張　紅,張　斌,王超楠,李　梅,黃志銀,劉俊峰

(1.天津師范大學 生命科學學院,天津　300387;2.天津科潤蔬菜研究所,天津　300384)

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青麻葉大白菜根腫病人工接種方法及條件研究

張紅1,張斌2,王超楠2,李梅2,黃志銀2,劉俊峰1

(1.天津師范大學 生命科學學院,天津300387;2.天津科潤蔬菜研究所,天津300384)

摘要：為輔助青麻葉大白菜的抗病育種研究,以青麻葉大白菜秋綠60種子為試驗材料,比較了5種接種方法(菌土法、密封菌土法、蘸根法、注射法、浸種法)不同土壤pH值、菌液濃度、光照及根系分泌物等接種條件對人工接種效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),菌土法與其他接種方法相比效果更好、更穩(wěn)定,浸種法效果最差。在土壤pH值為酸性時更易發(fā)病,且pH值達到6.5時,病情指數(shù)最高;每g土接種0.050 g病根是最適宜的接種濃度;光照對病害的發(fā)生有促進作用;番茄和抗、感根腫病的白菜根系分泌物均能促進病害的發(fā)生。因此,在青麻葉大白菜的人工接種試驗中可采用以上最佳接種方法及條件提高接種效果。

關(guān)鍵詞：根腫病;青麻葉大白菜;接種方法;接種條件

根腫病是由蕓薹根腫菌(Plasmodiophorabrassicae)引起的一種世界性土傳病害[1],該病傳染力強,傳播途徑廣,危害損失較大,防治困難,主要為害大白菜等十字花科作物。近年來,根腫病在云南、湖北、貴州、山東、遼寧等十字花科蔬菜種植區(qū)發(fā)生嚴重,并迅速蔓延,目前全國大部分省份均有發(fā)生,已成為制約十字花科蔬菜生產(chǎn)的主要因素之一。至今我國根腫病的常年危害面積約320萬~400萬hm2,占十字花科作物栽培總面積的1/3以上,平均年產(chǎn)量損失達20%～30%,發(fā)病嚴重地塊的年產(chǎn)量損失高達60%以上[2]。目前防治根腫病的手段主要是進行抗性育種,而接種方法及條件的探索是進行相關(guān)研究的基礎(chǔ)。雖然,國內(nèi)外已有學者對根腫病的接種方法及條件進行探索,但針對青麻葉大白菜的研究尚未見報道,且由于影響因素復雜,根腫菌又存在生理小種分化,至今尚未形成一套統(tǒng)一而穩(wěn)定的接種體系[3]。為此,本試驗在前人的研究基礎(chǔ)上[4-7],以青麻葉大白菜為接種對象,探討5種常用接種方法的發(fā)病效果及不同pH值、菌液濃度、光照和其他根系分泌物等條件對人工接種效果的影響,以建立一套適合青麻葉大白菜的人工接種鑒定體系,為抗病育種提供參考依據(jù)。

1材料和方法

1.1試驗材料

供試品種為秋綠60青麻葉大白菜,由天津科潤蔬菜研究所提供。供試菌株為大白菜根腫病發(fā)病腫根,采自云南省昆明市嵩明縣,取回后洗凈,于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗方法

1.2.1休眠孢子液的制備制備休眠孢子液參考郭向華等[8]、楊文強[9]的方法,稱10 g病根組織用榨汁機搗碎,然后經(jīng)過3層紗布過濾,將濾液經(jīng)1 020 r/min離心5 min,棄上清,用50 mL滅菌水重溶沉淀,再次離心5 min,棄去上清,向離心管中加5 mL 50%蔗糖溶液混勻,離心5 min,吸取上清至新離心管,再次離心10 min,棄上清,反復2次,最后將沉淀溶于5 mL滅菌水。休眠孢子懸浮液用血球計數(shù)器計數(shù),并在4 ℃條件下貯藏備用。

