王　華,魏玉兵,童建偉,張明軍,王建福,王欣榮,成述儒

(1.甘肅農業(yè)大學 動物科學技術學院,甘肅 蘭州　730070;2.甘肅省張掖市甘州區(qū)平山湖鄉(xiāng)畜牧站,甘肅 張掖　734000)

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綿羊PRKAG3基因SNPs與肉質性狀的相關性分析

王華1,魏玉兵2,童建偉2,張明軍1,王建福1,王欣榮1,成述儒1

(1.甘肅農業(yè)大學 動物科學技術學院,甘肅 蘭州730070;2.甘肅省張掖市甘州區(qū)平山湖鄉(xiāng)畜牧站,甘肅 張掖734000)

摘要：為從分子水平研究甘肅境內典型養(yǎng)殖模式下甘肅高山細毛羊、小尾寒羊、藏羊、蒙古羊和灘羊5個綿羊品種的PRKAG3基因多態(tài)性與屠宰性能和肉品質的相關性,探討以PRKAG3為候選基因,提高綿羊屠宰性能和肉品質的可能性。采用PCR-SSCP技術對5個綿羊品種的PRKAG3基因外顯子4，5和內含子4多態(tài)性進行檢測,并就PRKAG3基因多態(tài)性與9月齡屠宰性能和肉品質進行相關性分析。結果表明,在PRKAG3基因2 689 bp處發(fā)生了A>G的突變,位于第4內含子第23 bp處,表現(xiàn)出3種基因型,AA、AB和BB。純合度(Ho)分別為0.67,0.69,0.76,0.69,0.59,雜合度(He) 分別為0.333 3,0.306 1,0.244 9,0.307 7,0.408 2,有效等位基因(Ne)分別為1.62,1.66,1.69,1.48,1.79,多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.31,0.32,0.33,0.27,0.34。除藏羊外其他4個綿羊品種均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。關聯(lián)分析表明，5個綿羊品種 PRKAG3基因此變異位點的3個基因型間失水率性狀差異顯著(P<0.05);BB基因型個體的胴體重顯著高于AA型(P<0.05),灘羊為極顯著(P<0.01),BB基因型個體的眼肌面積顯著大于AA型(P<0.05)(藏羊除外)。因此說明PRKAG3 基因可作為候選基因用于綿羊產肉性能和肉品質的分子標記輔助選擇。

關鍵詞：綿羊;PCR-SSCP;PRKAG3基因;肉質性狀;關聯(lián)性分析

羊肉的嫩度、多汁性和風味等是消費者對其品質評價的首要指標?？煽康淖匀蛔儺惖谋硇筒町悶橛N選擇提供了重要依據。在家畜基因組研究中從復雜的表型特征中找出這些變異并闡明如何控制這些指標是分子育種的主要目標之一[1]。骨骼肌代謝是一個非常復雜的生物過程,與能量的攝取、利用和環(huán)境因素等緊密相關,它對肌肉的結構和生化特征都產生影響,因此,它對肉品質有很大的影響。腺嘌呤核糖核苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是調控細胞內能量代謝的主要參與者之一[2]。AMPK在真核生物的能量平衡調節(jié)中起了非常重要的作用[3],它是由催化亞基α(α1、α2)[4]以及調節(jié)亞基β(β1、β2)[5]和γ(γ1、γ2、γ3)組成,其中γ3亞基由具有肌肉特異表達特性的PRKAG3(AMP-activated protein kinase γ3)基因編碼[6]。有報道表明,AMPK的亞基發(fā)生變異與生理效應顯著相關。Fontanesi等[7]對7個不同品種的豬進行了PRKAG3基因在骨骼肌中對能量平衡和糖原調節(jié)過程所起作用的研究結果表明,PRKAG3基因的突變與肉質顏色相關性為顯著 (P<0.01)。Milan等[8]對漢普夏豬的PRKAG3基因研究,結果表明,PRKAG3基因的第200個密碼子發(fā)生了錯義突變(Arg200>Gln200),從而使AMPK活性降低,促使骨骼肌中糖原含量顯著升高,最終導致豬肉pH降低,從而造成了RN-效應。Ciobanu等[9]又證實,PRKAG3中緊鄰Arg200的Val199>I1e199 突變具有與RN-效應相反的效應,它使骨骼肌中糖原含量顯著降低,因而有利于肉質的改善。Rothschild等[10]利用等位基因分子標記技術對PRKAG3進行分析并關聯(lián)分析其與繁殖和肉質性狀的關系,并申請了美國國家專利。又有報道證實,豬的PRKAG3基因表達對肉質最終pH 、色度等性狀存在一定的影響[11-12]。李夢云等[13-14]研究結果發(fā)現(xiàn),PRKAG3基因表達量與營養(yǎng)水平有關系,但未達到顯著水平。Yu等[15]分析了韓牛PRKAG3基因的結構與序列,并發(fā)現(xiàn)PRKAG3基因在牛的體內亦只在骨骼肌中高度表達,并可能與肉品質和肌肉相關的遺傳病有一定的關系。Matthieu等[16]對總長8 048 bp的CDS序列進行研究,結果表明,序列共存在32個SNPs位點,平均每250 bp就有1個SNP存在,其中有5個使氨基酸發(fā)生了改變的突變,這表明PRKAG3基因在牛上有很高的變異頻率。由此表明,PRKAG3 基因可能是一個影響肉質的候選基因。

