，測(cè)定各自峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：y=1 645 414.42 x-34 136.17，r=1.000 0。結(jié)果表明，水楊酸甲酯在0.13~2.60 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。⑥精密度試驗(yàn)：精密吸取濃度為65 μg/mL的水楊酸甲酯對(duì)照品溶液20 μL，按“2.4.1”項(xiàng)色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰的峰面積，測(cè)得峰面積值的RSD為0.24%(n=6)，符合要求。⑦穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批(批號(hào)：20141013)樣品，按照“2.4.1”項(xiàng)供試品溶液制備方法和色譜條件進(jìn)行分析，分別在0、3、6、9、12、15 h測(cè)定樣品中水楊酸甲酯峰面積，測(cè)得峰面積值的RSD為0.10%(n=6)，表明供試品溶液在15 h內(nèi)穩(wěn)定。⑧重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批(批號(hào)：20141013)樣品，按照“2.4.1”項(xiàng)供試品溶液制備方法和色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定每份樣品中水楊酸甲酯含量。結(jié)果樣品中水楊酸甲酯平均標(biāo)示量為101.06%，RSD為0.68%(n=6)，符合要求。⑨加樣回收率試驗(yàn)及樣品測(cè)定：取同一批(批號(hào)：20141013)樣品，精密量取0.5 mL，分別加入水楊酸甲酯對(duì)照品溶液(108.553 mg/mL)各1 mL，再按照“2.4.1”項(xiàng)供試品溶液制備操作，制成回收率用供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)色譜條件分析，測(cè)定樣品中含量，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.50%，RSD為0.43%(n=6)，符合要求。結(jié)果見(jiàn)表1。取3個(gè)批號(hào)的樣品，按照“2.4.1”項(xiàng)供試品溶液制備操作，按“2.4.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定各自樣品中水楊酸甲酯的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　回收率試驗(yàn)

圖5　水楊酸甲酯HPLC色譜圖

批號(hào)稱(chēng)樣量(mL)標(biāo)示量(%)平均值(%)20141013199.72100.531101.3320150317197.4996.95196.40201504231100.06100.471100.87

2.4.2辣椒浸出液含量測(cè)定[9-11]①色譜條件：色譜柱：Welchrom C18(4.6 mm×200 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(45∶55)；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；進(jìn)樣量：20 μL。②對(duì)照品溶液的配制：精密稱(chēng)定辣椒素對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為45 μg/mL的溶液，即得。③供試品溶液的配制：精密量取辣椒浸出液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。色譜圖見(jiàn)圖6。④標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取濃度為45.5 μg/mL的辣椒素對(duì)照品溶液各2、4、8、16、32、64 μL，注入液相色譜儀，按“2.4.2”項(xiàng)色譜條件分析，測(cè)定各自峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：y=734 385.03 x-15 994.56，r=1.000 0。結(jié)果表明，辣椒素在0.091~2.912 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。⑤精密度試驗(yàn)：精密吸取濃度為45.5 μg/mL的辣椒素對(duì)照品溶液20 μL，按“2.4.2”項(xiàng)色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰的峰面積，測(cè)得峰面積值的RSD為0.60%(n=6)，符合要求。⑥穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批樣品(批號(hào)：20141011)，按照“2.4.2”項(xiàng)供試品溶液制

圖6　供試品和辣椒素對(duì)照品色譜圖

備方法和色譜條件進(jìn)行分析，分別在0、2、4、6、8、10 h，測(cè)定樣品中辣椒素峰面積，測(cè)得峰面積值的RSD為1.55%(n=6)，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。⑦重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品(批號(hào)：20141011)，按照“2.4.2”項(xiàng)供試品溶液制備方法和色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定每份樣品中辣椒素含量。結(jié)果樣品中辣椒素平均含量為0.206 7 mg/mL，RSD為1.61%(n=6)，符合要求。⑧加樣回收率試驗(yàn)：取同一批樣品(批號(hào)：20141011)，精密量取1 mL，分別加入辣椒素對(duì)照品溶液(100 μg/mL)各2.5 mL，按照“2.4.2”項(xiàng)供試品溶液制備操作，制成回收率用供試品溶液，再按“2.4.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定樣品中含量，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為101.06%，RSD為1.45% (n=6)，符合要求。結(jié)果見(jiàn)表3。⑨樣品的測(cè)定：取3個(gè)批號(hào)的辣椒浸出液，按照“2.4.2”供試品溶液制備操作，按“2.4.2”色譜條件測(cè)定各自樣品中辣椒素的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

