王龍，楊益新，高子平，尹潔，劉洋，張長(zhǎng)波，湯繼華，劉仲齊,*

1. 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，鄭州 450002 3. 湖南省湘陰縣農(nóng)業(yè)局，湘陰 414600

水稻幼苗鎘積累特征和離體葉片耐鎘性的基因型差異

王龍1,2，楊益新3，高子平1，尹潔1，劉洋1，張長(zhǎng)波1，湯繼華2,#，劉仲齊1,2,*

1. 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，鄭州 450002 3. 湖南省湘陰縣農(nóng)業(yè)局，湘陰 414600

水稻根系對(duì)鎘(Cd)的富集能力和向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)效率直接決定著水稻地上部的Cd積累量，是影響稻米中鎘含量的關(guān)鍵因素。提高水稻根系對(duì)Cd的阻控能力有助于降低南方稻區(qū)大米鎘含量超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。以水稻核心種質(zhì)資源中的高Cd積累品種‘齊頭白谷’和低Cd積累品種‘27760’的幼苗和離體葉片為材料，對(duì)其Cd吸收轉(zhuǎn)運(yùn)特性和耐鎘能力進(jìn)行了比較研究。結(jié)果表明，根系細(xì)胞壁和原生質(zhì)體的Cd吸收動(dòng)力學(xué)特征都符合米氏方程，‘齊頭白谷’的Cd最大吸收速率Fmax顯著大于‘27760’，Km值無顯著差異。當(dāng)根際環(huán)境中的Cd濃度高于0.89 μmol·L-1時(shí)，‘齊頭白谷’的細(xì)胞壁和原生質(zhì)體的Cd積累速率顯著高于‘27760’。地上部細(xì)胞壁和原生質(zhì)體的Cd吸收速率與根系可溶性組分中的Cd濃度呈顯著的線性正相關(guān)。當(dāng)根系可溶性組分中的Cd濃度相近時(shí)，‘齊頭白谷’地上部細(xì)胞壁和原生質(zhì)體的Cd積累速率顯著高于‘27760’。在0.89～8.9 μmol·L-1的Cd溶液中，‘齊頭白谷’離體葉片的失綠速度明顯低于‘27760’?！R頭白谷’具有耐Cd能力強(qiáng)、Cd積累速率快和轉(zhuǎn)運(yùn)效率高的特點(diǎn)。水稻離體葉片的耐Cd能力和幼苗根系的Cd積累能力以及幼苗的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)能力高度相關(guān)，它們都可作為快速鑒定低Cd積累品種的生理指標(biāo)。

鎘(Cd)；水稻；積累特性；亞細(xì)胞分布；離體葉片；葉綠素；基因型

近年來，隨著工業(yè)化、城鎮(zhèn)化進(jìn)程的推進(jìn)，礦產(chǎn)資源的過度開發(fā)，工業(yè)三廢的不合理排放，化肥和農(nóng)藥的過量施用及不合標(biāo)準(zhǔn)的污水灌溉等引發(fā)的農(nóng)田重金屬污染現(xiàn)象日趨嚴(yán)峻[1-2]。農(nóng)田一旦遭受重金屬污染，不僅會(huì)使土壤質(zhì)量退化，而且會(huì)影響農(nóng)作物的生長(zhǎng)和發(fā)育，進(jìn)而影響農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)，最終通過食物鏈威脅人類健康和生命安全[3-5]。在所有重金屬污染物中，鎘以其高移動(dòng)性、高毒性及污染面積最大而被列為“五毒之首”[6-7]。因此，鎘污染已成為當(dāng)今危害最大的環(huán)境問題之一，對(duì)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和土地資源可持續(xù)利用帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

