石 杰， 高 宇， 劉 玉， 孫宇峰， 劉宇峰， 胡安·卡洛斯

(1.黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319；2.塞維利亞大學(xué)，西班牙 41012)

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費(fèi)氏中華根瘤菌菌株HH103研究概述

石 杰1， 高 宇1， 劉 玉1， 孫宇峰1， 劉宇峰1， 胡安·卡洛斯2

(1.黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319；2.塞維利亞大學(xué)，西班牙 41012)

摘要大豆既可以與快生型根瘤菌又可以與慢生型根瘤菌共生固氮。在以往的研究中，已有很多從不同地區(qū)的大豆根部分離出來的快生型根瘤菌，這些快生型根瘤菌大多數(shù)屬于費(fèi)氏中華根瘤菌屬。模式菌株費(fèi)氏中華根瘤菌菌株HH103現(xiàn)被用于基因序列的研究。該研究從根瘤和根瘤菌的分類依據(jù)和主要類型入手，介紹了HH103的主要研究現(xiàn)狀，并且討論其研究方向。

關(guān)鍵詞費(fèi)氏中華根瘤菌HH103；基因序列；大豆結(jié)瘤

根瘤菌隸屬于α和β變形菌門，能夠與豆科植物共生固氮。在根瘤菌與豆科植物之間復(fù)雜的分子水平物質(zhì)交流的基礎(chǔ)上，豆科植物的根部形成一種新的有機(jī)體形式——根瘤。在根瘤中氮?dú)饪梢员还潭?，轉(zhuǎn)化成銨態(tài)氮被植物吸收。從宏觀的科學(xué)角度來講，根瘤菌與豆科植物之間共生關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)的是原核生物與真核生物之間復(fù)雜的關(guān)系。這也為研究病原菌侵染動(dòng)物或人預(yù)防嚴(yán)重疾病提供有力的科學(xué)證據(jù)。同時(shí)，在實(shí)際應(yīng)用中，施用根瘤菌不但能夠減少糧食種植成本，而且能減少環(huán)境污染。

費(fèi)氏中華根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)HH103是世界上被發(fā)現(xiàn)較早的一株快生型根瘤菌，它以結(jié)瘤率高、宿主廣譜等特點(diǎn)成為研究快生型根瘤菌的模式菌株。目前，全世界已獲得全基因組序列的大豆根瘤菌菌株只有NGR234、USDA257和 HH103，其中快生型根瘤菌只有HH103。費(fèi)氏中華根瘤菌HH103既可以與美國大豆品種共生固氮，又可以與亞洲大豆品種及其他多種豆科植物共生固氮。學(xué)者們對(duì)菌株HH103的研究已經(jīng)達(dá)到一定深度，又因其結(jié)瘤率高，宿主范圍廣譜，一直作為根瘤菌研究的模式菌株。筆者從根瘤和根瘤菌的分類依據(jù)和主要類型入手，介紹了費(fèi)氏根瘤菌HH103的主要研究現(xiàn)狀，包括菌株HH103的基因組成、結(jié)瘤因子及表面多糖的研究進(jìn)展，并且討論了費(fèi)氏菌株HH103的研究方向。

1根瘤及根瘤菌的分類概述

豆科植物的根瘤有2種類型，一種是定型根瘤，另一種是不定型根瘤。定型根瘤是球形的，分生組織活動(dòng)只在早期進(jìn)行，主要形成于熱帶和亞熱帶豆科植物根部。相反，不定型根瘤的分生組織活動(dòng)是永久的，所形成的根瘤是圓柱形的，存在于溫帶豆科作物(如苜蓿和三葉草)根部。根瘤菌的分類方式較多，如根據(jù)代時(shí)，分為慢生型根瘤菌(6 h以上)和快生型根瘤菌(2~3 h)；根據(jù)基因組的構(gòu)成，分為只有1條染色體組的和同時(shí)兼具質(zhì)粒的根瘤菌；根據(jù)宿主植物不同，還分為專一和廣譜型根瘤菌。實(shí)際上，根瘤菌和豆科植物的共生特異性很高。苜蓿中華根瘤菌就屬于專一性根瘤菌，只能與少數(shù)豆科植物共生固氮，而費(fèi)氏中華根瘤菌則是廣譜型根瘤菌，能夠與多種豆科植物共生固氮。

