姚璐曄，沈金波，裴丹丹，孫丹鳳，冀宏（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

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杏鮑菇生產(chǎn)包黑斑病害菌分析

姚璐曄，沈金波，裴丹丹，孫丹鳳，冀宏
（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500）

摘要：杏鮑菇生產(chǎn)廠的部分菌絲生產(chǎn)包出現(xiàn)黑斑，從中分離純化得到病害菌（130305S），結(jié)合顯微結(jié)構(gòu)和生理生化試驗(yàn)結(jié)果，以及對其16SrDNA序列的分析確定病害菌的系統(tǒng)發(fā)育地位；通過人工回染試驗(yàn)確定分離得到的病害菌與黑斑出現(xiàn)的相關(guān)性。結(jié)果表明：菌株130305S鑒定為巨大芽孢桿菌屬（Bacillus megaterium）；人工回染試驗(yàn)證實(shí)菌株130305S可導(dǎo)致生產(chǎn)包出現(xiàn)黑斑，菌絲不生長的污染癥狀。

關(guān)鍵詞：杏鮑菇；黑斑；病害菌；巨大芽孢桿菌；人工回染

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側(cè)耳，隸屬于擔(dān)子菌亞門（Basidio mycotina），層菌綱（Hymenom ycetes），無隔擔(dān)子菌亞綱（Homobasidiomycetidae），傘菌目（Agaricades），側(cè)耳科（Pleurotaceae），側(cè)耳屬（Pleuroyus）。杏鮑菇菌肉肥厚，營養(yǎng)豐富，具有杏仁香味和鮑魚味，故稱杏仁鮑魚菇。上世紀(jì)九十年代，美國、日本、我國等采用調(diào)溫、調(diào)濕的自動化生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗(yàn)性栽培，取得了成功[1]。近年來，杏鮑菇工廠化生產(chǎn)過程經(jīng)常出現(xiàn)嚴(yán)重的細(xì)菌性污染，導(dǎo)致生產(chǎn)出現(xiàn)嚴(yán)重的損失[2-9]。我國食用菌病害的研究基礎(chǔ)薄弱，對食用菌病害的病原菌認(rèn)識不清，且隨著食用菌栽培技術(shù)的日趨成熟與周年化生產(chǎn)的實(shí)現(xiàn)，迫切需要對食用菌病害菌進(jìn)行深入研究，以減少病害造成的經(jīng)濟(jì)損失及保障食用菌產(chǎn)品的安全。

本研究以昆山一家杏鮑菇生產(chǎn)廠常出現(xiàn)的生產(chǎn)包黑斑為研究對象，對其進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，并依據(jù)菌落特征、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)手段對分離得到的病原菌進(jìn)行種屬鑒定，并通過人工回染實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證病害菌與污染特征的相關(guān)性。

1材料與方法

1.1材料與培養(yǎng)基

污染杏鮑菇生產(chǎn)包樣本：昆山振興食用菌有限公司。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g/L）：牛肉膏3，NaCl 5，蛋白胨10，pH7.2~7.4。

1.2儀器與設(shè)備

M124A電子天平：伯拉莫貝林（上海）精密儀器有限公司；FE20便攜式（數(shù)顯）pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CJ-2S超凈工作臺：天津泰斯特儀器有限公司；ZQWY-200G振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；PQX-280A-22HM人工氣候箱：寧波萊?？萍加邢薰?；Centrifuge 5418R高速冷凍離心機(jī)、移液槍：德國Eppendorf公司；DYY-6C電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3方法

1.3.1病害菌的分離純化

取10 g被污染生產(chǎn)包中不長菌絲的部位（黑斑），置于90 mL無菌生理鹽水中，振蕩20 min，稀釋，取0.2 mL稀釋液涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h~36 h，挑取單菌落，保存在牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上備用。

1.3.2病害菌的生理生化鑒定

對經(jīng)分離純化得到的菌株進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)、染色觀察及相關(guān)生理生化鑒定[10-14]。

1.3.3病害菌的分子生物學(xué)鑒定

提取菌株的16S rDNA，使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（Code No. RR176），進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)條件具體為：94℃5 min；94℃1min、55℃1min、72℃1.5min，30次循環(huán)；72℃5min。反應(yīng)結(jié)束，取5 μL進(jìn)行3 %瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的片段。送于上海寶生物公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對。選取同源性比較高的典型菌株的16S rDNA基因序列作為參比對象，用CLUSTAL 1.83軟件進(jìn)行多序列比對并計(jì)算目標(biāo)菌株與參比菌株之間的序列相似性[15-16]，采用鄰位相接法（Neighbor-Joining）[17-18]，應(yīng)用MEGA4.0軟件構(gòu)建目標(biāo)菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)進(jìn)化樹[18]。

1.3.4人工回染試驗(yàn)

將37℃培養(yǎng)36 h的病害菌制成菌懸液，取5mL接種至杏鮑菇的生產(chǎn)包中，空白對照組接等量的無菌生理鹽水；置于培養(yǎng)室和菇房正常培養(yǎng)，定期檢測。