水稻是我國第一大糧食作物也是耐鎘性較強(qiáng)的植物之一，其根系對(duì)酸性土壤中低濃度的Cd具有很強(qiáng)的富集效率，并向莖、葉和籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)，各器官的積累量在品種間有顯著差異[8-10]。Cd在植物各器官中的分配比例由高到低順序?yàn)椋焊?莖葉>穗軸>籽粒[11-12]。一般來說，植物對(duì)Cd的耐性和解毒機(jī)制可通過2條基本途徑實(shí)現(xiàn)，一是外部排斥機(jī)制，即避免過量Cd被吸收進(jìn)入植物細(xì)胞，或者阻礙Cd在植物體內(nèi)的運(yùn)輸；另一途徑是內(nèi)部耐受機(jī)制，即Cd在植物體內(nèi)以不具生物活性的解毒形式存在，如結(jié)合到細(xì)胞壁上、主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入液泡或與某些有機(jī)酸和蛋白質(zhì)結(jié)合等[13-14]。

細(xì)胞壁作為植物細(xì)胞的第一道保護(hù)屏障，在維持細(xì)胞形態(tài)、提供植物直立生長(zhǎng)的機(jī)械支撐、控制細(xì)胞生長(zhǎng)、提高植物耐Cd能力等方面發(fā)揮著重要作用。一方面，細(xì)胞壁中的纖維素、果膠、半纖維素和糖蛋白等相互交錯(cuò)形成網(wǎng)孔大小不一的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，能吸收和固定Cd；另一方面，細(xì)胞壁中這些物質(zhì)含有大量羥基、羧基、醛基、胺基或磷酸基等配位基團(tuán)，能與Cd結(jié)合并在細(xì)胞壁上形成沉淀[15-18]。根際環(huán)境中的Cd一部分沉積在細(xì)胞壁中，另一部分跨膜進(jìn)入原生質(zhì)體。Cd與細(xì)胞壁緊密結(jié)合而導(dǎo)致其移動(dòng)性降低，從而阻止過多的Cd進(jìn)入原生質(zhì)體，以減輕其毒害。當(dāng)Cd穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后，一部分與谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、植物螯合態(tài)(PCs)和非蛋白巰基(NPT)結(jié)合，降低其在細(xì)胞質(zhì)中的可移動(dòng)性[19-22]；一部分通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貯存在液泡中，減少Cd對(duì)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)及細(xì)胞器中各種生理代謝活動(dòng)的傷害[23-25]。

水稻根系對(duì)Cd的富集能力和向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)效率直接決定著水稻地上部的Cd積累量，是影響稻米中的Cd含量的關(guān)鍵因素。提高水稻根系對(duì)Cd的阻控能力有助于降低南方稻區(qū)大米鎘含量超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本文從研究水稻幼苗根系和地上部的Cd吸收動(dòng)力學(xué)特征入手，分析其亞細(xì)胞分布特征在基因型間的差異，以期為水稻低鎘積累品種的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

將108份水稻核心種質(zhì)種植在湖南某地Cd污染農(nóng)田(耕層土壤Cd含量0.811 mg·kg-1)，從中篩選出1份稻米Cd含量高(1.625 mg·kg-1)的云南地方粳稻品種‘齊頭白谷’和1份稻米Cd含量低(0.185 mg·kg-1)的江蘇地方粳稻品種‘27760’，兩品種的生育期為(150±10) d。

1.2 培養(yǎng)與處理方法

挑選大小一致、顆粒飽滿的水稻種子，用體積分?jǐn)?shù)為5%的次氯酸鈉溶液消毒15 min，先用自來水沖洗4～6次，然后用去離子水漂洗3次后均勻擺在鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，之后放于28 ℃條件下的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗催芽24 h，將已露白的種子播種于已消毒的含蛭石的育苗盤中，并在人工氣候室中進(jìn)行培養(yǎng)。在水稻出苗后，用1/4濃度的Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行澆灌培養(yǎng)，長(zhǎng)至三葉一心期，挑選大小均勻一致的水稻幼苗移入裝有去離子水的塑料盆中饑餓1 d(24 h)，之后將幼苗用海綿固定移栽到裝有8 L的塑料盆(長(zhǎng)34 cm、寬25 cm、高12 cm)中，進(jìn)行不同濃度的Cd脅迫處理，每個(gè)處理50株。各處理中加入一定量的CdCl2·2.5H2O溶液，使Cd濃度分別為0(對(duì)照)、0.27、0.53、0.89、2.67和4.45 μmol·L-1。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)期間，每2天更換一次處理液，并用0.1 mol·L-1HCl和0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.5，每次換處理液時(shí)隨機(jī)移動(dòng)塑料盆的位置，以保證外界條件的一致性。所有實(shí)驗(yàn)均在模擬自然狀態(tài)的人工氣候培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，人工氣候室條件：白天溫度28 ℃，濕度80%，光照16 h，光照強(qiáng)度為400 μmol·m-1·s-1；夜間溫度20 ℃，濕度70%，8 h黑暗。

