鄢洪海,吳菊香,張茹琴,遲玉成,宋希云,夏淑春

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院,山東 青島　266109;2.山東省花生研究所,山東 青島　266100)

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NO和H2O2在玉米抗彎孢菌侵染中的生理作用機(jī)制

鄢洪海1,吳菊香2,張茹琴1,遲玉成2,宋希云1,夏淑春1

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院,山東 青島266109;2.山東省花生研究所,山東 青島266100)

摘要：為了明確一氧化氮(NO)和過(guò)氧化氫(H2O2)與玉米彎孢菌葉斑病抗性的關(guān)系,及作為信號(hào)分子調(diào)控玉米抵御彎孢菌感染過(guò)程中的生理機(jī)制。以對(duì)玉米彎孢菌葉斑病具有不同抗性的3個(gè)玉米種質(zhì)478、齊319、農(nóng)大108為試材,外源施用硝普鈉(SNP)、2-4,4,5,5-苯-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(cPTIO)、過(guò)氧化氫(H2O2)、抗壞血酸(AsA),和接種玉米彎孢病菌,比較植株病情指數(shù)、NO和H2O2含量及寄主防御酶活性的變化。結(jié)果表明:外施一定濃度的NO供體硝普鈉(SNP)和H2O2均可減緩玉米彎孢葉斑病菌侵染進(jìn)程,降低感病率和平均病情指數(shù),并且能夠不同程度地提高植株防御酶活性,尤其抗性弱的玉米種質(zhì)478植株內(nèi)過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)和β-1,3-葡聚糖酶(Glu)的活性,誘發(fā)了玉米過(guò)敏性壞死反應(yīng);接種玉米彎孢菌后3個(gè)玉米種質(zhì)葉片中NO和H2O2含量均有猝發(fā)現(xiàn)象,而NO和H2O2的清除劑cPTIO和AsA在一定程度上能夠提高玉米植株感病率和病情指數(shù)。NO和H2O2是玉米彎孢菌葉斑病抗病的重要信號(hào)分子,可提高POD、CAT、SOD、PAL和Glu病程相關(guān)蛋白活性,進(jìn)而增強(qiáng)玉米對(duì)彎孢菌的抗性。

關(guān)鍵詞：玉米彎孢菌;NO和H2O2;寄主防御酶;抗病性生理

玉米彎孢葉斑病(Curvularialunata)是一種玉米葉部上重要病害,20世紀(jì)末至21世紀(jì)初該病害曾在我國(guó)玉米主要產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重發(fā)生,1996年遼寧省發(fā)生面積達(dá)16.8萬(wàn)hm2以上,部分地區(qū)玉米絕收[1]。近幾年該病害發(fā)生雖有所減輕,但個(gè)別地區(qū)仍然造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,并不斷從北方向南方蔓延,鑒于該病害的危害和發(fā)生特點(diǎn),1999年四川省將其列為植物檢疫補(bǔ)充對(duì)象,近2年又在云南省連續(xù)嚴(yán)重發(fā)生。目前,該病害已經(jīng)成為繼玉米大小斑病后,玉米上又一毀滅性病害[1-2]。由于NO和H2O2是寄主的一個(gè)重要信號(hào)分子,在抗病生理中發(fā)揮重要作用,因此,明確NO和H2O2在玉米彎孢菌葉斑病抗病中的作用及機(jī)制對(duì)該病害的控制具有重要意義。植物受病原菌侵染時(shí)能夠通過(guò)一系列的信號(hào)傳導(dǎo),最終產(chǎn)生某種程度的防御反應(yīng),來(lái)抵御病害的危害。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是植物響應(yīng)多種生物脅迫的信號(hào)分子之一,用真菌激發(fā)子處理豌豆葉片時(shí)能檢測(cè)到NO的猝發(fā)和對(duì)應(yīng)的抗病反應(yīng)[3];擬南芥受大麗輪枝菌侵染之后,NO的大量積累并在80 min時(shí)出現(xiàn)峰值[4]。過(guò)氧化氫(Hydrogen peroxide,H2O2) 能在生物細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生活性氧,植物細(xì)胞在受到病原菌等脅迫時(shí),能激發(fā)H2O2的產(chǎn)生,并以此來(lái)調(diào)控一系列應(yīng)答脅迫的信號(hào)傳導(dǎo),啟動(dòng)寄主的防御反應(yīng)。Patykowski 和 Urbanek[5]報(bào)道H2O2作為第二信使參與了番茄對(duì)病原侵染的抗病反應(yīng),水稻感染白葉枯病菌后H2O2含量穩(wěn)定增加,并在6 h時(shí)檢測(cè)到過(guò)氧化氫酶相關(guān)基因顯著地被誘導(dǎo)表達(dá),10 h可達(dá)到峰值,抗病品種較感病品種出現(xiàn)的早,生成量高[6]。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室先前研究表明,NO和H2O2參與了玉米抵御彎孢葉斑病菌侵染的過(guò)程,初步確認(rèn)可能是玉米回應(yīng)彎孢病菌入侵的早期信號(hào)物質(zhì)。但關(guān)于NO和H2O2在玉米彎孢菌葉斑病中的抗病生理作用鮮有報(bào)道,尚未有玉米彎孢菌侵染與寄主過(guò)敏性壞死反應(yīng)和防御反應(yīng)機(jī)理方面的研究報(bào)道。因此，本研究進(jìn)一步通過(guò)外源供給與清除NO和H2O2處理,并挑戰(zhàn)接種彎孢菌，來(lái)探討NO和H2O2在玉米彎孢菌葉斑病抗性中的生理作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1供試菌株及接種植株培養(yǎng)