1.2.2不同接種方法發(fā)病效果的比較試驗菌土法：按比例將制備好的休眠孢子液和無菌土混合,使菌土孢子含量達到108個/g,將pH值調(diào)至6.5,含水量控制在60%左右,然后將配好的菌土置入裝滿滅菌營養(yǎng)土的育苗穴盤中,把種子播于菌土上,少量蛭石覆蓋。苗盤置于溫室通風陰涼處,25 ℃條件下生長,避免陽光長時間直曬,苗盤下保持1 cm水層,30 d后調(diào)查發(fā)病情況。

密封菌土法：按比例將制備好的休眠孢子液和無菌土混合,使菌土孢子含量達到108個/g,將pH值調(diào)至6.5,含水量控制在60%左右,然后用塑料膜將配好的菌土密封48 h 后,再將菌土置入裝滿滅菌營養(yǎng)土的育苗穴盤中,把種子播于菌土上,少量蛭石覆蓋。苗期管理同上,30 d后調(diào)查發(fā)病情況。

蘸根法：選取培養(yǎng)10 d的健康幼苗,洗凈根部,浸在孢子濃度為108個/mL的菌液中4 h,再把幼苗移植到裝有滅菌土的育苗缽中。苗期管理同上,30 d后調(diào)查發(fā)病情況。

注射法：將種子播于裝有滅菌營養(yǎng)土的育苗穴盤中,播種后用移液器吸取孢子濃度108個/mL的菌液1 mL注射于種子下方。苗期管理同上,30 d后調(diào)查發(fā)病情況。

浸種法：將種子浸在配制好的孢子濃度為108個/mL的菌液中4 h,然后將種子播于盛有滅菌營養(yǎng)土的育苗穴盤中,少量蛭石覆蓋。苗期管理同上,30 d后調(diào)查發(fā)病情況。

以上每個處理播種25穴,每穴留苗2株,3次重復。

1.2.3不同土壤pH值對接種效果的影響將菌根加適量水,放入榨汁機中搗碎呈勻漿,按菌根和滅菌營養(yǎng)土1∶20(m/m)的比例配制菌土,采用密封菌土法進行接種后,用pH值分別為 5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5的水進行澆灌,使育苗盤下保持1 cm水層。每處理25穴,每穴留苗2株,3次重復。苗期管理同上,30 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.4不同接種濃度對接種效果的影響采用密封菌土的方法接種,每g滅菌土接種菌根0.005,0.010,0.020,0.050,0.100,0.200 g,每處理25穴,每穴留苗2株,3次重復,苗期管理同上,30 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.5光照對接種效果的影響按1∶20(m/m)的比例配制菌土,采用密封菌土法進行接種,播種2周后,對苗盤分別進行15 d日光處理和遮光處理,每個處理25穴,每穴留苗2株,3次重復。苗期管理同上,播種30 d后調(diào)查統(tǒng)計結(jié)果。

1.2.6植物根系分泌物對接種效果的影響選用番茄和抗、感根腫病白菜的種子經(jīng)催芽后播在盛有Hoagland營養(yǎng)液的50 mL小燒杯里的紗布上,每杯各播10株,使根系生長后浸入營養(yǎng)液中,7 d后收集含根系分泌物的溶液。

按1∶20(m/m)的比例配制菌土,采用密封菌土法進行接種,然后在菌土中分別添加番茄、抗根腫病白菜、感根腫病白菜的根系分泌物溶液,以添加不含分泌物的Hoagland營養(yǎng)液為對照,每個處理25穴,每穴留苗2株,3次重復。苗期管理同上,30 d后調(diào)查統(tǒng)計結(jié)果。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根腫病病情的分級參照2012年王彤彤等[10]的方法,分為7級。

0級:根系正常,無病害;

1級:主根未發(fā)生病害,須根、側(cè)根有個別細小根瘤;

3級:主根出現(xiàn)病害癥狀但腫大不明顯,須根、側(cè)根較多根瘤或根瘤直徑或長度超過0.5 cm;

5級:主根腫大明顯,腫大部分直徑為莖基的2～3倍,大部分須根、側(cè)根有腫瘤;