1.3 樣品采集與處理

培養(yǎng)5 d后收樣。將根系浸泡于20 mmol·L-1的Na2-EDTA溶液中15 min，去掉根系表面殘留的Cd，然后用超純水清洗整個(gè)植株，用吸水紙吸干表面水分，將植株根系和地上部分離，準(zhǔn)確稱取1.0 g根系和莖葉鮮樣直接用于亞細(xì)胞分布的測(cè)定，其余部分裝入信封中，置于烘箱中105 ℃殺青20 min，再于75 ℃下烘至恒重，用萬分之一分析天平稱干重，記錄地上部分和根系的重量，然后測(cè)定Cd含量。

1.4 鎘的亞細(xì)胞分離

參照Weigle等[26]和Wang等[27]的方法，并略有改進(jìn)，具體方法如下：將1.0 g鮮樣置于50 mL離心管中，加入15 mL預(yù)冷的提取緩沖液勻漿，勻漿結(jié)束后，用緩沖液沖洗轉(zhuǎn)頭2～3次。提取緩沖液組成為：50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.5)，250 mmol·L-1蔗糖和1 mmol·L-1的二硫赤鮮醇。采用差速分級(jí)離心技術(shù)分離出各器官不同細(xì)胞組分。將勻漿液在3 000 r·min-1下離心15 min，沉淀即為細(xì)胞壁組分(F1)，上清液在15 000 r·min-1下離心30 min，沉淀為細(xì)胞器組分(F2)，上清液為胞液組分(F3)。并測(cè)定Cd全量計(jì)算回收率[28]，回收率在90%～110%。實(shí)驗(yàn)均在4 ℃下進(jìn)行操作，每步離心前用緩沖液補(bǔ)充至同一體積。將F1、F2、F3分別置于烘箱中60 ℃烘干，用于Cd含量的測(cè)定。

1.5 鎘含量的測(cè)定

參照溫娜等[29]的方法，將0.25 g樣品與7 mL MOS級(jí)濃硝酸搖勻后過夜，用ED 54- iTouch電熱消解儀消煮，消煮溫度控制在110 ℃，2.5 h后加入1 mL H2O2，繼續(xù)消煮1.5 h，消煮至溶液顏色變?yōu)闊o色冒白煙，最后趕酸至體積為1 mL左右，消煮完成后，用去離子水定容到25 mL，用原子吸收光譜儀-石墨爐法(AAS ZEEnit 700, Analytikjena, 德國)測(cè)定樣品Cd含量，以國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.6 光合色素含量的測(cè)定

參照張穎等[30]的方法并略有改進(jìn)，選取正常生長(zhǎng)的抽穗期的水稻葉片，將葉片剪成4 cm大小的片段，先用擴(kuò)展劑浸泡1 min，去離子水沖洗干凈，然后放入已添加20 mL處理液的培養(yǎng)皿中，處理液的Cd濃度分別為0(CK)、0.89、4.45和8.89 μmol·L-1，以CdCl2·2.5H2O的形式添加，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，放置于上述人工氣候室中，5 d后拍照并取樣，測(cè)定水稻葉片的光合色素含量。

參照高俊鳳[31]的方法，將處理過的葉片迅速擦拭干凈，準(zhǔn)確稱取0.1 g放入研缽中，用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇研磨，將研磨液用濾紙過濾后，用95%的乙醇定容至25 mL。以95%的乙醇為空白，用紫外分光光度計(jì)(UV-2010型，美國)分別測(cè)定色素提取液在波長(zhǎng)663、645、470 nm處的光密度OD值，計(jì)算各光合色素含量[32]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