玉米彎孢菌葉斑病菌CL90023由山東省聊城的玉米彎孢菌葉斑病病株上分離獲得(致病性測(cè)定結(jié)果為強(qiáng)致病性)。

供試玉米種質(zhì)齊319、農(nóng)大108、478分別為高抗、中抗和高感玉米彎孢菌葉斑病的品種和自交系,用盆栽方法培育供試玉米植株。

1.2植株處理

取13葉期的玉米植株,分別用毛刷蘸取藥液涂抹處理植株的葉片,處理藥液H2O2的濃度分別為Ⅰ:0.01%,Ⅱ:0.1%,Ⅲ:1%,硝普鈉(Sodium nitroprusside,SNP,NO供體)的濃度為Ⅰ:0.01 mmol/L,Ⅱ:0.1 mmol/L,Ⅲ:1 mmol/L,2-4,4,5,5-苯-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt,cPTIO,NO清除劑)的濃度分別為Ⅰ:0.1 mmol/L,Ⅱ:1.0 mmol/L,Ⅲ:10 mmol/L,抗壞血酸(As-corbic acid,AsA,H2O2清除劑)的濃度分別為Ⅰ:0.2 mmol/L,Ⅱ:2.0 mmol/L,Ⅲ:20 mmol/L,以蒸餾水作為對(duì)照組。之后接種玉米彎孢菌,孢子懸浮液的濃度為5×105個(gè)/mL,將處理過(guò)的植株放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),定時(shí)取樣。培養(yǎng)箱光/暗周期為16 h/8 h,濕度100%,溫度28 ℃,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3抗感性觀測(cè)及病情調(diào)查

觀察并拍照接種后植株葉片的發(fā)病情況,根據(jù)病斑大小和敏感性確定抗感反應(yīng)和過(guò)敏性壞死反應(yīng),并于接種處理后的7 d測(cè)量各處理的發(fā)病級(jí)別和計(jì)算病情指數(shù)。

1.4NO和H2O2含量測(cè)定

NO含量測(cè)定采用青島力冉生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定。取0.4 g樣品葉片加3.0 mL 0.9% NaCl,研磨成勻漿;10 000 r/min離心10 min,取上清,沸水浴5 min;10 000 r/min離心5 min,取上清,稀釋20倍,在550 nm波長(zhǎng)下,測(cè)定吸光度值。

