馮芳芳 林如輝 陳文列 黃云梅 黃美雅 吳廣文 李西海 吳追樂 葉蕻芝 劉獻祥

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透骨消痛顆粒對兔骨關(guān)節(jié)炎模型作用的超微結(jié)構(gòu)研究

馮芳芳 林如輝 陳文列 黃云梅 黃美雅 吳廣文 李西海 吳追樂 葉蕻芝 劉獻祥

【摘要】目的 觀察透骨消痛顆粒干預兔骨關(guān)節(jié)炎模型軟骨和軟骨下骨的超微結(jié)構(gòu)變化情況，探討藥物對關(guān)節(jié)微觀結(jié)構(gòu)的作用機理。方法 18 只新西蘭大白兔分 3 組，模型組與藥物組按改良 Hulth 法建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型。建模后 1 周藥物組以 1 g·ml-1透骨消痛顆粒溶液 20 ml·d-1灌胃，正常組和模型組給予等量生理鹽水，持續(xù) 12 周。脛骨標本采用透射電鏡觀察軟骨和軟骨下骨超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 正常組軟骨細胞及核橢圓形，常染色質(zhì)為主，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器發(fā)達；骨細胞近梭形，核扁橢圓形，核質(zhì)比大，異染色質(zhì)散在；成骨細胞扁長形，見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器，核異染色質(zhì)散在。模型組軟骨細胞及核不規(guī)則，固縮變性，異染色質(zhì)分布不均，細胞器模糊；骨細胞核固縮或不規(guī)則，異染色質(zhì)聚集；成骨細胞呈橢圓形，核不規(guī)則，異染色質(zhì)斑塊狀多位于核膜下，細胞器較少、模糊。藥物組軟骨細胞多正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較發(fā)達；骨細胞核近橢圓形，異染色質(zhì)散在或部分聚集；成骨細胞呈扁長形，核近橢圓形，異染色質(zhì)散在，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見擴張。結(jié)論 透骨消痛顆粒能夠改善骨關(guān)節(jié)炎軟骨與軟骨下骨的超微結(jié)構(gòu)，主要作用表現(xiàn)于細胞核染色質(zhì)、參與合成細胞外基質(zhì)成分的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器的變化。

【關(guān)鍵詞】骨關(guān)節(jié)炎；顯微鏡檢查，電子，透射；藥物療法；軟骨細胞；骨細胞；透骨消痛顆粒

骨關(guān)節(jié)炎 ( osteoarthritis，OA) 是復雜的退行性關(guān)節(jié)疾病，關(guān)節(jié)軟骨完整性破壞、晚期軟骨下骨硬化、骨贅增生等是其主要特征[1]。骨關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，基于“腎主骨、肝主筋”的理論，已形成治痿、祛痹與痹痿同治的治療理念[2]。透骨消痛顆粒以中醫(yī)筋骨理論為指導，補腎柔肝作為根本法則，善于祛邪活血、健脾止痛，是有效防治骨關(guān)節(jié)炎的臨床驗方。前期藥理研究顯示該組方有消炎止痛、抑制炎性介質(zhì)、清除氧自由基和改善微循環(huán)等功效[3]，可減少骨關(guān)節(jié)炎軟骨蛋白多糖的丟失，明顯改善組織結(jié)構(gòu)，而達到減輕軟骨纖維化，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨硬化的作用[4-5]。本研究旨在通過對軟骨細胞、骨細胞等超微結(jié)構(gòu)觀察，進一步闡述透骨消痛顆粒對膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨和軟骨下骨微觀結(jié)構(gòu)的影響。

材料與方法

一、實驗動物

普通級 6 個月齡新西蘭大白兔 18 只，雌雄各半，體重 ( 2.1±0.1) kg，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號 SCXK ( 滬) 2012-0002。福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供醫(yī)學實驗動物環(huán)境設(shè)施，普通級 ( 合格證號：醫(yī)動學第 23-016 號)。實驗對動物的處置符合中華人民共和國科學技術(shù)部頒發(fā)的“關(guān)于善待實驗動物的指導性意見”。

二、動物分組與造模

適應性喂養(yǎng)后 1 周編號，18 只新西蘭大白兔采用抽簽法隨機分為 3 組：正常組對照、模型組和藥物組，每組 6 只。除正常組 6 只外，其余 12 只根據(jù)改良 Hulth 法[6]建立骨關(guān)節(jié)炎模型，造模方法：兔麻醉后，從左膝內(nèi)側(cè)入路，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，摘除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶。術(shù)后連續(xù) 3 天大腿肌肉注射 20 萬 U 青霉素，術(shù)后 1 周驅(qū)趕兔活動0.5 h·d-1，連續(xù) 12 周。