水稻對(duì)Cd吸收特性用Michaelis-Menten酶動(dòng)力學(xué)方程F=Fmax×S/(Km+S)來描述[33]，通過雙倒數(shù)作圖可計(jì)算出Fmax和Km值，式中，F(xiàn)為水稻對(duì)Cd的吸收速率，S為外液離子濃度，F(xiàn)max為離子最大吸收速率，F(xiàn)max值越大，說明根系吸收系統(tǒng)對(duì)該離子的吸收潛能越大；Km為米氏常數(shù)，Km值越小，說明根系吸收系統(tǒng)對(duì)該離子的親和力越大。

所有數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Duncan multiple-range test多重比較檢驗(yàn)差異的顯著性(P≤0.05)。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 水稻幼苗Cd吸收特性的基因型差異

水稻幼苗根系和地上部Cd吸收速率都隨著環(huán)境Cd濃度的增大而不斷增大并逐漸趨于飽和，當(dāng)環(huán)境Cd濃度達(dá)到2 μmol·L-1時(shí)，根系和地上部對(duì)Cd的吸收速率不再隨Cd濃度的增加而明顯增加(圖1)。水稻幼苗吸收的Cd絕大部分積累在根部，根系Cd吸收速率變化在5～59 nmol·g-1·h-1范圍內(nèi)，約是地上部Cd吸收速率的10～20倍，且品種‘齊頭白谷’的Cd吸收速率要遠(yuǎn)大于品種‘27760’，說明根系和地上部對(duì)Cd的吸收都存在阻控機(jī)制。

利用Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)方程能夠很好地?cái)M合水稻幼苗Cd吸收動(dòng)力學(xué)曲線(R2>0.99)，從圖1可以看出，從環(huán)境到根系再到地上部，動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km在兩品種間差異不顯著，但品種‘齊頭白谷’的Fmax值顯著高于品種‘27760’。

2.2 水稻幼苗細(xì)胞壁和原生質(zhì)體Cd吸收速率的基因型差異

水稻幼苗根系細(xì)胞壁和原生質(zhì)體Cd吸收動(dòng)力學(xué)特征都符合米氏方程(R2>0.94)，品種‘齊頭白谷’的Fmax顯著大于品種‘27760’，而Km在兩品種間差異不顯著。當(dāng)Cd濃度低于1 μmol·L-1時(shí)，隨著外界Cd濃度的增大，根系細(xì)胞壁和原生質(zhì)體的Cd吸收速率急劇增大，品種間無顯著差異；當(dāng)Cd濃度高于1 μmol·L-1時(shí)，隨著外界Cd濃度的增大，根系細(xì)胞壁和原生質(zhì)體的Cd吸收速率緩慢增大并逐漸趨于飽和，在此階段，品種‘齊頭白谷’的Fmax值和吸收速率顯著高于品種‘27760’(圖2A和B)。

根系細(xì)胞可溶性組分中的Cd，一部分被轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡和其他細(xì)胞器中，另一部分繼續(xù)向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)。水稻幼苗地上部細(xì)胞壁和原生質(zhì)體的Cd吸收速率隨著根系可溶性組分中Cd濃度的增加而線性增加(R2>0.95)，符合線性方程y=a+bx。環(huán)境中的Cd通過影響根系可溶性組分中的Cd濃度間接地影響地上部的Cd積累量。在外界濃度相同時(shí)，進(jìn)入品種‘齊頭白谷’根系可溶態(tài)的Cd含量高于品種‘27760’，同時(shí)品種‘齊頭白谷’地上部細(xì)胞壁的Cd吸收速率也高于品種‘27760’(圖2C)。品種‘齊頭白谷’地上部原生質(zhì)體的Cd吸收速率和b值均明顯高于品種‘27760’(圖2D)，這說明品種‘齊頭白谷’的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)效率顯著高于品種‘27760’。