H2O2含量的測(cè)定采用胡林剛等[7]報(bào)道的方法進(jìn)行。

1.5DAB染色

將供試玉米葉片分別用dH2O(對(duì)照)、SNP、H2O2、cPTIO、AsA 處理和接種彎孢病菌,48 h后將其浸泡在0.1%DAB染液中,然后抽真空,置于黑暗處室溫保存15 h,出現(xiàn)棕色斑后,用60 ℃ 80%酒精脫色,在此期間不斷觀察過(guò)敏性壞死反應(yīng)。

1.6寄主防御酶活性測(cè)定

1.6.1過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定pH值7.2 PBS (磷酸緩沖液) 0.7 mL+酶液0.3 mL+愈創(chuàng)木酚3.0 mL,在470 nm波長(zhǎng)下,測(cè)定吸光度值。

1.6.2過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定取2.9 mL Tris-HCl緩沖液25 ℃水浴,加入50 μL酶液于EP管,快速混勻,倒入比色皿中,封口,預(yù)熱5 min。加入50 μL 750 mmol/L H2O2并開(kāi)始計(jì)時(shí),每隔60 s讀一次OD240值,連續(xù)讀3次。

1.6.3苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測(cè)定緩沖液2.9 mL+0.02 mol/L苯丙氨酸1.0 mL+酶液0.1 mL,40 ℃水浴中反應(yīng)10 min,HCl 終止反應(yīng),在290 nm 波長(zhǎng)下,測(cè)定吸光度值。

1.6.4超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定在裝有3 mL反應(yīng)混合液(在54 mL 14.5 mmol/L DL-甲硫氨酸中分別加入50 mmol/L pH值7.8磷酸緩沖液的3 μmol/L EDTA,2.25 mmol/L NBT和60 μmol/L核黃素各2 mL,各個(gè)溶液均在用前配制,避光放置)的試管中,加入1 mL SOD 酶液,混合后放置在試管架上,在光照培養(yǎng)箱內(nèi)光照10 min,取出試管,迅速測(cè)定OD560值,以滅活的酶液作為對(duì)照[8]。

1.6.5β-1,3-葡聚糖酶(Glu)活性測(cè)定參照栗小英等[9]的方法測(cè)定β-1,3-葡聚糖酶活性,以1 min·1 g 鮮組織產(chǎn)生1 μg還原糖的酶量為一個(gè)酶活性單位(U)。

2結(jié)果與分析

2.1SNP和H2O2誘導(dǎo)的玉米彎孢菌葉斑病過(guò)敏性壞死反應(yīng)及抗病性

玉米彎孢菌侵染玉米葉片2 d后經(jīng)DAB染色,可見(jiàn)經(jīng)SNP和H2O2處理的葉片出現(xiàn)不同程度的壞死癥狀,尤其是經(jīng)1 mmol/L SNP、0.1% H2O2處理的葉片褐色反應(yīng)明顯,形成較大的褐色圓斑(圖1-B、C),而對(duì)照清水處理的葉片沒(méi)發(fā)現(xiàn)褐色壞死反應(yīng)(圖1-A)。接種后5 d SNP和H2O2處理的葉片組織變成枯斑,上面不產(chǎn)生分生孢子,對(duì)照在接種后5 d可見(jiàn)大量的水浸狀斑點(diǎn)(典型的玉米彎孢菌葉斑病癥狀)。接種后7 d發(fā)病情況調(diào)查表明經(jīng)SNP和H2O2處理的葉片與對(duì)照組比發(fā)病輕(病斑數(shù)少,衰老的慢。雖然SNP和H2O2處理的葉片曾出現(xiàn)比對(duì)照組病斑大的現(xiàn)象,但病斑以外的健康組織不發(fā)黃,也不枯萎,而對(duì)照組植株的葉片發(fā)黃快,逐漸枯萎,癥狀嚴(yán)重,圖1-D、E),并且在經(jīng)SNP和H2O2處理的葉片病斑上很少形成分生孢子。另外,經(jīng)cPTIO、AsA處理的葉片接種后,葉片病情指數(shù)比對(duì)照有不同程度的增加。以cPTIO 10 mmol/L,AsA 20 mmol/L處理的病情指數(shù)最高,癥狀加重明顯,說(shuō)明抑制或清除葉片組織中的NO、H2O2有促進(jìn)玉米彎孢菌侵染的作用,對(duì)病害發(fā)生有利(圖2)。