我國土壤中富含大量能夠與大豆結(jié)瘤的細(xì)菌。最開始人們對(duì)根瘤菌的認(rèn)知只限于慢生型根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)，直到世界上第一株費(fèi)氏中華根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)于1982年從我國生長的大豆根瘤中分離出來[1]。此后，費(fèi)氏菌株又相繼在世界其他不同地區(qū)被分離出來，如新幾內(nèi)亞島或西班牙格拉納達(dá)。由于費(fèi)氏菌株表現(xiàn)出非常優(yōu)異的廣譜特性，它是一種很好的用于研究競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤的模式菌株。

2費(fèi)氏中華根瘤菌HH103

費(fèi)氏中華根瘤菌HH103被分離于1985年中國湖北省洪湖縣土壤中[2]，土樣取自于傳統(tǒng)的大豆種植區(qū)。種植品種主要是亞洲大豆品種歐皇三號(hào)。費(fèi)氏中華根瘤菌菌株HH103能與美國和亞洲大豆品種共生結(jié)瘤，也能與很多其他豆科植物共生固氮，形成定型或不定型根瘤。有研究表明，能夠與費(fèi)氏菌株USDA257共生結(jié)瘤的豆科植物均能夠與菌株HH103共生結(jié)瘤，而不能與費(fèi)氏菌株USDA257共生結(jié)瘤的大多數(shù)美國農(nóng)業(yè)上先進(jìn)的大豆品種也能夠與菌株HH103共生結(jié)瘤[3]。

2.1土著質(zhì)粒構(gòu)成質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳顯示，費(fèi)氏中華根瘤菌HH103中含有5種內(nèi)源質(zhì)粒。基因組測(cè)序分析證實(shí)了這5個(gè)質(zhì)粒的存在，其中最大的2個(gè)質(zhì)粒被稱為pSfrHH103e和pSfrHH103d，大小分別為2.40和0.50 Mb，與根瘤菌NGR234的質(zhì)粒構(gòu)成類似[4]。據(jù)初步分析，HH103最大的質(zhì)粒(pSfrHH103e)攜帶多種用于生產(chǎn)各種表面多糖如胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)、莢膜多糖(KPS)的基因；第二大質(zhì)粒(pSfrHH103d)是一個(gè)典型的共生質(zhì)粒(pSym)，結(jié)瘤固氮基因位于第二大質(zhì)粒上。pSfrHH103c的電泳遷移率表明，該質(zhì)粒略小于0.15 Mb。對(duì)質(zhì)粒pSfrHH103b(61 880 bp)和pSfrHH103a(24 036 bp)序列的初步計(jì)算機(jī)分析顯示，在質(zhì)粒序列上存在大量的轉(zhuǎn)座子，如它們每個(gè)都含有HH103中2個(gè)ISRf1拷貝中的一個(gè)。這是到目前為止只在費(fèi)氏中華根瘤菌菌株中被發(fā)現(xiàn)的插入序列[5]。

2.2結(jié)瘤基因結(jié)瘤基因(nod、nol和noe)是指那些具有指導(dǎo)結(jié)瘤或共同配合調(diào)節(jié)基因作用的根瘤菌基因[6-7]。目前，對(duì)費(fèi)氏中華根瘤菌HH103的結(jié)瘤基因即參與合成或分泌游離蛋白和作為調(diào)節(jié)基因的結(jié)瘤基因已有報(bào)道。除了nolR位于pSym質(zhì)粒(pSfrHH103d)上，nolR調(diào)節(jié)基因位于細(xì)菌染色體上外，所有這些費(fèi)氏中華根瘤菌HH103的nod基因的序列和分布都與根瘤菌NGR234相同。例如，它們都有2個(gè)nodD的拷貝(nodD1和nodD2)，在2株菌種中都有基因群組nolK-noeL-nodZ-noeK-noeJ-nodD1和nodA-nodB-nodC-nodI-NodJ-nolO-noeI-noeE。然而，雖然nolO基因能夠在NGR234中起作用，但因?yàn)?型移碼突變?cè)贖H103中存在不能發(fā)揮作用。