2.3 Cd在水稻幼苗根系和地上部亞細(xì)胞組分中的分布

水稻根系中的Cd主要分布在細(xì)胞壁組分中，約占總量的55%，可溶性組分中的Cd約占35%，細(xì)胞器中的Cd只占10%左右(圖3A)。地上部分的Cd主要分布于細(xì)胞壁組分中，約占總量的60%，其次為可溶組分，約占35%，細(xì)胞器組分中僅占5%左右(圖3B)。隨著外界Cd濃度的增加，根系和地上部分的Cd在細(xì)胞壁中所占的比例逐漸降低，可溶部分所占的比例卻逐漸升高，這種變化趨勢(shì)在2個(gè)水稻品種間無顯著差異，但Cd在品種‘27760’的細(xì)胞器中所占的比例明顯低于品種‘齊頭白谷’。這些結(jié)果表明，品種‘27760’能將大部分的Cd分配到細(xì)胞壁中，致使細(xì)胞器中Cd濃度維持在較低水平，從而減輕其毒害。

圖1 水稻幼苗根系(A)和地上部(B)Cd吸收動(dòng)力學(xué)特征Fig. 1 The kinetic characteristics of Cd absorption in roots (A) and shoots (B) of rice seedlings

圖2 Cd脅迫對(duì)細(xì)胞壁和原生質(zhì)體Cd吸收速率的影響注：圖A和B分別為水稻根系細(xì)胞壁(A)和原生質(zhì)體(B)對(duì)環(huán)境中Cd的吸收速率；圖C和D分別為地上部細(xì)胞壁(C)和原生質(zhì)體(D)對(duì)根系可溶態(tài)Cd的吸收速率。Fig. 2 Effects of Cd on Cd absorption rates into cell walls and protoplastsNote: A and B show the uptake rates of Cd in rice root cell wall (A) and protoplasts (B) respectively; C and D show the uptake rates of Cd (Cd in soluble fractions of roots) in rice shoot cell wall (C) and protoplasts (D) respectively.

圖3 Cd在水稻幼苗根系(A)和地上部(B)的亞細(xì)胞分配比例注：F1、F2、F3分別代表細(xì)胞壁組分、細(xì)胞器組分和胞液組分；不同的小寫字母表示不同處理的差異顯著性(P<0.05)；圖例為Cd2+處理濃度(μmol·L-1)。Fig. 3 Percentages of subcellular distribution of Cd in roots (A) and shoots (B) of rice seedlingsNote: F1, F2 and F3 represents cell wall components, organelle components and cell sap components, respectively. Different lowercase letters indicate the significant difference among different treatments (P<0.05). The cutline represents the concentration of Cd2+ (μmol·L-1).

2.4 Cd脅迫強(qiáng)度對(duì)水稻離體葉片光合色素的影響

Cd脅迫下植物的光合系統(tǒng)I和II遭到破壞，從而使葉片發(fā)黃。由圖4可知，隨著環(huán)境中Cd濃度的增加，水稻離體葉片中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的含量均逐漸減少，但失綠速度在兩品種間存在明顯差異。當(dāng)Cd濃度為0.89 μmol·L-1時(shí)，兩品種的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量差異不大，與對(duì)照相比，品種‘齊頭白谷’葉綠素和類胡蘿卜素的相對(duì)損失率較低，分別為3.85%和1.16%，而品種‘27760’的相對(duì)損失率較高，分別為8.77%和10.55%。當(dāng)Cd濃度提高到8.89 μmol·L-1時(shí)，品種‘齊頭白谷’葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量顯著高于品種‘27760’；和對(duì)照相比，品種‘齊頭白谷’的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量分別下降了27.49%、33.71%、21.77%、16.16%，而品種‘27760’的含量分別下降了51.88%、64.02%、42.31%、38.88%。說明在Cd脅迫條件下，品種‘齊頭白谷’失綠速度慢，耐Cd能力明顯強(qiáng)于品種‘27760’。

圖4 Cd脅迫下水稻離體葉片顏色(A)及葉綠素a (B)、葉綠素b (C)、總?cè)~綠素 (D)、類胡蘿卜素 (E) 含量的變化Fig. 4 Changes of leaf color (A), as well as chlorophyII a (B), chlorophyII b (C), total chlorophyII (D),and carotenoids (E) contents in detached leaves under Cd stress