2.2NO和H2O2參與了調(diào)控玉米彎孢菌侵染寄主的過(guò)程

2.2.1NO含量與彎孢菌侵染和植株抗病性的關(guān)系從圖3-A可以看出,478、齊319、農(nóng)大108這3個(gè)品種或自交系在接種彎孢菌后,植株體內(nèi)的NO含量和對(duì)照不接種比都發(fā)生明顯變化。高抗自交系齊319在接種后NO含量快速上升,4 h出現(xiàn)高峰,之后迅速下降,8 h含量比對(duì)照還低,并在接種后16 h出現(xiàn)最低值,之后又有升高,但很快又下降,于28 h出現(xiàn)第2個(gè)最低值;農(nóng)大108的變化曲線和齊319相似,但峰值出現(xiàn)晚4 h(在8 h),之后含量不斷下降,出現(xiàn)最低值后又有一定的升高;而感病自交系478在接種后就不斷下降,于接種后的8,24 h出現(xiàn)2個(gè)最低值。另外,對(duì)照沒(méi)接種病菌的齊319、農(nóng)大108、478植株體內(nèi)的NO含量雖然都有下降,但曲線變化不明顯,說(shuō)明接種玉米彎孢病菌影響了玉米植株內(nèi)NO代謝,并且在抗病和感病植株內(nèi)的變化差異明顯,暗示植株內(nèi)NO含量變化與寄主的抗病性關(guān)系密切。

圖1　SNP和H2O2誘發(fā)的玉米彎

圖2　不同處理接種玉米彎孢葉斑

用NO和H2O2處理進(jìn)一步探討對(duì)植株NO代謝和寄主防御反應(yīng)的影響表明:外源用NO供體SNP(1 mmol/L)處理及挑戰(zhàn)接種彎孢菌能明顯提高玉米植株內(nèi)NO的含量,而用NO的抑制劑cPTIO(10 mmol/L)處理則明顯降低了植株內(nèi)的NO含量;H2O2和AsA處理對(duì)植株內(nèi)的NO的含量雖也都有升高和降低影響,但不如前者明顯(圖3-B)。結(jié)合圖1發(fā)病情況比較,可知外源NO和H2O2處理都能改變植株內(nèi)NO含量和植株抗病性。

圖3　接種和藥劑處理對(duì)葉片內(nèi)NO含量的影響

2.2.2H2O2含量與彎孢菌侵染和植株抗病性的關(guān)系從圖4-A可以看到,品種中478的H2O2初始含量(以鮮質(zhì)量計(jì))最高(40 μmol/g),但在接種彎孢菌后0~8 h,478植株內(nèi)的H2O2含量一直下降,并于8 h降至最低值(第1個(gè)低峰),隨后H2O2含量上升,于16 h出現(xiàn)最高峰,接著H2O2含量又迅速下降,于20 h出現(xiàn)第2個(gè)低峰。而抗病植株齊319和農(nóng)大108的H2O2含量則都是在0~4 h內(nèi)快速上升,并于4 h出現(xiàn)第1個(gè)高峰,然后都開(kāi)始下降并于12 h出現(xiàn)最低值,之后又都上升到另一個(gè)高峰(16 h);然而,3個(gè)沒(méi)接種病菌的對(duì)照植株體內(nèi)的H2O2含量始終變化不明顯,說(shuō)明H2O2含量變化與彎孢病菌侵染有關(guān),即H2O2參與了玉米植株抗性應(yīng)答反應(yīng)。

為了證明上述結(jié)果,采用外援施用H2O2和AsA、SNP和cPTIO方法處理寄主,來(lái)進(jìn)一步探究對(duì)內(nèi)源H2O2的影響。從圖4-B可以看出,用H2O2及其抑制劑AsA處理能明顯提高和降低彎孢菌侵染玉米植株內(nèi)的H2O2含量,而SNP和cPTIO處理對(duì)植株內(nèi)的H2O2的含量雖也都呈升高和降低趨勢(shì),但與H2O2和AsA對(duì)植株內(nèi)H2O2的含量影響相反,可能植株內(nèi)NO含量的升高反而抑制了H2O2形成。