本試驗以甘肅境內典型養(yǎng)殖模式下甘肅高山細毛羊、小尾寒羊、藏羊、蒙古羊和灘羊5個綿羊品種為研究對象,以PRKAG3基因為候選基因,采用PCR-SSCP的方法分析其多態(tài)性,并與屠宰性能和肉質性狀進行相關性分析。目的是進一步認識綿羊的種質特性,希望對甘肅綿羊品種的雜交、選種和早期選育提供基礎參數(shù)和試驗基礎。

1材料和方法

1.1試驗動物

本試驗選用3月齡甘肅本地5個綿羊品種共245只,靜脈采血,所采血樣均為6 mL/只,用ACD 抗凝,-20 ℃凍存。9月齡時對各綿羊品種的每個基因型隨機選取3只按統(tǒng)一標準進行屠宰,測定肉質品質。

1.2主要試劑

TaqDNA聚合酶、非變性聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖和瓊脂粉、蛋白酶K、Tris飽和酚、三氯甲烷、異戊醇、無水乙醇、甲醛、乙酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、硼酸乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、DNA Marker、去離子甲酰胺、溴酚藍等。

1.3性狀測定

主要測定剪切力(Shear force,SF)、蒸煮損失率(Cooking loss rate,CLR)、pH值(pH value)、失水率(Drip loss,DP)、胴體重(Carcass weight,CW)、凈肉重(Net meat weight,NMW)、屠宰率 (Dressing percentage,DP)、凈肉率(Meat percentage,MP)和眼肌面積(Loin muscle area,LMA)。以上性狀依據國家標準GB/T17238-1998進行測定。

1.4引物設計

根據GenBank數(shù)據庫綿羊PRKAG3的登錄號(FJ685774.1)通過Primer 5.0對PRKAG3進行引物設計,并由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列:P5E5-F-5′-GGTGAACCCCACTCCTCT-3′;P5E5-R-5′-CATCCTCTACCCTGGGTCCTT-3′。

1.5DNA提取及 PCR反應體系和程序

采用常規(guī)的酚-氯仿抽提法[17]從血樣中提取基因組DNA 。

PCR反應體系為25 μL,其中模板DNA 1 μL(100 μmol/L),上游引物1 μL(10 μmol/L),下游引物1 μL(10 μmol/L),mixTaq酶12.5 μL(1.25 U),最后加ddH2O至總反應體系25 μL。

擴增程序:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.6PCR-SSCP分析

PCR檢測完成后,取PCR產物2 μL與 8 μL的上樣緩沖液混勻,然后98 ℃變性10 min,迅速冰浴5 min,用移液槍將變性樣品點于12%非變性聚丙烯酰胺凝膠[m(Acr):m(Bis)=39∶1]中,180 V,8 ℃電泳16 h,硝酸銀染色[18]判型。

