張瑞剛，儀慧蘭

山西大學生命科學學院，太原030006

活性氧和鈣信號參與鉛對酵母細胞的毒性作用

張瑞剛，儀慧蘭*

山西大學生命科學學院，太原030006

以模式生物酵母菌為材料，研究鉛對細胞的毒性效應，探討胞內活性氧(ROS)和Ca2+在鉛誘導細胞死亡中的作用。結果顯示，濃度為5 ～ 100 mg·L-1的硝酸鉛可降低酵母細胞活性，誘導酵母細胞死亡，隨著鉛濃度的提高和作用時間的延長，細胞死亡率增高。在鉛處理組酵母細胞中，ROS和Ca2+水平顯著升高，線粒體膜電位明顯下降；用1 mmol·L-1的外源抗壞血酸(AsA)能降低鉛引發(fā)的酵母細胞死亡，0.5 mmol·L-1的鈣離子螯合劑乙二醇雙四乙酸(EGTA)或0.1 mmol·L-1的質膜Ca2+通道特異性抑制劑氯化鑭(LaCl3)亦可明顯抑制鉛引起的酵母細胞死亡。研究結果表明，鉛誘發(fā)的酵母細胞死亡與處理組胞內ROS和Ca2+升高有關，高濃度的Ca2+可能通過誘導線粒體膜通透性轉變孔道開放，或者高水平ROS可能損傷線粒體膜，致線粒體膜電位下降，繼而激活相關下游信號導致細胞死亡。

鉛；酵母；細胞毒性；ROS；Ca2+

隨著工業(yè)和交通業(yè)的發(fā)展，含鉛廢氣、廢水和廢渣的排放量逐年增多，導致大氣、水體和土壤中的鉛含量不同程度超標。環(huán)境中高濃度的鉛對人類、動物和植物均具有毒性作用。長期的鉛暴露可引發(fā)人體神經系統、造血系統、消化系統以及生殖系統等的損傷，且鉛蓄積還可致癌[1]。研究發(fā)現，鉛可以與人體內蛋白分子的羧基結合，影響細胞內正常鈣代謝和凋亡相關基因Bcl-2、p53和Fas表達[2-3]；鉛暴露能影響動物細胞、人體細胞和植物細胞的增殖、分化、DNA復制和修復[4-5]，亦可致實驗動物體內代謝紊亂、生殖細胞畸形，并可產生致死作用[6]。高濃度鉛可影響種子萌發(fā)，抑制植物生長，甚至引起植株死亡[7]。因此，研究鉛誘導細胞死亡的毒性機制具有重要意義。

鉛的生物效應問題已在全世界范圍內引起廣泛關注。目前，關于鉛毒性研究多集中于氧化損傷方面，鉛可引起動植物細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平增高，由此引發(fā)膜脂、蛋白質、DNA等生物大分子的氧化損傷，導致細胞死亡[8-9]。但是，有關鉛的氧化損傷機制還缺乏進一步探討，在鉛誘導真核細胞死亡過程中胞內ROS如何參與以及ROS和胞內Ca2+信號轉導之間的關系尚不清楚。

酵母是一種研究真核生物細胞學機制的模式生物，由于其簡單的遺傳背景，較短的生長周期等優(yōu)點，已被廣泛用于細胞分裂和死亡過程等復雜信號途徑的研究[10]。因此，本文以酵母細胞作為研究對象，探討了在鉛誘導酵母細胞死亡中ROS和Ca2+信號的調控作用，旨在為揭示鉛毒性作用機理提供科學依據。

1材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

酵母(Saccharomyces cerevisiae)EGY48菌株由浙江大學生命科學學院朱睦元教授惠贈。

取單菌落至YPD液體培養(yǎng)基中活化過夜，轉至新YPD液體中，于30 ℃，200 r·min-1下培養(yǎng)至對數期。

1.2 酵母細胞染毒

采用1.5 mL離心管收集對數期的酵母細胞，用滅菌磷酸緩沖液(PBS)洗滌并懸浮，使菌液細胞濃度大約為106cell·mL-1。菌液中加入一定量的Pb(NO3)2，使處理濃度分別為2、7、20、60和100 mg·L-1，分別于30 ℃，200 r·min-1條件下處理3、6和24 h。