圖4　接種和藥劑處理對(duì)葉片內(nèi)H2O2含量的影響

2.3.1NO和H2O2對(duì)玉米植株內(nèi)過(guò)氧化物酶(POD)活性的影響從圖5-A可以看出,感病自交系478的POD活性(以鮮質(zhì)量計(jì))在初始階段較低,并且在接種病菌后呈下降趨勢(shì),從接種后8 h開(kāi)始逐漸升高,到接種28 時(shí)達(dá)到峰值。而齊319在起始階段POD的活性就很高,在接種后雖也出現(xiàn)降低,但很快開(kāi)始升高,在16 h出現(xiàn)一個(gè)活性高峰,雖然后來(lái)有所下降,出現(xiàn)起伏變化,但接種病菌后總體活性較高,可能與該品種的抗侵染能力有關(guān)。農(nóng)大108也在接種彎孢菌4 h后POD活性下降,隨后逐漸升高,就總趨勢(shì)來(lái)說(shuō)與齊319相似,但活性高峰比齊319出現(xiàn)的晚4 h(即20 h出現(xiàn)活性高峰)。另外,從經(jīng)SNP和H2O2處理后玉米植株內(nèi)的POD活性變化曲線看(圖5-B),外源用NO和H2O2及NO和H2O2抑制劑處理也能影響玉米植株內(nèi)POD的活性,尤其在接種玉米彎孢葉斑病菌條件下施用NO供體SNP和H2O2可明顯提高POD的活性,在處理的24~36 h內(nèi)都能出現(xiàn)一個(gè)活性高峰。而用NO和H2O2抑制劑處理,植株內(nèi)POD的活性很快下降,在12 h就出現(xiàn)最低值,說(shuō)明短時(shí)間內(nèi)可明顯降低POD酶的活性。綜合圖5接種病菌、外源NO和H2O2及抑制劑處理對(duì)POD活性的影響,發(fā)現(xiàn)初始階段抗病品種POD活性就比感病品種高,并在受病原菌侵染及NO和H2O2處理后,其活性升高得快,高峰出現(xiàn)的早,峰值大。說(shuō)明POD是寄主抗病性強(qiáng)弱的一個(gè)生理指標(biāo),可能通過(guò)NO和H2O2信號(hào)傳導(dǎo)寄主抗性反應(yīng),實(shí)現(xiàn)寄主防御功能。

圖5　接種病菌和NO、H2O2處理對(duì)寄主POD活性的影響

2.3.2NO和H2O2對(duì)玉米植株內(nèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的影響從圖6-A可以看出接種前寄主中的CAT活性(以鮮質(zhì)量計(jì))都很低,在接種后,寄主的CAT活性都隨著接種時(shí)間的增加而升高,而對(duì)照的CAT的活性始終沒(méi)有明顯變化,說(shuō)明接種玉米彎孢菌激發(fā)了寄主CAT活性。并且在接種后的12~16 h,植株中的CAT活性都出現(xiàn)活性高峰,但抗病植株齊319活性高峰出現(xiàn)最早,活性最高,其次是農(nóng)大108,感病品種478最弱,說(shuō)明抗病品種活性表達(dá)強(qiáng)烈。

另外,用NO供體和H2O2處理玉米葉片也能誘發(fā)CAT活性提高,但用H2O2處理對(duì)植株內(nèi)的CAT活性影響最明顯,尤其是用病菌加H2O2處理的植株內(nèi)CAT的活性變化比單獨(dú)用病菌接種和單獨(dú)用H2O2處理的活性還明顯,并在處理后的12 h出現(xiàn)活性高峰,之后不斷下降。而用NO供體SNP和抑制劑cPTIO處理的植株內(nèi)CAT變化不明顯(圖6-B)。