三、動物給藥

造模后 1 周，藥物組以 1 g·ml-1透骨消痛顆粒水溶液 20 ml·d-1灌胃，正常組和模型組以等量生理鹽水灌胃，持續(xù) 12 周。透骨消痛顆粒 ( 含巴戟天、杭白芍、川芎等多味中藥，生產(chǎn)批號 20100302)由福州屏山藥廠制作。

四、光鏡制樣觀察

兔麻醉，取膝關(guān)節(jié)脛骨平臺內(nèi)側(cè)軟骨及軟骨下骨，置于 4% 多聚甲醛固定，10% EDTA 脫鈣；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋；切片 5 μm，HE染色。光鏡下觀察軟骨和軟骨下骨形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

五、透射電鏡制樣觀察

切取脛骨平臺軟骨及軟骨下骨組織 1 mm× 1 mm×3 mm ( 長軸與軟骨面平行)，3% 戊二醛-1.5% 多聚甲醛前固定，5.5% EDTA -1.5% 戊二醛脫鈣－固定，1% 四氧化后固定 2 h，梯度乙醇、丙酮脫水，環(huán)氧樹脂 618 包埋劑包埋；半薄切片1 μm，美蘭－天青染色，光鏡輔助觀察并定位；超薄切片 90 nm，鈾－鉛染色；日立 H-7650 型透射電鏡觀察軟骨與軟骨下骨的超微結(jié)構(gòu)變化，SIS 公司2K×2K CCD 相機拍攝。

結(jié) 果

一、顯微結(jié)構(gòu)觀察

1. 正常對照組：軟骨表面平滑，細胞排列規(guī)律，四層結(jié)構(gòu)較明顯 ( 圖 1)。軟骨下骨骨小梁較均勻。

2. 模型組：軟骨面破損，局部增厚，裂隙可達中層至深層；軟骨細胞排列紊亂，四層結(jié)構(gòu)不清；軟骨基質(zhì)染色失染、不均 ( 圖 2)。骨小梁不均勻。

3. 藥物組：軟骨表面較為平整，損傷僅限淺層，深層細胞排列較規(guī)律，少凋亡；軟骨基質(zhì)染色較均勻 ( 圖 3)。軟骨下骨較正常。

二、超微結(jié)構(gòu)觀察

1. 正常對照組：軟骨細胞多呈圓形或橢圓形，細胞表面可見較多細而短的微絨毛樣突起；核圓形或橢圓形，居中，核內(nèi)常染色質(zhì)為主，異染色質(zhì)分布均勻；胞質(zhì)內(nèi)可見豐富粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體，糖原顆粒散在、多見，有的細胞微絲成束；軟骨組織基質(zhì)中有豐富纖細的膠原原纖維，排列較規(guī)律 ( 圖 4)。軟骨與軟骨下骨交界處，有低電子密度與高電子密度相鄰的骨基質(zhì)區(qū)域，其纖維排列方向不一致。低電子密度膠原纖維束中的膠原原纖維粗細相彷，與纖維束呈同一走向；高電子密度膠原纖維束中的膠原原纖維走向不規(guī)則，呈斜形、橫形交錯。骨細胞呈近梭形或扁橢圓形，較多充滿骨陷窩，細胞表面突起明顯，核質(zhì)比較大，胞質(zhì)相對較少，細胞器少見；核扁橢圓形，異染色質(zhì)豐富、散在；骨組織基質(zhì)中橫紋明顯且較粗的膠原原纖維，分布均勻 ( 圖 5)。成骨細胞扁長形，胞質(zhì)內(nèi)可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器；細胞核常染色質(zhì)為主，異染色質(zhì)散在 ( 圖 6)。

2. 模型組：軟骨細胞形狀多不規(guī)則，或呈多角形，細胞表面突起較少，多見變性、壞死細胞；核不規(guī)則、偏位，多固縮呈現(xiàn)電子密度增高，或異染色質(zhì)邊聚，呈凋亡細胞核；胞質(zhì)基質(zhì)深染，部分細胞器結(jié)構(gòu)破壞或不清晰，糖原聚集，脂滴可見；軟骨基質(zhì)中膠原原纖維稀疏，排列較不規(guī)律 ( 圖 7)。骨細胞大小不一，呈不規(guī)則形，突起少；細胞核固縮或不規(guī)則，多偏位，異染色質(zhì)聚集呈斑塊狀或于核膜下；骨基質(zhì)中膠原原纖維橫紋較模糊，分布排列不均勻 ( 圖 8)。成骨細胞呈橢圓形，突起少，核不規(guī)則，異染色質(zhì)斑塊狀多于核膜下；胞質(zhì)內(nèi)細胞器較少，結(jié)構(gòu)模糊 ( 圖 9)。