3 討論(Discussion)

Epstein和Hagen[34]首次將酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程應(yīng)用于植物對(duì)離子吸收的動(dòng)力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)大麥根系對(duì)K+的吸收存在2種不同的吸收機(jī)制，即低K+濃度下的高親和吸收系統(tǒng)和高K+濃度下的低親和吸收系統(tǒng)。之后的一系列相關(guān)研究分別為這2種機(jī)制提供了證據(jù)，并發(fā)現(xiàn)高親和吸收系統(tǒng)中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起了較為重要的作用，而在低親和吸收系統(tǒng)中離子通道蛋白有重要的作用[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同Cd積累特性的水稻幼苗根系的Cd吸收動(dòng)力學(xué)特征都符合米氏方程(圖1)，即隨著外界Cd濃度的增大，水稻對(duì)Cd的吸收速率不斷增大，并逐漸趨于飽和，當(dāng)溶液中Cd達(dá)到一定濃度時(shí)，水稻對(duì)Cd的吸收速率不再隨Cd濃度的增加而明顯增加，這與Sansoulet[37]和吳曉麗[38]的結(jié)果相似。說明根系存在阻控機(jī)制，只有當(dāng)根系生長(zhǎng)受到毒害，阻控機(jī)制才被激活，限制Cd的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。這可能是因?yàn)樗靖祵?duì)低濃度的Cd主要通過共質(zhì)體途徑進(jìn)行主動(dòng)吸收[39]，需要有轉(zhuǎn)運(yùn)體或者跨膜蛋白參與；當(dāng)根系周圍Cd濃度超過一定的臨界值后，被動(dòng)運(yùn)輸對(duì)根系內(nèi)Cd的積累發(fā)揮了主導(dǎo)作用。

細(xì)胞壁是接觸和響應(yīng)環(huán)境因子的第一道屏障，也是結(jié)合金屬離子的主要部位[18]，因此，細(xì)胞壁在植物耐Cd脅迫中起到不可忽視的作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，2個(gè)水稻品種根系細(xì)胞壁和原生質(zhì)體對(duì)Cd吸收動(dòng)力學(xué)特征都符合米氏方程(圖2A和B)，說明細(xì)胞壁和原生質(zhì)體限制了根系對(duì)Cd的吸收。這可能是由于根系細(xì)胞壁具有大量的配位基團(tuán)以及能吸附Cd的非可溶性物質(zhì)，使細(xì)胞壁對(duì)Cd的吸收速率大大降低；透過細(xì)胞壁的Cd會(huì)與細(xì)胞膜上大量特異性不強(qiáng)的二價(jià)陽離子(特別是Ca2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+)轉(zhuǎn)運(yùn)子競(jìng)爭(zhēng)，限制了Cd進(jìn)入細(xì)胞的速度[40-41]。根系從環(huán)境中吸收的Cd一部分以這種方式沉積在細(xì)胞壁中，另一部分跨膜進(jìn)入原生質(zhì)體。進(jìn)入原生質(zhì)體的Cd一部分與谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、植物螯合態(tài)(PCs)和非蛋白巰基(NPT)結(jié)合，一部分通過跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白貯存在液泡中，降低其在細(xì)胞質(zhì)中的可移動(dòng)性，從而減少Cd對(duì)細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)及細(xì)胞器中各種生理代謝活動(dòng)的傷害。

離子吸收動(dòng)力學(xué)參數(shù)可定量地描述作物根系吸收離子的效率以及建立數(shù)學(xué)模型來描述離子遷移，并為預(yù)測(cè)植物對(duì)離子的吸收提供依據(jù)[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，品種‘齊頭白谷’的最大吸收速率Fmax顯著高于品種‘27760’，而Km值在兩品種間無顯著差異。說明品種‘齊頭白谷’對(duì)Cd的耐性強(qiáng)于品種‘27760’。對(duì)于同一品種來說，根系Cd吸收速率約是地上部Cd吸收速率的10～20倍(圖1)，說明根系的“過濾”機(jī)制有效抑制了Cd向地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)，致使地上部的Cd積累速率大幅度下降。