圖6　接種病菌和NO、H2O2處理對(duì)寄主CAT活性的影響

2.3.3NO和H2O2對(duì)玉米植株內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的影響圖7-A可以看出接種彎孢菌后,3個(gè)玉米品種中SOD的活性(以鮮質(zhì)量計(jì))都逐漸升高,而對(duì)照都沒(méi)有明顯變化,說(shuō)明接種病菌誘發(fā)了SOD防御酶的活性升高。但抗病自交系齊319活性升高的速度明顯快,并在接種后8 h出現(xiàn)活性高峰值,活性最高,而農(nóng)大108和478的SOD活性峰值出現(xiàn)的相對(duì)較晚,尤其是感病自交系478不僅峰值出現(xiàn)晚,活性也最低。雖然SOD在后期都有所下降,但還是比對(duì)照活性高,表明處理激發(fā)的SOD活性持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。

另外,從圖7-B可以看出,用NO和H2O2處理葉片也能誘發(fā)SOD活性提高,處理后的寄主SOD活性不斷升高,說(shuō)明外源施用NO和H2O2與接種病菌對(duì)SOD活性的影響有相似效應(yīng)。但以病菌+NO供體處理對(duì)植株內(nèi)的SOD影響最明顯,顯示NO處理和接種病菌對(duì)SOD的影響有累加效應(yīng)作用。而NO抑制劑cPTIO和H2O2抑制劑AsA對(duì)SOD活性雖有部分降低的影響,但不明顯。

圖7　接種病菌和NO、H2O2處理對(duì)寄主SOD活性的影響

2.3.4NO和H2O2對(duì)玉米植株內(nèi)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影響從圖8-A可以看出,接種前抗病植株齊319和農(nóng)大108 PAL的活性(以鮮質(zhì)量計(jì))比感病寄主478活性高,并且在接種后抗病植株的PAL活性迅速升高,在4 h就出現(xiàn)活性高峰,出現(xiàn)早,活性也極高;而478的PAL活性接種前就很低,雖然接種后有一定的升高,在12 h出現(xiàn)一個(gè)活性高峰,但最高值也比抗病寄主低很多。PAL活性是在接種病菌前后,以及抗病寄主和感病寄主之間差異十分明顯,這說(shuō)明PAL是玉米彎孢葉斑病抗性的一個(gè)重要指標(biāo)。

進(jìn)一步采用外源NO和H2O2及抑制劑處理玉米植株,來(lái)探究PAL活性變化的規(guī)律和調(diào)控的信號(hào)物質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):用NO供體SNP和H2O2處理的玉米植株內(nèi)PAL的活性增加明顯,并以接種病菌+ H2O2處理的組合最明顯(圖8-B),結(jié)果表明:NO和H2O2處理具有與接種病菌對(duì)PAL活性影響的同樣效應(yīng),且有疊加作用。而單獨(dú)用NO和H2O2抑制劑處理對(duì)植株內(nèi)的PAL活性影響不明顯。綜合圖8結(jié)果,表明用彎孢菌、NO供體和H2O2處理都對(duì)寄主PAL影響明顯,抗病品種活性升高最快、峰值最大,而NO和H2O2抑制劑對(duì)植株內(nèi)PAL的活性影響不明顯可能與非病菌脅迫情況下寄主內(nèi)PAL活性低有關(guān)。

圖8　接種病菌和NO、H2O2處理對(duì)寄主PAL活性的影響

2.3.5NO和H2O2對(duì)玉米植株內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶(Glu)活性的影響從圖9-A可以看出抗病植株齊319、農(nóng)大108在接種彎孢菌前β-1,3-葡聚糖酶活性比感病寄主478明顯高,在接種后3個(gè)寄主內(nèi)的β-1,3-葡聚糖酶活性都不斷升高,在接種后8 h都出現(xiàn)活性高峰,但齊319活性峰值最大;478的β-1,3-葡聚糖酶的活性雖然也出現(xiàn)了高峰,但始終沒(méi)有達(dá)到齊319和農(nóng)大108接種前的水平。雖然能看出β-1,3-葡聚糖酶活性與寄主的抗病有關(guān),但齊319 β-1,3-葡聚糖酶活性受病菌侵染影響最嚴(yán)重,而農(nóng)大108和478相對(duì)較弱。