干預組分別采用1 mmol·L-1抗壞血酸(AsA)、0.5 mmol·L-1乙二醇雙四乙酸(EGTA)和0.1 mmol·L-1氯化鑭(LaCl3)與20 mg·L-1或60 mg·L-1Pb(NO3)2同時作用。處理6 h后，細胞經PBS洗滌備用。

1.3 細胞死亡率測定

采用美藍染色法測定細胞死亡率，當美藍進入活細胞時，由于活細胞新陳代謝旺盛，可將藍色的美藍還原為無色，而死細胞代謝作用微弱則呈藍色或者淺藍色。取酵母細胞進行染色，置于光學顯微鏡下觀察并計數著色細胞和總細胞數，計算細胞死亡率(著色細胞數/總細胞數×100%)。每一處理組重復3次，每次觀察至少1 000個細胞。

1.4 胞內ROS、Ca2+和線粒體膜電位水平的測定

用PBS制成體積90 μL、細胞濃度106cell·mL-1的細胞懸液3份，各自分別加入體積10 μL、濃度50 μmol·L-1特異性熒光染料二氯熒光黃雙乙酸酯(DCFH-DA)，體積10 μL、濃度50 μmol·L-1的Fluo-3AM和體積10 μL、濃度100 μg·mL-1羅丹明123(Rh123)，用于檢測胞內ROS、Ca2+和線粒體膜電位水平。用BD Accuri C6流式細胞儀(Becton Dickinson and Company, USA)進行檢測，每個樣品收集50 000個細胞，測其熒光強度變化。數據采集和分析分別用CellQuest 3.1f和ModFitLT3.0軟件。

1.5 數據統計分析

采用SPSS17.0軟件對實驗結果進行方差分析，采用Duncan方法檢驗處理組與對照組差異顯著性(*表示差異顯著，P<0.05)，以及干預組與鉛單獨處理組間的差異顯著性(&表示差異顯著，P<0.05)。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 鉛對酵母細胞活性的影響

經美藍染色后顯微鏡觀察發(fā)現，對照組有個別細胞呈淡藍色，而鉛處理組中有較多細胞被染成藍色，說明鉛可對酵母細胞產生毒性，引發(fā)細胞死亡。從圖1可看出，鉛作用在3～24 h內，死亡率與鉛離子濃度呈現明顯劑量效應關系，作用時間越長，死亡率越高：經2 mg·L-1的硝酸鉛作用3 h后，細胞死亡率為2.3%，與對照無明顯差異，但在24 h后死亡率達5.85%，明顯高于對照組；100 mg·L-1硝酸鉛處理3 h后死亡率為33.81%，顯著高于對照，表明鉛對酵母細胞的毒性具有濃度和時間依賴性。

圖1 鉛對酵母細胞的致死率Fig. 1 Effects of lead on mortality of yeast cell

圖2 鉛對酵母胞內活性氧(ROS)水平的影響注：Pb(NO3)2處理組，濃度20 mg·L-1，處理時間為6 h；Pb(NO3)2+AsA為干預組，AsA表示抗壞血酸，濃度為1 mmol·L-1，Pb(NO3)2濃度為20 mg·L-1，處理時間為6 h。Fig. 2 Effects of lead on intracellular reactive oxygen species (ROS) levels in yeast cellsNote: Pb(NO3)2 is the treatment group, with its concentration being 20 mg·L-1 and the treatment time being 6 h. In comparison, Pb(NO3)2+AsA is the intervention group. In this group, the Pb(NO3)2 concentration is 20 mg·L-1, the ascorbic acid (AsA) concentration is 1 mmol·L-1,and the treatment time is 6 h.