2.3結(jié)瘤因子根瘤菌產(chǎn)生脂幾丁質(zhì)寡糖信號(hào)分子，被稱為LCOs或Nod因子，可用于應(yīng)答植物產(chǎn)生的黃酮類化合物。目前，從大豆根部產(chǎn)生的最豐富的黃酮類化合物中分離出7，4′-二羥基異黃酮、染料木黃酮和香豆雌酚。植物黃酮類化合物與細(xì)菌的NodD蛋白相互作用，引起根瘤菌結(jié)瘤基因的轉(zhuǎn)錄激活。結(jié)瘤基因的表達(dá)最終導(dǎo)致結(jié)瘤因子的產(chǎn)生，從而引起根毛的卷曲和植物根瘤分生組織的分化。其核心骨架是乙酰氨基葡萄糖寡聚體，并且連接上一個(gè)不飽和脂肪酸，一些基團(tuán)被不同程度地修飾。費(fèi)氏中華根瘤菌HH103產(chǎn)生的結(jié)瘤因子與慢生型根瘤菌(如B.japonicum或B.elkanii)產(chǎn)生的結(jié)瘤因子結(jié)構(gòu)上的不同主要是位于非還原末端的乙酰葡萄糖殘基不同。在慢生型菌株中己糖可以攜帶甲基、乙?；?或氨基甲?；?。相反，費(fèi)氏菌株HH103產(chǎn)生的結(jié)瘤因子則沒有這些修飾[8]。

2.4表面多糖除了結(jié)瘤基因和結(jié)瘤因子，成功地定殖結(jié)瘤還需要根瘤菌表面分泌的各種多糖物質(zhì)。環(huán)葡聚糖(CG)、胞外多糖(EPS)、脂多糖(LPS)、莢膜多糖(KPS或K-抗原)是主要的根瘤菌多糖，它們?cè)诠采饔眠^程中起著舉足輕重的作用。在根瘤菌菌株中，KPS只有在苜蓿中華根瘤菌、費(fèi)氏中華根瘤菌株中略見報(bào)道。

2.4.1環(huán)葡聚糖(CG)。費(fèi)氏根瘤菌HH103產(chǎn)生的CG只含有β-(1,2)糖苷鍵連接的葡萄糖殘基，數(shù)目有18~24，磷酸甘油是其唯一的取代基。費(fèi)氏中華根瘤菌HH103中cgs基因突變株不能產(chǎn)生CG，在任何豆科作物(包括形成定型根瘤的大豆和豇豆及形成不定型根瘤的烏拉干草)的測(cè)試中均不能使植物產(chǎn)生根瘤。這株費(fèi)氏中華根瘤菌HH103cgs基因的突變株(SVQ562)還顯示出其他表型性狀的改變，如EPS的增加、EPS代謝物分子量的增加，以及移動(dòng)性的缺失[9]。SVQ562在低滲的GYM培養(yǎng)基中比野生菌株生長得慢，說明突變株對(duì)低滲條件更加敏感。然而，SVQ562能夠在蒸餾水中生存，說明HH103在極低滲溶液中生存不需要環(huán)葡聚糖。

2.4.2胞外多糖(EPS)。雖然對(duì)費(fèi)氏中華根瘤菌HH103的 EPS的化學(xué)結(jié)構(gòu)尚未測(cè)定，但已知攜帶了乙酰基和丙酮酸取代基。琥珀酰取代基的缺失說明exoH基因不存在于費(fèi)氏菌株HH103的基因組中。與在苜蓿根瘤菌1021和大豆根瘤菌NGR234中的情況一樣，費(fèi)氏菌株HH103的exo基因簇位于最大的質(zhì)粒(pSfrHH103e)上。據(jù)初步計(jì)算，發(fā)現(xiàn)調(diào)控基因exoS、exoR、mucR1和mucR2位于染色體上。不能產(chǎn)生EPS的突變株SVQ530(exoA基因突變)并不能降低它與大豆的共生能力，說明這種多糖在費(fèi)氏菌株和大豆的共生系統(tǒng)中不起主導(dǎo)作用[10]。