環(huán)境中的Cd通過質(zhì)外體和共質(zhì)體途徑進(jìn)入根系組織后，受內(nèi)皮層凱氏帶和木栓層的阻礙，最后都要經(jīng)過共質(zhì)體系統(tǒng)的識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)，才能進(jìn)入根系中柱的木質(zhì)部[43]，然后繼續(xù)向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)。本研究結(jié)果表明，地上部細(xì)胞壁和原生質(zhì)體的Cd吸收速率隨著根系可溶態(tài)Cd吸收速率的增加而線性增加(圖2C和D)，與環(huán)境中的Cd濃度無相關(guān)性，說明根系可溶態(tài)的Cd是地上部Cd吸收的直接來源。地上部的Cd積累量一方面取決于根系細(xì)胞中可以遷移的Cd濃度，另一方面取決于根系維管束組織向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)的Cd效率[36]。從圖2C和D可以看出，在外界濃度相同時(shí)，進(jìn)入品種‘齊頭白谷’根系可溶態(tài)的Cd含量高于品種‘27760’，同時(shí)品種‘齊頭白谷’地上部細(xì)胞壁的Cd吸收速率高于品種‘27760’，說明品種‘齊頭白谷’的轉(zhuǎn)運(yùn)效率高于品種‘27760’。分子生物學(xué)研究結(jié)果表明，許多金屬離子通道基因和調(diào)控基因影響著不同水稻品種對(duì)Cd2+的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[44-46]，品種‘齊頭白谷’和‘27760’ Cd轉(zhuǎn)運(yùn)效率的差異可能與它們擁有不同的離子通道基因有關(guān)。

根系和地上部吸收的Cd大部分都積累在細(xì)胞壁上，細(xì)胞壁所占的比例隨環(huán)境Cd濃度的增大而逐漸減小，而原生質(zhì)體所占的比例卻逐漸增大，這種變化趨勢(shì)在2個(gè)水稻品種間無顯著差異(圖3)，該分布趨勢(shì)與于輝等[47]，王芳等[48]的結(jié)果一致。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是當(dāng)環(huán)境Cd濃度較低時(shí)，根系吸收的Cd優(yōu)先結(jié)合在細(xì)胞壁上，隨著環(huán)境Cd濃度的增大，細(xì)胞壁的結(jié)合量逐漸達(dá)到飽和，大量的Cd進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，導(dǎo)致原生質(zhì)體的比例逐漸升高。細(xì)胞器是植物細(xì)胞生命活動(dòng)的主要場(chǎng)所，Cd在該部位積累量越低，細(xì)胞正常代謝受到Cd的破壞就越少。本研究還發(fā)現(xiàn)，水稻細(xì)胞器中的Cd所占的比例在5%～10%，與根系相比，地上部細(xì)胞器組分所占的比例更低；與品種‘齊頭白谷’相比，Cd在品種‘27760’的細(xì)胞器中所占的比例也更低。說明品種‘27760’能將大部分的Cd分布在細(xì)胞壁和胞液中，致使細(xì)胞器中Cd濃度維持在較低水平，從而減輕其毒害。Sela等[49]通過X-射線微區(qū)分也證實(shí)大部分Cd積累于細(xì)胞壁中，還有研究表明，OsHMA3、AtCAX2、AtCAX4、NRT3和OsNRAMP5都能夠?qū)d轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡[50]。

在逆境環(huán)境中植物的離體葉片受迫害程度在一定程度上能夠反映植物的耐性能力，前人在楊樹、棉花等的離體葉片研究中已有報(bào)道[30,51]。本研究結(jié)果表明，隨著環(huán)境Cd濃度的增加，水稻幼苗離體葉片中光合色素的含量均逐漸減少(圖4)，說明Cd脅迫加速了光合色素的分解。與對(duì)照相比，品種‘27760’的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素的相對(duì)損失率較高，而品種‘齊頭白谷’具有更好的保綠作用，說明品種‘齊頭白谷’的耐Cd性更強(qiáng)，可以利用離體葉片失綠進(jìn)程快速鑒別耐Cd性水稻品種。因此，水稻離體葉片的耐Cd能力和幼苗根系的Cd積累能力以及幼苗的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)能力高度相關(guān)，可作為快速鑒定低鎘積累品種的生理指標(biāo)。