1.7數(shù)據統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0軟件對PRKAG3基因外顯子4，5和內含子4基因多態(tài)性位點在不同綿羊群體中的基因型進行統(tǒng)計分析,根據下列模型進行最小二乘分析,比較各項觀察值在PRKAG3基因型之間的差異。

Yijkm=u+Gi+BFj+Lk+Sm+eijkm

式中:Yijkm為個體某性狀表型值,u為總體均值,Gi為基因型效應,BFj為第j個品種和羊場的合并固定效應,Lk為地區(qū)效應,Sm為性別效應,eijkm為隨機誤差。

2結果與分析

2.1PCR產物檢測結果

對PRKAG3基因進行擴增,隨機選擇若干個樣品的PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測(圖1),結果表明,擴增片段與目的片段(321 bp)大小一致,且特異性好,可用于SSCP分析。

圖1　PCR擴增

2.2SSCP檢測與判型

對外顯子4，5和內含子4的擴增產物進行SSCP分析發(fā)現(xiàn)3種基因型(圖2),并將不同基因型個體挑選幾個進行測序,測序結果表明(圖3),第2 689 bp位點處即內含子4第23 bp處存在A>G突變,其中將位點為A堿基的帶型命名為AA型,為G堿基的命名為BB型,雜合子為AB型,測序結果與電泳結果一致。

圖2　擴增序列SSCP檢測

圖3　測序結果對比

2.3PRKAG3基因型頻率和基因頻率分析

采用群體遺傳學方法,對5個綿羊品種PRKAG3基因變異位點的基因型頻率和基因頻率進行分析(表1),結果表明,小尾寒羊AA基因型頻率最高為0.80,灘羊最低為0.48。小尾寒羊等位基因A基因頻率最高0.89,灘羊最低為0.68。在不同的綿羊群體中等位基因A的頻率都在0.5以上,為優(yōu)勢等位基因。AA基因型頻率除灘羊外都在0.5以上,為優(yōu)勢基因型。

2.4純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量和哈代-溫伯格平衡檢驗分析

對5個綿羊品種進行純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)和χ2檢驗分析,結果表明(表2),灘羊的雜合度最高,其次為甘肅高山細毛羊,5個綿羊品種的PIC值均為0.25~0.50,為中度多態(tài)。經χ2檢驗,藏羊偏離哈代-溫伯格平衡狀態(tài),其余綿羊品種在該位點均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。

表1　基因型頻率和基因頻率

表2　五個綿羊品種純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量和哈代-溫伯格平衡檢驗分析

表3　不同基因型屠宰性狀關聯(lián)分析

注：同行不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表4同。

Note:In the same line,values with different letter mean very significant difference(P<0.01);Values with different capital lowercase mean significant difference(P<0.05).The same as Tab.4.

2.5PRKAG3不同基因型屠宰性狀關聯(lián)分析

PRKAG3基因第4,5外顯子和第4內含子突變位點不同基因型屠宰性狀分析(表3),結果表明,各個品種蒙古羊、小尾寒羊、藏羊和甘肅高山細毛的基因型間BB型個體的胴體重最小二乘均值顯著高于 AA型(P<0.05),灘羊為極顯著(P<0.01)。對于凈肉重各基因型之間沒有顯著差異，對于凈肉率除小尾寒羊各基因型之間沒有顯著差異。對于眼肌面積除藏羊外其他4個綿羊品種基因型BB個體顯著大于基因型AA個體(P<0.05)。對于屠宰率指標藏羊和蒙古羊之間各基因型間沒有顯著性,但其他3個綿羊品種間的BB型屠宰率最小二乘均值顯著高于AA型(P<0.05)。

2.6PRKAG3不同基因型肉質性狀關聯(lián)分析

PRKAG3基因第4,5外顯子和第4內含子突變位點不同基因型肉質性狀分析(表4),結果表明,突變位點對5個綿羊品種的失水率有顯著影響(P<0.05)。蒙古羊和灘羊的剪切力基因型BB個體顯著低于AA型個體(P<0.05)。灘羊與甘肅高山細毛羊的基因型BB個體與AA型個體pH值有顯著差異(P<0.05)，但總的趨勢是BB型優(yōu)于AA型,其失水率較高,剪切力較低。

