李 娟， 吳永勝， 楊 雪， 邱時秀， 許禎瑩， 雷春龍， 孫越鴻， 齊桂蘭

(成都市農(nóng)林科學院畜牧研究所，四川成都 611130)

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蚯蚓抗菌肽的研究進展

李 娟， 吳永勝， 楊 雪， 邱時秀， 許禎瑩， 雷春龍， 孫越鴻， 齊桂蘭

(成都市農(nóng)林科學院畜牧研究所，四川成都 611130)

摘要抗菌肽是一類廣泛存在于自然界生物體中的小肽類物質(zhì)，是機體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。由于其具有分子質(zhì)量小和抗菌譜廣等特點以及不同于抗生素的全新的抗菌機制，在藥物開發(fā)領域和畜禽飼料添加劑等領域具有廣闊的應用前景。蚯蚓抗菌肽種類多，具有良好的抑菌效果。對蚯蚓抗菌肽的分類、功能及其在生產(chǎn)中的應用研究進展進行了綜述。

關鍵詞蚯蚓；抗菌肽；抑菌效果；應用

Research Progress of Earthworm Antibacterial Peptide

LI Juan,WU Yong-sheng,YANG Xue et al (Institute of Animal Science,Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Chengdu,Sichuan 611130)

Abstract Antibacterial peptide is a small peptides widely distributed in the organisms in nature.It is an important part of the innate immune system.Due to characteristics of small molecular weight and broad antifungal spectrum,antibacterial peptide has wide application prospect in the fields of drug development,livestock and poultry feed additives.There are many kinds of earthworm antibacterial peptides,which have relatively good bacteriostat.In this research,the research progress of the classification and function of earthworm antibacterial peptides was briefly reviewed,as well as its application in production

Key wordsEarthworm; Antibacterial peptide; Bacteriostatic effect; Application

抗菌肽(Antibacterial peptide,ABP)，又稱抗微生物肽(Antimicrobial peptide,AMP)或肽抗生素(Peptide antibiotics)。世界上第一個被發(fā)現(xiàn)的抗菌肽是1980年由瑞典科學家G.Boman等經(jīng)過注射陰溝通桿菌及大腸桿菌誘導惜古比天蠶蛹而產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽，定名為Cecropins。由于這類活性多肽對細菌具有廣譜高效殺菌活性，隨著抗生素耐藥微生物的涌現(xiàn)，越來越多的生產(chǎn)廠家期望應用安全無毒的抗菌劑，使得抗菌肽在醫(yī)藥行業(yè)和飼料添加劑等領域應用前景十分廣闊[1]。

據(jù)報道，廣東有研究人員將生產(chǎn)的抗菌肽酵母制劑用作飼料添加劑來治療仔豬白痢和雛雞白痢，取得明顯效果，并成功通過中試[2]。蚯蚓通常生活在充滿大量致病微生物的環(huán)境，生命力強且極少患病，因其具有經(jīng)過長期進化而形成的抵抗外來微生物侵襲的機制。人們采用現(xiàn)代生物技術從蚯蚓中分離到多種生物活性成分，如抗菌肽、免疫球蛋白、纖溶酶、纖溶酶原激活劑、抗氧化酶系和抗腫瘤成分等[3]。蚯蚓抗菌肽種類多，抑菌效果好，在飼料添加劑等領域中應用前景廣闊。筆者對蚯蚓抗菌肽的分類、功能及其在生產(chǎn)中的應用研究進展進行了綜述。

1蚯蚓抗菌肽的分類

1.1金屬蛋白Dhainaut等[4]在蚯蚓體腔G1粒細胞中分離到2個10 ku的亞基組成的二聚體蛋白，這種蛋白與鎘結合蛋白結構極其相似，是一種能抑制大腸桿菌和微球菌的金屬抗菌蛋白。

1.2蚯蚓體內(nèi)具有溶血作用的抑菌蛋白Valembois等[5]報道蚯蚓體腔液中的溶血蛋白和抑菌蛋白為同一種分子量的脂蛋白。張陽等[6]采用凝膠層析和離子交換層析純化，得到一種蚯蚓體腔液蛋白，其分子量約為38.6 ku，比濁抑菌試驗表明，低濃度受試樣品作用大腸桿菌1 h出現(xiàn)抑制效果，作用金黃色葡萄球菌3 h出現(xiàn)抑制效果，表明該樣品具有一定抑制細菌生長的活性；此外，研究發(fā)現(xiàn)該蛋白還具有較強的溶解雞紅細胞的作用，溶解紅細胞的最低濃度為0.39 μg/mL，說明此蛋白的生物活性可能是通過破壞細胞結構而實現(xiàn)。