3. 藥物組：軟骨細胞圓形或橢圓形，細胞表面突起較多；核圓形或橢圓形，常染色質(zhì)為主，分布均勻；胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達、豐富，明顯擴張成池狀，內(nèi)見中等電子密度合成物，膜表面結(jié)合型核糖體明顯，糖原顆粒散在、多見，微絲豐富；同源軟骨細胞多見，未見明顯細胞變性 ( 圖 10)。骨細胞及其核呈橢圓形或梭形，核居中，核內(nèi)異染色質(zhì)散在或部分聚集；骨組織基質(zhì)中有豐富的橫紋，膠原原纖維較粗且分布較均勻 ( 圖 11)。成骨細胞呈扁長形，突起較少，核近橢圓形，常染色質(zhì)多見，異染色質(zhì)散在；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見，以核周為多，有些擴張成池狀 ( 圖 12)。

圖1　正常組軟骨與軟骨下骨的顯微結(jié)構(gòu) ( HE × 40) 　Fig.1 Normal cartilage and subchondral bone microstructure ( HE × 40)圖2　模型組軟骨與軟骨下骨的顯微結(jié)構(gòu) ( HE × 40) 　Fig.2 Model group of cartilage and subchondral bone microstructure ( HE × 40)圖3　藥物組軟骨與軟骨下骨的顯微結(jié)構(gòu) ( HE × 40) 　Fig.3 Drug group of cartilage and subchondral bone microstructure ( HE × 40)圖4　正常組軟骨細胞超微結(jié)構(gòu) ( TEM × 10000) 　Fig.4 Normal cartilage cell ultrastructure ( TEM × 10000)圖5　正常組骨細胞超微結(jié)構(gòu) ( TEM ×12000) 　Fig.5 Normal bone cell ultrastructure ( TEM × 12000)圖6　正常組成骨細胞超微結(jié)構(gòu) ( TEM × 10000) 　Fig.6 Normal osteoblasts ultrastructure ( TEM × 10000)圖7　模型組軟骨細胞超微結(jié)構(gòu) ( TEM × 10000) 　Fig.7 Model group of cartilage cell ultrastructure ( TEM × 10000)圖8　模型組骨細胞超微結(jié)構(gòu) ( TEM × 12000) 　Fig.8 Model group of bone cell ultrastructure ( TEM × 12000)圖9　模型組成骨細胞超微結(jié)構(gòu) ( TEM × 10000) 　Fig.9 Model group of osteoblasts ultrastructure ( TEM × 10000)

討 論

本研究是光鏡與電鏡技術(shù)相結(jié)合，在顯微結(jié)構(gòu)觀察的基礎(chǔ)上，再進行超微結(jié)構(gòu)觀察，其結(jié)果相吻合，可從細胞及其胞外基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)，闡釋組織顯微結(jié)構(gòu)的變化。本實驗結(jié)果從軟骨和軟骨下骨的微觀變化，進一步提供了透骨消痛方對骨關(guān)節(jié)炎療效的細胞形態(tài)學證據(jù)，闡釋了藥物作用的細胞與亞細胞形態(tài)學機理。

一、藥物對骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨超微結(jié)構(gòu)的影響

軟骨退變是骨關(guān)節(jié)炎的最基本病變，軟骨細胞是軟骨中唯一的細胞，疾病狀態(tài)下，軟骨細胞在炎癥狀態(tài)下出現(xiàn)功能性紊亂，最終導致軟骨結(jié)構(gòu)病理改變[7]。病變早期軟骨細胞可對外界刺激產(chǎn)生應激現(xiàn)象，本實驗中模型組軟骨細胞出現(xiàn)局部增殖現(xiàn)象，而使局部軟骨層增厚，但軟骨細胞排列紊亂。透射電鏡見軟骨細胞及核出現(xiàn)固縮、變性，甚至壞死，直接影響軟骨細胞的代謝和遺傳；軟骨表面微絨毛樣突起減少，細胞內(nèi)外物質(zhì)交換能力下降，營養(yǎng)代謝發(fā)生障礙；合成膠原蛋白、蛋白多糖等基質(zhì)成分的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器變化，將相應影響相關(guān)功能。藥物組軟骨形態(tài)完整，未見明顯裂隙、破損，軟骨細胞與模型組相比，分布較為規(guī)律，透射電鏡下軟骨細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)多正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，明顯擴張成池狀，表現(xiàn)出活躍的細胞功能，合成蛋白質(zhì)能力增強。同源軟骨細胞明顯增多，增殖能力增強，可促進軟骨的進一步修復。