2.2 ROS參與鉛誘導酵母細胞死亡

經用流式細胞儀檢測酵母細胞內的ROS水平，發(fā)現20 mg·L-1鉛處理6 h后，胞內ROS水平明顯增高(圖2)，為對照組的5.3倍，而在鉛處理液中加入外源抗氧化劑AsA可降低鉛引發(fā)的胞內ROS水平。同時檢測細胞死亡率，發(fā)現1 mmol·L-1的AsA與20 mg·L-1或60 mg·L-1的鉛同時作用時，細胞死亡率明顯降低(圖3)；表明鉛處理組胞內ROS水平升高與鉛對酵母細胞的毒性作用有關。

圖3 AsA對鉛毒性的干預作用注：20 mg·L-1 Pb(NO3)2和60 mg·L-1 Pb(NO3)2處理組的處理時間分別為3 h和6 h；Pb(NO3)2+AsA為干預組，AsA濃度均為1 mmol·L-1，20 mg·L-1 Pb(NO3)2+AsA和60 mg·L-1 Pb(NO3)2+AsA的處理時間分別為3 h和6 h。* 處理組與對照組的差異顯著P<0.05，&干預組與鉛單獨處理組間的差異顯著P<0.05。Fig. 3 Intervention effects of AsA on Pb-induced yeast cell deathNote: in 20 mg·L-1 Pb(NO3)2 and 60 mg·L-1 Pb(NO3)2 treatment group,the treatment time is 3 h and 6 h respectively. In Pb(NO3)2+AsA intervention group, the AsA concentration is 1 mmol·L-1. The treatment time for 20 mg·L-1 Pb(NO3)2+AsA and 60 mg·L-1 Pb(NO3)2+AsA is 3 h and 6 h. * significant difference between Pb(NO3)2 treatment group and control group, P<0.05; & significant difference between single Pb(NO3)2 treatment group and intervention group with AsA, P<0.05.

2.3 Ca2+參與鉛誘導的酵母細胞死亡

流式細胞儀檢測發(fā)現，20 mg·L-1鉛處理酵母細胞6 h后胞內Ca2+水平明顯增高(圖4)，為對照組的1.7倍，而在鉛處理液中加入EGTA或者LaCl3都能降低鉛引發(fā)的胞內Ca2+水平的增高。同時，在鉛處理液中加入鈣離子干擾劑降低胞內Ca2+水平后檢測細胞死亡率，發(fā)現0.5 mmol·L-1的鈣離子螯合劑EGTA或0.1 mmol·L-1的質膜Ca2+通道抑制劑LaCl3能顯著降低20 mg·L-1和60 mg·L-1鉛的細胞毒性，使細胞死亡率顯著降低(圖5)。這表明鉛處理組胞內Ca2+水平升高與鉛對酵母細胞的毒性作用有關。

圖4 鉛對酵母胞內Ca2+水平的影響注：Pb(NO3)2處理組，濃度為20 mg·L-1，處理時間為6 h；Pb(NO3)2+EGTA為干預組，EGTA表示乙二醇雙四乙酸，濃度為0.5 mmol·L-1，Pb(NO3)2濃度為20 mg·L-1，處理時間為6 h；Pb(NO3)2+LaCl3為干預組，LaCl3表示氯化鑭，濃度為0.1 mmol·L-1，Pb(NO3)2濃度為20 mg·L-1，處理時間為6 h。Fig. 4 Effects of lead on intracellular Ca2+ levels in yeast cellsNote: in Pb(NO3)2 treatment group, Pb(NO3)2 concentration is 20 mg·L-1and the treatment time is 6 h. The Pb(NO3)2+EGTA is the intervention group, in which group the concentration of the ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) is 0.5 mmol·L-1, the Pb(NO3)2 concentration is 20 mg·L-1, and the treatment time is 6 h. In the Pb(NO3)2+LaCl3intervention group, the concentration of lanthanum chloride (LaCl3) is 0.1 mmol·L-1, the Pb(NO3)2 concentration is 20 mg·L-1, and the treatment time is 6 h.