1.3不具有溶血特性的抗菌蛋白

1.3.1Lumbricin I。Cho等[7]采用親和層析和反相HPLC技術從蚯蚓中分離純化出一種新型的抗菌肽Lumbricin I，這種抗菌肽是含脯氨酸的62的氨基酸的肽類，分子量為7 231 u，cDNA序列分析證明其為一種76氨基酸的前體形式，在體外試驗中表現(xiàn)出廣譜抗微生物活性，而不會溶血；序列中的第6~34位殘基分離的29氨基酸肽還顯示出比Lumbricin I具有更強的抗菌活性，稱為Lumbricin I(6-34)，而且其Lumbricin 基因mRNA表達具有特異性，只在成年蚯蚓體內(nèi)檢測到，而在幼蚓和蚓卵中均無表達。趙曉瑜等[8]研究發(fā)現(xiàn)人工合成的Lumbricin I(6-34)也稱為蚯蚓29肽，具有廣譜性，能夠有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等常見細菌，同時還能夠抑制釀酒酵母、露濕漆斑菌、總狀毛霉等真菌；蚯蚓29肽活力高，當質(zhì)量濃度為9 mg/L時對大腸桿菌有明顯的抑制效果；蚯蚓29肽穩(wěn)定性強，在pH為2.2或11.0的環(huán)境中抑菌活性不變，而且在煮沸10 min后仍能保留80%以上的活性。李國建[9]構建了融合表達載體pGEX-4T-2-29aa和非融合表達載體pBV221-29aa。 SDS-PAGE結果表明，2個載體分別表達了融合的GST-29肽和游離的29肽產(chǎn)物。融合蛋白GST-29肽經(jīng)凝血酶作用去掉GST標簽后的游離29肽沒檢測到具有抑菌活性，可能由于切點處多了2個氨基酸影響到29肽的活性結構。非融合載體表達的游離29肽產(chǎn)物以包涵體形式存在，雖然表達量不高，但是復性后表現(xiàn)出抑菌活性。

1.3.2Fetidins。Fetidins是由蚯蚓的黃體細胞分泌的2種有抑菌活性的蛋白，其表觀分子量分別為40和45 ku，是蚯蚓體腔液的主要組分，占其總蛋白量的20%左右，能夠抑制病原菌嗜水性單胞菌、巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和柑橘類支原體檸檬螺旋體的生長[10]。

2蚯蚓抗菌肽抑菌效果的影響因素

2.1分子量對蚯蚓抗菌肽抑菌效果的影響劉艷琴等[11]分離到由幾個氨基酸組成的分子量小于1 ku的寡肽類，研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓寡肽通過抑制PRV的復制起到抑制PRV引起的細胞病變的作用。王莊等[12]從蚯蚓體內(nèi)分離純化30 ku以下的抗菌肽，通過電擊誘導蚯蚓產(chǎn)生抗菌肽、超濾濃縮脫鹽以及截取3~30 ku的抗菌肽、用陽離子交換分離提純得到分子量為3~30 ku的蚯蚓抗菌肽，發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量在5.856~7.823 ku的蚯蚓抗菌肽比分子量為14.40~20.00 ku范圍的抑菌效果好。

2.2濃度對蚯蚓抗菌肽抑菌效果的影響王慶華等[13]研究表明蚯蚓抗菌肽的抑菌效果相當于稀釋度為1×10-4~1×10-3的硫酸慶大霉素溶液，且隨著蚯蚓量的增加，提取物的抑菌效果也相應增加。

2.3pH對蚯蚓抗菌肽抑菌效果的影響鄭津輝等[14]研究表明蚯蚓抗菌肽對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用，同時證實蚯蚓抗菌肽抗菌性受pH的影響不大。

2.4水解時間對蚯蚓抗菌肽抑菌效果的影響賈久滿等[15]對經(jīng)過4、5、6 h水解的蚯蚓水解液進行離心和過濾，并采用濾紙片法和打孔法測定蚯蚓水解液對大腸桿菌的抑菌效果，結果表明經(jīng)過5 h水解的蚯蚓水解液對大腸桿菌抑菌效果最好。

3蚯蚓抗菌肽在生產(chǎn)中的應用

趙琴等[16]研究發(fā)現(xiàn)巴氏桿菌感染兔48 h后，兔體內(nèi)的TNF-α和NO含量以感染組最高，飼料中添加3~30 ku蚯蚓抗菌肽低、中、高劑量組次之，對巴氏桿菌具有明顯的抑菌效果，高劑量的抑菌效果最為顯著，試驗表明蚯蚓抗菌肽能提高兔的免疫力。李曾夏子[17]用3~30 ku蚯蚓抗菌肽對兔巴氏桿菌病進行治療，測定各組試驗兔的白細胞、嗜中性白細胞數(shù)、體內(nèi)細菌動態(tài)數(shù)、TNF-α和NO含量及TLR4的mRNA含量，結果發(fā)現(xiàn)蚯蚓抗菌肽能有效刺激免疫反應，在致病初期迅速提高白細胞的增生能力，抑制體內(nèi)細菌增長并有殺滅作用，并能有效遏制體內(nèi)炎性因子TNF-α和NO的迅速增長，減輕巴氏桿菌感染所造成的肺部炎性反應損傷。

吳海等[18]研究表明添加0.6%~1.0%的蚯蚓抗菌肽粗品均可以顯著降低0~21日齡雛雞的料肉比。李冬光等[19]在黃雞日糧中添加蚯蚓抗菌肽對黃雞生產(chǎn)性能進行研究，結果表明日糧中添加蚯蚓抗菌肽能顯著提高貴州黃雞日均增重，降低料重比，降低發(fā)病率和死亡率。賈久滿等[20]通過蚯蚓自身的體內(nèi)酶水解制取蚯蚓浸出液，結果表明蚯蚓水解液與浸出液對大腸桿菌的抑菌效果相近，蚯蚓水解液中含有一定量的抗菌肽類物質(zhì)并具有較好的抗菌活性。

4展望

抗生素作為飼料添加劑的使用已引起了爭議，在抗生素逐步被禁用而新代用品尚未出現(xiàn)的情況下，研究開發(fā)蚯蚓抗菌肽代替抗生素作新型飼料添加劑將具有巨大的經(jīng)濟效益和深遠意義。

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收稿日期2016-01-04

作者簡介李娟(1984- )，女，湖北荊門人，畜牧師，博士，從事動物遺傳育種及生物技術研究。

基金項目成都市科技惠民技術研發(fā)項目(2015-HM01-00351-SF)。

中圖分類號S 899.8

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-062-02