II 型膠原是軟骨基質(zhì)中最主要膠原表型，參與關(guān)節(jié)軟骨組織生理重建和病理破壞過程[8]。骨關(guān)節(jié)炎過程中，II 型膠原降解，導致軟骨基質(zhì)成分改變，進一步介導軟骨細胞病變。軟骨基質(zhì)膠原原纖維排列方向紊亂的區(qū)域軟骨細胞退變程度重，細胞凋亡多見，說明軟骨細胞衰亡會影響基質(zhì)成分的正常維持；反之，軟骨細胞依賴軟骨基質(zhì)成分的完整，病變軟骨細胞由于膠原纖維網(wǎng)的破壞也會促使退變、死亡，軟骨的自我修復能力也將減弱，軟骨破壞[9]。以往的骨關(guān)節(jié)炎研究中發(fā)現(xiàn)部分基質(zhì)金屬蛋白酶 MMPs 使關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)特別是使 II 型膠原變性裂解，關(guān)節(jié)軟骨變腫脹，抗外力作用下降，最終導致軟骨破壞、軟骨細胞退行性改變，甚至死亡，用藥后 MMPs 含量明顯下降[10]，保護 II 型膠原，維持軟骨基質(zhì)穩(wěn)定。藥物組膠原原纖維與模型組相比，分布較為規(guī)律，提示 II 型膠原降解減輕，軟骨細胞微環(huán)境改善。本次實驗通過對軟骨的超微結(jié)構(gòu)觀察，說明透骨消痛顆?？蓽p輕軟骨基質(zhì)的降解，緩解骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變。

二、藥物對骨關(guān)節(jié)炎軟骨下骨超微結(jié)構(gòu)的影響

軟骨代謝紊亂、局部降解被認為是骨關(guān)節(jié)炎的始發(fā)因素，而軟骨下骨改變在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用[11]。軟骨下骨包括軟骨下骨板、骨小梁、血管和小梁間腔隙，對關(guān)節(jié)軟骨起機械性和代謝性的保護作用[12]，在骨關(guān)節(jié)炎早期就可見骨小梁稀疏等骨質(zhì)疏松的結(jié)構(gòu)變化。骨小梁結(jié)構(gòu)對骨強度至關(guān)重要[13]，是骨脆性的決定因素，還起支持造血組織的作用，與骨的生成有關(guān)；骨小梁內(nèi)部有骨細胞及其膠原和鈣鹽沉積；骨小梁表面被覆成骨細胞，成骨細胞主要負責骨基質(zhì)合成、分泌和礦化，控制骨重建的激活或終止[14]，維持機體正常骨量。

本研究模型組成骨細胞核發(fā)生明顯變化，異染色質(zhì)增多，細胞器數(shù)量減少，功能退化，細胞的新陳代謝和增殖分化能力明顯降低，通過物質(zhì)運輸通道促進軟骨細胞 MMPs 合成，加快軟骨細胞退變；而藥物組成骨細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張成池，蛋白質(zhì)合成能力增加，推測透骨消痛顆粒可通過改善成骨細胞功能形態(tài)，影響骨重塑平衡，而達到對軟骨下骨的保護，與前期研究結(jié)果一致[15]。

圖10　藥物組軟骨細胞超微結(jié)構(gòu) ( TEM × 10000) 　Fig.10 Drug group of cartilage cell ultrastructure ( TEM × 10000)圖11　藥物組骨細胞超微結(jié)構(gòu) ( TEM × 12000) 　Fig.11 Drug group of bone cell ultrastructure ( TEM × 12000)圖12　藥物組成骨細胞超微結(jié)構(gòu) ( TEM × 10000) 　Fig.12 Drug group of osteoblasts ultrastructure ( TEM × 10000)