表4　不同基因型肉質性狀關聯(lián)分析

3討論與結論

自20世紀初,隨著生活水平的提高以及對食品安全的考慮,人們對草食畜肉類的需求量呈逐年增加,導致羊肉價格不斷上揚,綿羊的發(fā)展方向由毛用轉向肉毛兼用或肉用,綿羊的品種和類型的結構相應的發(fā)生了變化。自改革開放以來,受世界養(yǎng)羊業(yè)由毛用向肉用轉型的趨勢影響,以及國內羊肉需求量增加、羊肉價格不斷攀升等市場因素推動,羊肉生產得到迅速發(fā)展。甘肅省作為我國五大牧區(qū)之一,肉羊生產發(fā)展迅猛,但隨著社會經濟的發(fā)展和人們生活質量的提高,人們也越來越關注羊肉的品質,PRKAG3基因是影響羊肉品質的候選基因,它主要在骨骼肌中特異性表達,目前已被作為影響肉質性狀的一個主要基因在家畜上廣泛研究。

李夢云等[19]研究表明，二甲雙胍可激活PRKAG3基因的表達,進而影響豬生長性能和肉質，同時馬琳旭等[20]證實，日糧中添加甜菜堿可以不同程度地提高育肥豬PRKAG3基因的表達量。哈?！ぐ涂说萚21]對雞的PRKAG3研究發(fā)現(xiàn)其變異對pH值有顯著影響。李靜[22]對延邊黃牛研究發(fā)現(xiàn)PRKAG3基因突變對天冬氨酸有一定的正面影響，對谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸和纈氨酸含量均有一定的負面影響。田萬強[23]在牛PRKAG3基因上共檢出45個SNPs位點，關聯(lián)分析表明,突變位點對牛的不同性狀均有影響。靳海等[24]研究表明，山羊的PRKAG3基因5′調控區(qū)和外顯子13存在大量變異位點。王耀武[25]研究表明在脂肪生成以及脂肪沉積組織中，不同綿羊PRKAG3基因的表達水平上有顯著差異。陶曉臣等[26-27]研究結果表明不同綿羊PRKAG3基因mRNA表達量差異不顯著。盧亞洲[28]對PRKAG3基因外顯子多態(tài)位點與綿羊肉品質性狀指標關聯(lián)性進行了分析發(fā)現(xiàn)，PRKAG3多態(tài)位點與灘羊肉質顏色和pH值存在互作效應，差異極顯著。

本研究在綿羊的PRKAG3基因外顯子4，5和內含子4進行多態(tài)位點分析,在內含子4的第23 bp處發(fā)現(xiàn)一個A>G堿基突變所造成AA、AB、BB 3種基因型,AA為優(yōu)勢基因型,A為優(yōu)勢等位基因。對5個綿羊品種進行純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因(Ne)、多態(tài)信息含量(PIC)和χ2檢驗分析結果表明,5個綿羊品種的PIC值均為0.25~0.50,為中度多態(tài),PIC值分析說明,本研究所檢測到的變異位點在各個綿羊群體中都存在一定的遺傳變異。經χ2檢驗,藏羊偏離哈代-溫伯格平衡狀態(tài),這可能是由于人工飼養(yǎng)選育結果而改變的,其余綿羊品種在該位點均處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。灘羊的雜合度比其他各品種高,表明灘羊PRKAG3 基因的多態(tài)性相對較高。