2.4 鉛對酵母細胞線粒體膜電位的影響

經20 mg·L-1鉛處理6 h后，線粒體膜電位下降，為對照組的73%(圖6)。這說明鉛的細胞毒性伴隨著線粒體膜電位的下降，對線粒體膜的損傷參與了介導酵母細胞死亡的途徑。

3 討論(Discussion)

鉛是一種極其重要的工業(yè)和環(huán)境化學污染物，通過食物和飲水等方式進入機體后，可在體內長期蓄積，對人體造成嚴重危害。ROS是細胞受環(huán)境刺激后產生的一種胞內信號分子,可以介導生物適應，也能引發(fā)細胞死亡[11]。本文在檢測到鉛對酵母細胞的毒性作用后，采用流式細胞儀檢測證實了鉛處理組酵母細胞內ROS水平同期升高，用AsA降低鉛處理組胞內ROS水平后，可發(fā)現細胞死亡率下降，從而說明鉛毒性與胞內ROS水平升高有關，鉛引起ROS水平升高介導了其毒性作用，胞內ROS升高是誘發(fā)細胞死亡的重要原因。該結果與其他學者報道的鉛通過ROS水平升高介導動植物細胞死亡的結果一致[8-9]，說明ROS是觸發(fā)鉛毒性作用的關鍵因素。

圖5 EGTA和LaCl3對鉛毒性的干預作用注：20 mg·L-1 Pb(NO3)2和60 mg·L-1 Pb(NO3)2處理組的處理時間分別為3 h和6 h；Pb(NO3)2+EGTA為干預組，EGTA濃度均為0.5 mmol·L-1，20 mg·L-1 Pb(NO3)2+EGTA和60 mg·L-1 Pb(NO3)2+EGTA的處理時間分別為3 h和6 h；Pb(NO3)2+LaCl3為干預組，LaCl3濃度均為0.1 mmol·L-1，20 mg·L-1 Pb(NO3)2+LaCl3和60 mg·L-1 Pb(NO3)2+LaCl3的處理時間分別為3 h和6 h。*處理組與對照組的差異顯著P<0.05，&干預組與鉛單獨處理組間的差異顯著P<0.05。Fig. 5 Intervention effects of EGTA and LaCl3 on Pb-induced yeast cell deathNote: in 20 mg·L-1 Pb(NO3)2 and 60 mg·L-1 Pb(NO3)2 treatment group,the treatment time is 3 h and 6 h respectively. In Pb(NO3)2+EGTA intervention groups, the EGTA concentration is 0.5 mmol·L-1. The treatment time for 20 mg·L-1 Pb(NO3)2+EGTA and 60 mg·L-1 Pb(NO3)2+EGTA is 3 h and 6 h. In Pb(NO3)2+LaCl3 intervention groups, the LaCl3concentration is 0.1 mmol·L-1. The treatment time for 20 mg·L-1 Pb(NO3)2+LaCl3 and 60 mg·L-1 Pb(NO3)2+LaCl3 is 3 h and 6 h. *significant difference between Pb(NO3)2 treatment group and control group,P<0.05; & significant difference between single Pb(NO3)2treatment group and intervention group with EGTA or LaCl3, P<0.05.

圖6 鉛對酵母細胞線粒體膜電位的影響Fig. 6 Effects of lead on mitochondrial membrane potential in yeast cell

研究發(fā)現，ROS主要通過以下2種途徑導致細胞死亡：(1)ROS具有很高的反應活性，可以與細胞中各類大分子物質，如蛋白質、脂類和核酸等發(fā)生反應，從而破壞細胞結構，最終導致細胞死亡；(2)ROS作為重要的信號分子，可通過調節(jié)下游信號事件，啟動細胞的凋亡級聯反應，導致細胞死亡[12]。

已有研究表明，Ca2+水平的失衡可調控細胞內凋亡相關因子Bcl-2/Bax的表達，導致能量代謝等發(fā)生改變，繼而引發(fā)細胞凋亡[13-14]。文中鉛可誘導酵母細胞胞內Ca2+水平顯著升高，用一定濃度Ca2+螯合劑EGTA或Ca2+通道抑制劑LaCl3降低鉛處理組胞內Ca2+水平后，酵母細胞死亡率顯著降低，即胞內Ca2+下降可緩解鉛對酵母細胞的毒性，說明胞內Ca2+升高介導了鉛的毒作用，而胞外Ca2+內流是胞內Ca2+升高的重要原因。鉛誘發(fā)的酵母細胞內ROS水平升高可能是通過激活質膜Ca2+通道，使胞外Ca2+內流，導致胞內Ca2+水平升高，繼而引發(fā)酵母細胞死亡，該研究結果與有關學者報道相一致[15-16]。