另外,用SNP、H2O2、cPTIO和AsA處理對(duì)寄主β-1,3-葡聚糖酶影響的變化曲線圖看(圖9-B),外源NO和H2O2也能誘導(dǎo)寄主β-1,3-葡聚糖活性升高,而抑制NO和H2O2產(chǎn)生也能減弱寄主β-1,3-葡聚糖活性,并且這種調(diào)控與玉米植株抵御彎孢菌的侵染有關(guān),說(shuō)明該酶也是玉米彎孢菌葉斑病抗病生理的一個(gè)重要標(biāo)志,且受植株內(nèi)NO和H2O2水平調(diào)控。

3討論

寄主受病原生物侵染后,產(chǎn)生的防御反應(yīng)和抗病性程度,對(duì)病害的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。因此,明確寄主抗病防御反應(yīng)的作用機(jī)理,往往也被看作是有效控制生產(chǎn)上一些重要病害的主要先決條件。有研究報(bào)道,NO 和H2O2在植物防衛(wèi)反應(yīng)中起重要作用,作為抗病信號(hào)網(wǎng)絡(luò)上的一分子,參與了許多防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)[10-13],但對(duì) NO 和H2O2參與玉米抗彎孢菌葉斑病防衛(wèi)反應(yīng)的分子機(jī)制了解甚少。

圖9　接種病菌和NO、H2O2處理對(duì)寄主β-1,3-葡聚糖酶活性的影響

3.1外源NO和H2O2處理對(duì)玉米彎孢菌葉斑病抗病性的影響

有研究表明NO直接參與調(diào)節(jié)了植物防衛(wèi)基因活化[14-19]。也有試驗(yàn)證實(shí),NO 協(xié)同活性氧(ROS)激發(fā)寄主細(xì)胞程序化死亡,引起過(guò)敏性壞死反應(yīng)(Hypersensitive reaction,HR)[20-24]。抑制NO的形成導(dǎo)致病原菌侵染能力增強(qiáng),增加寄主的感病性,也進(jìn)一步表明NO 的產(chǎn)生對(duì)寄主抗病性和HR反應(yīng)的起始和發(fā)展起重要作用[25]。另外,NO和H2O2在激發(fā)防衛(wèi)反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中具有互補(bǔ)功能[26-27]。

本研究結(jié)果表明,用外源NO和H2O2處理的玉米植株,接種玉米彎孢葉斑病菌誘發(fā)了過(guò)敏性壞死反應(yīng),尤其是用NO處理的植株褐色壞死斑出現(xiàn)得既快又明顯;相反,用NO和H2O2抑制劑cPTIO和AsA處理玉米植株則誘發(fā)了寄主感染玉米彎孢菌葉斑病。

3.2NO和H2O2直接參與了玉米抗彎孢菌侵染及生理代謝

接種玉米彎孢葉斑病菌能使植株內(nèi)源NO 和H2O2含量發(fā)生猝發(fā)現(xiàn)象,抗性強(qiáng)的品種齊319和農(nóng)大108 猝發(fā)早;用NO供體SNP和H2O2處理后的植株抗病性增強(qiáng),且用NO和H2O2清除劑cPTIO和AsA處理后,玉米嚴(yán)重感病的結(jié)果也能進(jìn)一步表明NO和H2O2是抗病信號(hào)分子。

另外,在抗、感植株中,單獨(dú)施用NO供體能部分抑制H2O2的積累[23]。Beligni和Lamattina[28-29]也報(bào)道NO能清除植株體內(nèi)的活性氧起到抗氧化劑作用,進(jìn)而抑制H2O2形成,改變了信號(hào)途徑,但引起細(xì)胞死亡。為了明確這一點(diǎn),用cPTIO處理玉米植株,結(jié)果顯示抑制NO產(chǎn)生能明顯增加H2O2積累,也與王靜等[30]報(bào)道的結(jié)果較一致。