7級;主根腫大明顯,腫大部分直徑為莖基的3倍以上。

病株率和病情指數(shù)計算公式如下:

病株率=(發(fā)病株數(shù)/總株數(shù))×100%;

病情指數(shù)=∑(發(fā)病級代表值×各級病株數(shù))×100/(調(diào)查總株數(shù)×最高級發(fā)病代表值)。

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同接種方法對接種效果的影響

采用5種接種方法,以相同的接種濃度和土壤pH值對秋綠60進行根腫病接種。由表1可知,菌土法的接種效果最好,發(fā)病率為100%,病情指數(shù)為77.14;其次是密封菌土法,發(fā)病率為93%,病情指數(shù)為56.12;再次是蘸根法和注射法,病情指數(shù)分別為51.42和48.74;浸種法的接種效果最差,發(fā)病率和病情指數(shù)都極顯著低于其他4種方法。

表1　不同接種方法對發(fā)病的影響

注：不同大寫字母表示差異極顯著(P=0.01)。表2-5同。

Note:Different capital letters indicates extremely significant difference (P= 0.01).The same as Tab.2-5.

2.2不同土壤pH值對接種效果的影響

由表2可知,利用密封菌土法接種,在其他條件一致的情況下,當土壤pH值為5.0～6.5時發(fā)病率和病情指數(shù)均較高,發(fā)病率都達到了65%以上,病情指數(shù)均接近或達到30以上,其中pH值為6.5時,發(fā)病率和病情指數(shù)最高,分別為70%和36.04,極顯著高于其他處理。但當pH>6.5時,發(fā)病率和病情指數(shù)均大幅下降。由此可知酸性條件利于發(fā)病,且pH=6.5是最佳接種pH值,這也與根腫菌休眠孢子的萌發(fā)特性相符[11]。

表2　不同土壤pH值對發(fā)病的影響

2.3不同接種濃度對接種效果的影響

本試驗設(shè)置了6個接種濃度,采用密封菌土法進行接種,發(fā)病情況結(jié)果統(tǒng)計如表3所示,接種濃度由每g土0.005 g病根至0.050 g病根時,發(fā)病率和病情指數(shù)均隨接種濃度的升高而上升,接種濃度為每g土0.050 g病根時,發(fā)病率和病情指數(shù)均達到最高,分別為89%和56.35,極顯著高于其他處理,但當接種濃度再繼續(xù)升高后,接種效果反而有所下降。因此,每g土接種0.050 g病根為最適接種濃度。

表3　不同接種濃度對發(fā)病的影響

2.4光照因素對接種效果的影響

由表4可知,在溫度、pH值、菌液濃度一致的條件下經(jīng)過光照處理后,根腫病的發(fā)病率和病情指數(shù)均極顯著高于黑暗處理,說明光照對根腫病發(fā)病有促進作用,分析其原因是光照處理刺激寄主產(chǎn)生大量的蕓苔葡萄硫甘從而引起植物根系腫大[12]。

表4　光照因素對發(fā)病的影響

2.5番茄、抗感白菜根系分泌物對接種效果的影響

由表5的鑒定結(jié)果可以看出,番茄和抗、感根腫病白菜的根分泌物溶液極顯著提高了發(fā)病率和病情指數(shù)。這可能是由于非寄主的根分泌物溶液對休眠孢子的萌發(fā)有促進作用,但其具體機理還有待進一步探討。

表5　植物根系分泌物對發(fā)病的影響

3結(jié)論與討論

本試驗首次全面比較了5種根腫病接種方法對青麻葉大白菜接種效果的影響,發(fā)現(xiàn)5種接種方法中菌土法的病情最重,這與司軍等[13]認為菌土法比蘸根法誘導發(fā)病嚴重的觀點一致。但黃蓉等[3]及李妍等[14]則認為密封菌土法比菌土法發(fā)病更為嚴重,分析結(jié)論不同的原因可能有以下兩方面:第一、所用試材及菌種來源不同所致;第二、本試驗中配制密封菌土的環(huán)境溫度較高,密封后菌土的溫度可能會達35~40 ℃左右。根據(jù)肖崇剛等[15]的研究,甘藍根腫病菌休眠孢子最適萌發(fā)溫度為24 ℃,其平均萌發(fā)率高達73.76%;隨著溫度的升高萌發(fā)率均呈逐漸下降趨勢,當溫度上升到40 ℃時,萌發(fā)率僅為5.52%。據(jù)此,本試驗中可能是密封的高溫導致休眠孢子萌發(fā)率下降,從而最終使密封菌土法致病力低于菌土法。