線粒體是多種促細胞凋亡信號轉導分子的靶點，在細胞凋亡中起著決定性作用。當細胞受到外界脅迫時，胞內自由基水平升高，線粒體膜發(fā)生脂質過氧化反應[17]；或者胞內Ca2+超載時，誘導線粒體通透性轉換孔(PTP)開放，進而影響線粒體功能，導致線粒體膜電位發(fā)生改變，細胞色素c(cytc)釋放，從而激活下游的凋亡途徑，最終導致細胞凋亡[18]。Rh123是一種線粒體膜電位指示劑，細胞處于存活狀態(tài)時，Rh123通過細胞膜，積聚于線粒體發(fā)出綠色熒光，而在細胞凋亡時，線粒體膜電負性降低，細胞線粒體積聚Rh123的能力也喪失，熒光強度降低[19]。本研究發(fā)現經鉛處理后，Rh123的相對熒光值降低，即胞內線粒體膜電位明顯下降，說明胞內高濃度的Ca2+可能通過誘導線粒體膜通透性轉變孔道開放，或者高水平ROS可能損傷線粒體膜，致線粒體膜電位下降，繼而激活相關下游信號導致細胞死亡。

本文以模式生物酵母菌研究了鉛對酵母細胞的毒性效應，發(fā)現了鉛誘導的細胞死亡及胞內ROS和Ca2+的調節(jié)作用，證實了鉛致死的線粒體途徑，與某些學者在人和動物細胞中的研究結果相似[9,20]，說明鉛毒性作用過程在動物細胞和酵母細胞中具有較高的一致性，而酵母細胞具有生長周期短，易培養(yǎng)，遺傳背景簡單等優(yōu)點，有望作為研究鉛毒性作用的模式系統。

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ROS and Calcium Signal is Involved in Lead Toxicity in Yeast Cells

Zhang Ruigang,Yi Huilan*

School of Life Sciences, Shanxi University, Taiyuan 030006, China

Received 7 January 2016 accepted 17 May 2016

This paper was conducted to research the cellular toxicity of lead based on the model yeasts to explore the role that intracellular reactive oxygen species (ROS) and Ca2+play in the mechanism of the cell death induced by lead. The results revealed that the cellular bioactivity of yeasts was inhibited by lead nitrate at the concentration from 5 to 100 mg·L-1and the cell death induced by lead was found. Yeast cell mortality increases with the increase of lead concentration and the extension of time. The levels of ROS and Ca2+elevated significantly and the mitochondrial membrane potential decreased dramatically in yeast cells under lead stress. Cell death induced by lead was decreased by ascorbic acid (AsA) at the concentration of 1 mmol·L-1and was inhibited by the calcium chelator (EGTA) at the concentration of 0.5 mmol·L-1or the specific inhibitor of plasma membrane Ca2+channel (LaCl3) at the concentration of 0.1 mmol·L-1. The results showed that cell death induced by lead was related to the levels of intracellular ROS and Ca2+. The opening of mitochondrial membrane permeability transition pore channels may be induced by high levels of Ca2+, or mitochondrial membranes were broken by high levels of ROS, which lead to decreasing membrane potential and cause cell death by activating down-stream relevant signal pathways.

lead; yeast cell; cytotoxity; ROS; Ca2+

國家自然科學基金項目(No.30870454, 30470318, 31371868)；山西省科技攻關計劃(No.20120322008-02)；山西省回國留學人員科研項目(No.2012013)

張瑞剛(1984-)，男，博士，研究方向為環(huán)境微生物，E-mail: zhangruigang1224@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yihl@sxu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160107001

2016-01-07 錄用日期：2016-05-17

1673-5897(2016)6-128-06

X171.5

A

儀慧蘭(1963—)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事環(huán)境生物學與逆境生理學方面的研究，承擔和完成國家級研究課題5項，省部級研究課題10余項，發(fā)表研究論文90余篇。

張瑞剛, 儀慧蘭. 活性氧和鈣信號參與鉛對酵母細胞的毒性作用[J]. 生態(tài)毒理學報，2016, 11(6): 128-133

Zhang R G, Yi H L. ROS and calcium signal is involved in lead toxicity in yeast cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 128-133 (in Chinese)