3.3NO和H2O2作為信號(hào)分子調(diào)控了寄主防御酶活性及抗病性

本研究結(jié)果顯示,用NO供體SNP和H2O2處理,及接種彎孢菌均能明顯提高玉米葉片防御酶(PAL、POD、SOD、CAT、Glu等)活性,病菌接種結(jié)果表明，防御酶的活性增加幅度與寄主的抗性呈正相關(guān),暗示增強(qiáng)寄主的防御酶活性就能提高寄主的抗病性,與之前用NO供體和H2O2處理植株的玉米彎孢菌葉斑病發(fā)病輕,用NO和H2O2抑制劑處理植株的玉米彎孢菌葉斑病發(fā)病重結(jié)果相吻合。

但與張少穎等[31]研究結(jié)果:NO的產(chǎn)生抑制了月季植株內(nèi)PAL活性不同,這可能與植物不同、外界脅迫因子不同,導(dǎo)致NO對(duì)PAL活性調(diào)控的生理機(jī)理存在差異有關(guān)。玉米受到彎孢菌侵染后,植株可能通過(guò)NO和H2O2的積累,來(lái)調(diào)控POD、CAT、SOD、PAL、Glu等諸多防御酶的活性,進(jìn)而增強(qiáng)抵御彎孢菌的擴(kuò)展。另外,也有報(bào)道NO和H2O2能誘導(dǎo)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因(GST)、查爾酮合成酶基因(CHS)等抗病和防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而增強(qiáng)植物抗性[32]。然而,NO和H2O2是如何調(diào)控玉米植株中POD、CAT、SOD、PAL、Glu等幾種防御酶活性,以及增強(qiáng)的機(jī)制如何尚不清楚,有待進(jìn)一步研究探討。

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Regulation Mechanisms of NO and H2O2in Maize AgainstCurvularialunata

YAN Honghai1,WU Juxiang2,ZHANG Ruqin1,CHI Yucheng2,SONG Xiyun1,XIA Shuchun1

(1.College of Agronomy and Plant Protection,Qingdao Agricultural University,Qingdao266109,China;2.Shandong Research Institute of Peanuts,Qingdao266100,China)

Abstract：In order to determine the physiological mechanisms of NO and H2O2in the regulation of maize against Curvularia lunata infection.Three maize germplasm 478,Qi319 and Nongda 108 with different resistant to C.lunata were exogenously treated with sodium nitroprusside (SNP),2-(4-Carboxyphenyl-)4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt(cPTIO),hydrogen peroxide (H2O2),ascorbic acid (ASA) and inoculated with C.lunata,then the disease index,NO or H2O2content,and different defense enzymes activity were analyzed.The results indicated that,exogenously treated with NO donor sodium nitroprusside (SNP) or H2O2could slow down the process of C.lunata,reduce the infection rate and the average disease index of the plants,and increase peroxidase (POD),catalase (CAT),phenylalanine ammonia lyase (PAL),superoxide dismutase (SOD) and β-1,3-glucanase activity in maize germplasm 478 plants which have a weak resistance to the pathogen,thus induced a hypersensitive reaction in the maize plants;after inoculation with C.lunata,NO or H2O2content were burst in the leaves of the three maize germplasms,while the scavenger cPTIO and AsA of NO and H2O2could improve the maize infection rate and disease index.Both NO and H2O2are important signals in maize plants,which could improve pathogenesis-related proteins including POD,CAT,SOD,PAL and β-1,3-glucanase activity,and thus enhance the maize resistance against C.lunat.

Key words:Curvularia lunata;NO and H2O2;Host defense enzymes;Resistance physiology

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.026

中圖分類號(hào)：S435.13

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-7091(2016)01-0162-08

作者簡(jiǎn)介：鄢洪海(1964-),男,吉林長(zhǎng)春人,教授,博士,主要從事植物病理學(xué)教學(xué)及研究。嫣洪海、吳菊香為同等貢獻(xiàn)作者。通訊作者：夏淑春(1963-),女,吉林長(zhǎng)春人,副教授,主要從事植物病理學(xué)教學(xué)與科研工作。

基金項(xiàng)目：山東省科技發(fā)展項(xiàng)目(2009GG10009022);山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2011CL005);山東省“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(BS2009NY040)

收稿日期：2015-09-11