2.4.3K-抗原或莢膜多糖(KPS)。參與KPS生物合成根瘤菌基因是在苜蓿根瘤菌RM41中被描述的。這些基因被稱為rkp基因，分布于3個(gè)不同的被稱為rkp-1、rkp-2和rkp-3的基因簇中。這3個(gè)不同基因簇同樣存在于費(fèi)氏中華根瘤菌HH103中。費(fèi)氏中華根瘤菌HH103 的rkp-1區(qū)域位于染色體上，包含rkpU、rkpA、rkpG、rkpH、rkpI、rkpJ和kpsF3 7個(gè)不同的基因。所有這些rkp基因的突變株均不能產(chǎn)生KPS。大豆植株接種rkp基因的突變株會(huì)降低結(jié)瘤，并顯示氮營養(yǎng)缺乏。

費(fèi)氏中華根瘤菌HH103的rkp-2區(qū)域也位于染色體上，是由與苜蓿根瘤菌RM41rkp-2區(qū)域高度同源的2個(gè)基因(lpsL和rkpK)構(gòu)成的。費(fèi)氏菌株HH103在rkp2區(qū)域的突變株尚未構(gòu)建。費(fèi)氏中華根瘤菌HH103基因組測(cè)序表明，rkp-3區(qū)域位于pSfrHH103e質(zhì)粒上，這個(gè)區(qū)域有6個(gè)基因存在于苜蓿根瘤菌中[11-12]。在根瘤菌NGR234中，rkpP基因是缺失的。其他參與KPS運(yùn)輸?shù)幕?rkpR、rkpS和rkpT)或決定KPS鏈長度的基因(rkpZl)也在pSfrHH103e質(zhì)粒上。目前研究結(jié)果表明，費(fèi)氏菌株HH103與大豆共生的能力與KPS而不是EPS有關(guān)。

2.4.4脂多糖(LPS)。脂多糖是大多數(shù)革蘭氏陰性菌的胞外成分。據(jù)推測(cè)，根瘤菌LPS可以保護(hù)細(xì)菌免受植物產(chǎn)生抗菌化合物的傷害。費(fèi)氏中華根瘤菌HH103的LPS化學(xué)結(jié)構(gòu)尚未確定。只有2個(gè)費(fèi)氏中華根瘤菌HH103的脂多糖基因的突變株已被構(gòu)建和研究。初步結(jié)果表明，lpsB或lpsE的突變株可以改變LPS的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果，同時(shí)降低與大豆共生固氮的能力。

3展望

費(fèi)氏菌株與慢生型根瘤菌都能夠與大豆共生固氮，而與它們關(guān)系密切的苜蓿根瘤菌和根瘤菌NGR234卻不能。因

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A Research Review onSinorhizobiumfrediiHH103

SHI Jie,GAO Yu,LIU Yu et al (Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences,Daqing,Heilongjiang 163319)

AbstractGlycinemax(soybean) plants can be nodulated by fast-growing rhizobial strains of the genusSinorhizobiumas well as by slow-growing strains clustered in the genus Bradyrhizobium In the past research fast-growing rhizobia strains with different soybean cultivar specificities were isolated from various geographical regions.Most of these strains were clustered into the speciesSinorhizobiumfredii.The largest plasmid (pSfrHH103e) harbours genes for the production of diverse surface polysaccharides,such as exopolysaccharides (EPS),lipopolysaccharides (LPS),and capsular polysaccharides (KPS).The second largest plasmid (pSfrHH103d) is a typical symbiotic plasmid (pSym),carrying nodulation and nitrogen fixation genes.The model strainS.frediiHH103 was chosen for genomic sequencing,which is currently in progress.Starting from classification basis and main types of nodule and rhizobial strains the research status of HH103 was introduced,and the research direction in the future was forecasted.

Key wordsSinorhizobiumfrediiHH103; Genome sequence; Soybean nodulation

收稿日期2015-12-14

作者簡(jiǎn)介石杰(1984- )，女，黑龍江大慶人，助理研究員，從事微生物與植物營養(yǎng)方面的研究。

中圖分類號(hào)S 182

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)02-007-02