3討論

3.1定性鑒別的優(yōu)化采用薄層色譜法鑒別陳皮浸出液時(shí)，筆者曾嘗試按照2010年版《中國(guó)藥典》一部中陳皮鑒別方法進(jìn)行試驗(yàn)，但試驗(yàn)結(jié)果顯示其Rf值在0.1左右，Rf值偏低，故考察了不同展開(kāi)劑比例來(lái)增大Rf值，但此展開(kāi)系統(tǒng)較復(fù)雜，且為二次展開(kāi)，Rf值變化不大，故查閱文獻(xiàn)更換鑒別方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，更換后的方法專(zhuān)屬性及重復(fù)性良好，Rf值在0.2~0.8范圍內(nèi)，且展開(kāi)條件簡(jiǎn)單，選取更改后的方法作為陳皮浸出液的鑒別方法。

表3　回收率試驗(yàn)

表4　三批中間品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3.2在水楊酸甲酯含量測(cè)定中，分別考察了乙腈-水(65∶35)、甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(60∶40)流動(dòng)相系統(tǒng)。以乙腈-水(65∶35)、甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(60∶40)為流動(dòng)相時(shí)，分離度均>1.5，水楊酸甲酯分離效果較好，但以乙腈-水(65∶35)和甲醇-水(80∶20)為流動(dòng)相時(shí)，前者保留時(shí)間較長(zhǎng)而后者保留時(shí)間太短；而以甲醇-水(60∶40)為流動(dòng)相時(shí)，峰形較好，無(wú)陰性干擾，且保留時(shí)間合適，故選擇以甲醇-水(60∶40)為流動(dòng)相。

3.3在辣椒浸出液的含量測(cè)定中，分別考察了甲醇-水(50∶50)、乙腈-水(40∶60)、乙腈-水(45∶55)流動(dòng)相系統(tǒng)。以甲醇-水(50∶50)為流動(dòng)相時(shí)，辣椒素未出峰。以乙腈-水(40∶60)、乙腈-水(45∶55)為流動(dòng)相時(shí)，分離度均>1.5，辣椒素分離效果較好，但以乙腈-水(40∶60)為流動(dòng)相時(shí)，辣椒素保留時(shí)間較長(zhǎng)；而以乙腈-水(45∶55)為流動(dòng)相時(shí)，峰形較好，且保留時(shí)間適宜，故選擇以乙腈-水(45∶55)為流動(dòng)相。

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Study on quality standard of jiejing zhitong tinctureCUI Ya-ling,HE Jing,ZHANG Chao-shen,GUO Xiao-huan,MA Hong-da*(Department of Pharmacy,General Hospital of Shenyang Military Command Area,Shenyang 110016,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish and consummate a quality control for jiejing zhitong tincture.MethodsThin-layer chromatography was used for the identification of leaching solution of pericarpium citri retculatae and menthol. The methyl salicylate was identified by physicochemical method. High performance liquid chromatography was used for the determination of methyl salicylate in jiejing zhitong tincture and capsaicin in pepper extract. The chromatography condition of methyl salicylate was performed on Thermo C18(4.6 mm×150 mm，5 μm),the mobile phase consisted of methanol-water(60∶40)with the flow rate of 1.0 mL/min,the detection wavelength was 305 nm,column temperature was 25 ℃. The condition of capsaicin’s determination was performed on Welchrom C18(4.6 mm×200 mm，5 μm) with acetonitrile-water (45∶55) as the mobile phase,the flow rate was 1.0 mL/min,the detection wavelength was 280 nm,column temperature was 25 ℃. ResultsThe spots in the thin layer chromatography were clear. Methyl salicylate was sensitive to the physicochemical method. The linear range of methyl salicylate was 0.13~2.60 μg (r=1.000 0). The average recovery was 99.50% (RSD=0.43%,n=6). The linear range of capsaicin was 0.091~2.912 μg ( r=1.000 0). The average recovery was 101.06% (RSD=1.45%,n=6). ConclusionThe method is simple,accurate and repeatable,which can be used for quality control of jiejing zhitong tincture.

Key words：Jiejing zhitong tincture;Quality standard;HPLC;TLC

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201601017

*通信作者

基金項(xiàng)目：軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專(zhuān)項(xiàng)面上課題

收稿日期：2015-07-15

作者單位：沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科，沈陽(yáng) 110016

(14ZJZ13-1)