對各個基因型進行屠宰及肉品質性狀關聯(lián)性分析,屠宰性狀表明各個品種蒙古羊、小尾寒羊、藏羊和甘肅高山細毛的基因型間BB型個體的胴體重最小二乘均值顯著高于AA型(P<0.05),灘羊為極顯著(P<0.01)。說明在屠宰方面,此變異位點對灘羊的影響更大一些。凈肉重性狀指標沒有顯著性差異，凈肉率指標除小尾寒羊其他各基因型之間沒有顯著差異，說明此變異位點對凈肉重和凈肉率的影響不大。肉品質關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點所對應的失水率基因型效應有達到顯著水平的趨勢,此多態(tài)位點所對應的失水率BB基因型最小二乘均值顯著高于AB或AA基因型最小二乘均值(P<0.05)。對于剪切力除甘肅高山細毛羊外其他4個品種均有顯著性影響趨勢,說明此變異位點對甘肅高山細毛羊剪切力影響較小。盧亞洲[28]對PRKAG3基因外顯子多態(tài)位點與綿羊肉品質性狀指標關聯(lián)性進行了分析發(fā)現(xiàn),PRKAG3多態(tài)位點與灘羊肉質顏色和pH值存在互作效應,差異極顯著。本研究所出現(xiàn)的性狀差異可能是由于多數(shù)性狀存在品種與基因型的互作效應所致，但這也可能是由于屠宰個體數(shù)少所造成的抽樣誤差。盡管如此,筆者仍可以看出,PRKAG3 不同基因型個體的各屠宰指標確有明顯差異。因此,PRKAG3 基因有可能作為一個候選基因用于綿羊產肉性能的分子標記輔助選擇。

在甘肅境內典型養(yǎng)殖模式下甘肅高山細毛羊、小尾寒羊、藏羊、蒙古羊和灘羊5個綿羊品種的PRKAG3基因產生了不同的多態(tài)性,基因型和品種間的互作效應可能造成了不同綿羊品種的屠宰性能和肉品質性能的差異性。但總的來說,PRKAG3基因的變異引起了綿羊肉品質的變化。

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PRKAG3 Gene SNPs of Sheep and Correlation Analysis of Meat Quality Traits

WANG Hua1,WEI Yubing2,TONG Jianwei2,ZHANG Mingjun1,WANG Jianfu1,WANG Xinrong1,CHENG Shuru1

(1.Faculty of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou730070,China;2.Pingshanhu Animal Husbandry Station of Ganzhou Country,Zhangye City,Gansu Province,Zhangye734000,China)

Abstract：In order to study the relationship between the PRKAG3 gene polymorphism and slaughter performance,meat quality of 5 sheep breeds(Gansu alpine fine wool sheep,Small tail han sheep,Tibetan,Mongolian sheep and Tan-sheep which were fed in a typical farming mode of Gansu province) in Gansu province at the molecular level and to explore the possibility of improving the slaughter performance and quality of sheep meat by using PRKAG3 as candidate gene,the polymorphism of exon 4,5and introns 4,a total of 321 bp,of PRKAG3 gene was detected by PCR-SSCP in 5 sheep breeds,and the association between PRKAG3 gene polymorphism and slaughter performance,meat quality in aged 9 month were analyzed.The results showed:that B allele had a base transformation of A>G at the 2 689th bp in intron 4 formed AA,AB and BB genetypes.The gene homozygosity (Ho)were 0.67,0.69,0.76,0.69 and 0.59 respectively;the heterozygosity were 0.333 3,0.306 1,0.244 9,0.307 7 and 0.408 2,respectively;the effective number of alleles (Ne) were 1.62,1.66,1.69,1.48 and 1.79;the polymorphism information content (PIC) were 0.31,0.32,0.33,0.27 and 0.34,respectively.In addition to the Tibetan sheep other four sheep breeds on this loci in a Hardy-Weinberg equilibrium state by Chi-square test.Association analysis of the SNPs with meat quality traits was carried out.The result showed that the mutation loc of PRKAG3 gene was significantly associated (P<0.05) with meat water loss rate,genotype BB between individual′s body weight was significantly higher than AA type (P<0.05),Tan-sheep was very significant(P<0.01).The eye muscle area was significantly greater between a BB genotype and AA type (P<0.05).So,PRKAG3 gene can be used as a candidate gene for marker-assisted selection of sheep meat performance and meat quality.

Key words:Sheep;PCR-SSCP;PRKAG3 gene;Meat quality traits;Association analysis

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.022

中圖分類號：Q78;S858.03

文獻標識碼：A

文章編號：1000-7091(2016)01-0134-07

作者簡介：王華(1990-),男,山東臨沂人,在讀碩士,主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。通訊作者：成述儒(1976-),男,甘肅張掖人,副教授,博士,碩士生導師,主要從事生物技術與動物育種研究。

基金項目：甘肅省農業(yè)生物技術研究與應用開發(fā)項目(GNSW-2012-26)

收稿日期：2015-11-23