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Genotypic Difference of Cadmium Accumulation Characteristics and Cadmium Tolerance in Detached Leaves of Rice (OryzasativaL.) Seedlings

Wang Long1,2, Yang Yixin3, Gao Ziping1, Yin Jie1, Liu Yang1, Zhang Changbo1, Tang Jihua2, #, Liu Zhongqi1,2,*

1. Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture, Tianjin 300191, China 2. College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China 3. Xiangyin Bureau of Agriculture, Xiangyin 414600, China

Received 11 April 2016 accepted 1 August 2016

The uptake capability of cadmium (Cd) in roots and Cd transport efficiency from roots to shoots are the key factors affecting Cd accumulation in rice shoots. Increasing the inhibition of Cd uptake by rice roots is in advantage of reducing the risk to people health posed by high Cd content in rice grains in southern China. Here, seedlings from the core germplasms with high-Cd-accumulation, i.e., ‘Qitoubaigu’, and low-Cd-accumulation, i.e., ‘27760’, as well as their detached leaves were used to study the characteristics of Cd uptake and tolerance to Cd toxicity. Experimental results indicated that the Cdabsorption kinetic characteristics of root cell wall and protoplast were well described with Michaelis-Menten equations. The maximum Cd absorption rate Fmaxof ‘Qitoubaigu’ was significantly greater than that of ‘27760’, while Kmvalues were not significantly different between two rice varieties. The Cd accumulation rates in cell wall and protoplast of ‘Qitoubaigu’ were significantly higher than that of ‘27760’ when the concentration of Cd in rhizosphere environment was over 0.89 μmol·L-1. The Cd absorption rates in cell walls and protoplasts of aboveground parts were linearly increased with the Cdconcentrations in soluble fractions of root cells. ‘Qitoubaigu’ showed significantly higher Cd accumulation rates in cell walls and protoplasts of aboveground parts than ‘27760’ when their Cdconcentrations in soluble fractions of root cells were same. The detached leaves of ‘Qitoubaigu’ displayed lower chlorophyll decreasing rate than that of ‘27760’ when the detached leaves were maintained in Cd concentrations varied from 0.89 μmol·L-1to 8.9 μmol·L-1. ‘Qitoubaigu’ had strong tolerance to Cd, fast Cd accumulation rate and high transport efficiency. The Cd tolerance of rice detached leaves was closely associated with the Cd accumulation in seedlings roots and Cd transport efficiency from roots to shoots. These physiological traits can be used for fast identification of low-Cd-accumulation variety.

cadmium (Cd); rice; accumulation characteristics; subcellular distribution; detached leaves; chlorophy; genotypic difference

2016年中國農(nóng)科院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(2016-cxgc-lzq)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201403015)

王龍(1988-)，男，河南漯河人，碩士研究生，研究方向?yàn)樽魑镉N原理與方法，E-mail: hnndwanglong@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: liuzhongqi508@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160411002

2016-04-11 錄用日期：2016-08-01

1673-5897(2016)6-187-10

X171.5

A

劉仲齊(1964-)，男，博士，研究員，主要研究方向?yàn)橹参餇I養(yǎng)與分子生物學(xué)。近年來在國內(nèi)外核心刊物上發(fā)表論文80多篇。

湯繼華(1969-)，男，博士，教授，主要研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。近年來在國內(nèi)外核心期刊上發(fā)表論文70多篇。

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: Tangjihua1@163.com

王龍, 楊益新, 高子平, 等. 水稻幼苗鎘積累特征和離體葉片耐鎘性的基因型差異[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2016, 11(6): 187-196

Wang L, Yang Y X, Gao Z P, et al. Genotypic difference of cadmium accumulation characteristics and cadmium tolerance in detached leaves of rice (Oryza sativa L.) seedlings [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 187-196 (in Chinese)