此外,根腫病的發(fā)生與土壤pH值、光照及其他植物的根系分泌物等因素也有著密切的關(guān)系。本試驗表明在酸性土壤pH值下接種效果最好,這也與酸性條件更利于根腫菌生存萌發(fā)的生物特性相符[16-18]。對于休眠孢子濃度與發(fā)病之間的關(guān)系,試驗發(fā)現(xiàn)每g土接種0.050 g病根屬最適的接種濃度。根據(jù)Siemens等[19]的標準,每g土接種0.05 g病根的孢子濃度約為108個/g。周永紅等[20]、司軍等[13]也曾提出每g土2×108個孢子最適宜接種,該論點正與本試驗結(jié)果相符,說明該接種濃度重復性較好,發(fā)病效果較穩(wěn)定。

由光、暗處理的對比發(fā)現(xiàn),光照對根腫病的發(fā)生有促進作用,光照處理能刺激寄主產(chǎn)生大量的蕓苔葡萄硫甘從而引起植物根系腫大,但具體作用機理還有待于進一步研究。另外添加了番茄和抗、感根腫病白菜根系分泌物的處理,病情指數(shù)明顯提高,表明根系分泌物能促進休眠孢子的萌發(fā)與繁殖,前人研究發(fā)現(xiàn)休眠孢子囊萌發(fā)需要植物根部滲出物-烯丙基異硫氰酸的刺激[21]。本研究結(jié)果與前人報道一致。

本試驗對青麻葉大白菜根腫病接種的各個影響因素進行了比較全面的比較分析,篩選出了適宜的接種方法及條件,為青麻葉大白菜的抗病育種研究提供了有價值的參考依據(jù)。

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Study on Inoculation Methods and Condition of Clubroot in Qingmaye Chinese Cabbage

ZHANG Hong1,ZHANG Bin2,WANG Chaonan2,LI Mei2,HUANG Zhiyin2,LIU Junfeng1

(1.College of Life Sciences,Tianjin Normal University,Tianjin300387,China;2.Tianjin Kernel Vegetable Research Institute,Tianjin300384,China)

Abstract：For the disease-resistant breeding of Qingmaye Chinese cabbage,five kinds of inoculation methods(Indigenous bacteria,Seal of indigenous bacteria,Dip method,Injection method,Seed soaking method),different soil pH,different inoculation concentration,illumination and root secretion were compared by use Qiulü 60 as material in this article.The results showed that the effect of soil inoculation was more excellent and stable.In contrast,seed-immersion method was the poorest.The acid soil pH was fit to clubroot break out and the disease index reached the maximum when pH value was 6.5.1 g soil inoculated 0.050 g root was the most suitable inoculation concentration.After light treatment,the disease index was increased,it showed that light had a promoting effect on diseases.Root secretion of tomato,resistant and susceptible hosts could promote the happening of disease.Therefore,in the artificial inoculation test of Qingmaye Chinese cabbage can be the above optimum inoculation method and conditions so as to improve the effect of inoculation.

Key words:Clubroot;Qingmaye Chinese cabbage;Inoculation method;Inoculation condition

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.029

中圖分類號：S634.01

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0182-04

通訊作者：張斌(1965-),男,遼寧本溪人,研究員,博士,主要從事十字花科蔬菜育種研究。

作者簡介：張紅(1990-),女,天津武清人,在讀碩士,主要從事大白菜分子育種研究。

基金項目：國家“十二五”支撐計劃項目(2012BAD02B01-14);天津市科技成果轉(zhuǎn)化與推廣項目(201402010)

收稿日期：2015-07-15