骨細胞起源于成骨細胞，細胞的合成活動停止，胞質(zhì)減少。骨細胞的骨陷窩－小管系統(tǒng)提供微環(huán)境系統(tǒng)，骨間隙液可以營養(yǎng)骨組織。本實驗模型組骨細胞變形，特別是核固縮、偏位，細胞新陳代謝障礙，由骨細胞分泌的膠原蛋白等含量減少，影響整個微環(huán)境；基質(zhì)中膠原原纖維結(jié)構(gòu)紊亂，橫紋模糊，骨骼韌性降低，脆性增加，骨質(zhì)變得疏松，更易發(fā)生微骨折。藥物組骨細胞功能形態(tài)改善，繼續(xù)指揮、協(xié)調(diào)骨重建，改善骨質(zhì)；膠原原纖維變粗，排列規(guī)律，骨組織得到修復。

本實驗藥物組軟骨下骨超微結(jié)構(gòu)比模型組明顯改善，提示透骨消痛顆粒能使病理狀態(tài)下機體成骨細胞重新達到平衡，骨細胞微環(huán)境改善，從而進一步延緩骨關(guān)節(jié)炎向晚期進展。

參 考 文 獻

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( 本文編輯：李貴存)

. 作者須知 Instruction for authors .

A ultrastructural study of Touguxiaotong Granule on osteoarthritis rabbit model FENG Fang-fang, LIN Ru-hui, CHEN Wen-lie, HUANG Yun-mei, HUANG Mei-ya, WU Guang-wen, LI Xi-hai, WU Zhui-le, YE Hong-zhi, LIU Xianxiang. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian, 350122, PRC

【Abstract】Objective To explore the microcosmic mechanism of Touguxiaotong Granule ( TXG) on ultrastructure in cartilage by observing cartilage and subchondral bone of TXG-treated rabbit osteoarthritis model with transmission electron microscope ( TEM). Methods Eighteen New Zealand rabbits of 6-month old were randomly divided into 3 groups: the control group, the model group and the drug group. The knee osteoarthritis model was replicated using modified Hulth method. Rabbits in the drug group were applied 1 g · ml-1TXG solution by intragastric administration. While rabbits in the control group and model group were given the same amount of 0.9% physiological saline by intragastric administration. All rabbits had been given the dosage of 20 ml · d-1for 12 weeks. Obtained samples of tibia were observed by TEM. Results In the control group, the chondrocytes were characterized as subelliptic shape, abundant rough endoplasmic reticulum and mainly euchromatin in oval nucleus. Osteocytes appeared as fusiform shape and flat oval nucleus, with big karyoplasmicratio and scattered heterochromatin. Osteoblasts displayed prolate shape, rough endoplasmic reticulum and scattered heterochromatin. Compared with the control group, chondrocytes and nucleus in the model groups of osteoarthritis showed irregular shape, pyknosis and degeneration. The cellular organelles were fuzzy or unclear in the chondrocytes while the nucleus was accompanied by unevenly distributed heterochromatin. Irregular karyopyknosis and aggregated heterochromatin appeared in osteocytes. Osteoblasts appeared to be oval. The organelles were reduced and fuzzy and the patchy heterochromatin was under the nuclear membrane in irregular nucleus. Compared with the model group, chondrocytes in drug group were characterized as regular morphology with abundant rough endoplasmic reticulum. The nucleus of osteocytes showedbook=130,ebook=55subelliptic shape, scattered or partial aggregated heterochromatin. Osteoblasts showed elongated shape, expanded rough endoplasmic reticulum, and scattered heterochromatin in oval-like nucleus. Conclusions Touguxiaotong Granule can significantly improve the ultrastructure of the cartilage and subchondral bone in osteoarthritis. It plays an important role in the change of the nuclear chromatin and the rough endoplasmic reticulum which is involved in the synthesis of extracellular matrix components.

【Key words】Osteoarthritis; Microscopy, electron, transmission; Drug therapy; Chondrocytes; Osteocytes; Touguxiaotong granule

( 收稿日期：2015-05-13)

Corresponding author:CHEN Wen-lie, Email: chen.wl@163.com

通信作者：陳文列，Email: chen.wl@163.com

基金項目：福建省自然科學基金 ( 2014J01356)，陳可冀中西醫(yī)結(jié)合發(fā)展基金 ( CKJ2011004)
作者單位：350122 福州，福建中醫(yī)藥大學 ( 馮芳芳、陳文列)；350122 福州，福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合研究院 ( 林如輝、陳文列、黃美雅、吳廣文、葉蕻芝、劉獻祥)；350122 福州，國家中醫(yī)藥三級科研實驗室－中藥藥理 ( 細胞結(jié)構(gòu)與功能) 實驗室 ( 陳文列、黃云梅、吳追樂)；350108 福州，福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點實驗室( 李西海、劉獻祥)

DOI:10.3969/j.issn.2095-252X.2016.02.012

中圖分類號：R684.3