2結(jié)果與分析

2.1污染杏鮑菇樣本的性狀

選取工廠中典型的黑斑生產(chǎn)包，具體特征如圖1所示。

杏鮑菇生產(chǎn)包菌絲生長不均，有密有疏，密的地方菌絲濃密白凈，疏的則菌絲稀少，甚至無菌絲生長，出現(xiàn)大小不一的黑斑。延長培養(yǎng)時(shí)間，黑斑出現(xiàn)的地方仍不能長出菌絲。因此，選取黑斑部分作為試驗(yàn)對象。

2.2污染病害菌的分離

選取菌絲生產(chǎn)包中不長菌絲的部分，進(jìn)行涂布培養(yǎng)。平板培養(yǎng)結(jié)果如圖2所示。

圖1菌絲生產(chǎn)包污染Fig.1 Polluted Pleurotus ergngii package

圖2平板培養(yǎng)的菌株Fig.2 The strain cultured on plates

平板上出現(xiàn)一種細(xì)菌，命名為130305S。菌落呈直徑較小圓形的半透明狀，表面有隆起并有光澤度；菌落的中央凸起、濕潤，邊緣整齊光滑。

2.3病害菌的個(gè)體形態(tài)特征

通過普通光學(xué)顯微鏡對病害菌的菌體形態(tài)進(jìn)行觀察，染色結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 130305S的革蘭氏染色結(jié)果（×1 000）Fig.3 Gram staining of 130305S（×1 000）

圖4 130305S的芽孢染色結(jié)果（×1 000）Fig.4 Spore staining of 130305S（×1 000）

130305S為桿菌，以單個(gè)排列，革蘭氏染色陽性，芽孢染色陽性。芽孢著生在菌體中間，長度約為菌體的1/4。

2.4病害菌的生理生化試驗(yàn)

病害菌的生理生化試驗(yàn)見表1。

表1菌株130305S與芽孢桿菌屬部分菌株的生理生化特征Table 1 Physiological properties of strain 130305S and some species of the genus Bacillus

病害菌130305S的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1可知，130305S能夠利用葡萄糖產(chǎn)酸，接觸酶和淀粉水解反應(yīng)均為陽性。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色等結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12-13]，初步判斷病害菌130305S屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）的細(xì)菌。參照上述細(xì)菌分類鑒定手冊對芽孢桿菌屬的鑒定手冊，進(jìn)行了其他生理生化試驗(yàn)，并和Bacillus的細(xì)菌進(jìn)行比較。病害菌130305S生理生化試驗(yàn)結(jié)果和巨大芽孢桿菌（B. Megaterium）基本一致，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)、革蘭氏染色等結(jié)果，初步判斷病害菌130305S是一株巨大芽孢桿菌（B. Megaterium）。

2.5 16S rDNA序列分析

收集病害菌130305S的16S rDNA PCR擴(kuò)增片段，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖5所示。

圖5菌株130305S的16SrDNA電泳圖Fig.5 Electrophoresis patterns of 16S rDNA products from strain 130305S

通過電泳分離后，切膠回收片段進(jìn)行DNA測序。將菌株130305S的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌16S rDNA序列進(jìn)行BLAST同源性比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)130305S的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫中Bacillus屬細(xì)菌的16S rDNA序列自然聚類。利用Clustalx1.83軟件進(jìn)行比對，利用MEGA4.0構(gòu)建進(jìn)化樹，建樹方法采用鄰位歸并法（Neighbor Joining），結(jié)果如圖6所示。

圖6基于16S rDNA的菌株130305S的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain 130305S based on its 16S rDNA sequences

由圖6可見巨大芽孢桿菌130305S和巨大芽孢桿菌菌株（Bacillus megaterium DZ011）的分支，其分支出現(xiàn)的可信度為100 %，表明兩者有較高的親緣性關(guān)系。由于16S rDNA的分子結(jié)構(gòu)具有高度的保守性，只在某些位置有少量的核苷酸序列改變，且這些改變具有種屬特異性，故而利用16S rDNA構(gòu)建基因進(jìn)化樹的可靠性很高。從進(jìn)化時(shí)間上來看，130305S在蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus E33L）之后，在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis XF-1、Bacillus subtilis QB928、Bacillus subtilis subsp. Spizizenii）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis ATCC14580）之前。

2.6人工回染試驗(yàn)

菌絲生產(chǎn)包培養(yǎng)2 d的結(jié)果如圖7所示。

圖7培養(yǎng)3 d的生產(chǎn)包Fig.7 The mycelium package of trained 3 days

對照組和試驗(yàn)組的菌絲都處于剛生長狀態(tài)；對照組各包菌絲生長均勻，而試驗(yàn)組的生長差異較大，長勢較好的菌絲包與對照組的幾乎一樣，長勢差的則無生長跡象，其中長勢差的菌絲包占試驗(yàn)組總包數(shù)的2/3。

生產(chǎn)包培養(yǎng)15 d的結(jié)果如圖8所示。

對照組和試驗(yàn)組的生產(chǎn)包均已長出大片白色菌絲。對照組的菌絲已布滿菌絲包的上表面，同時(shí)向下延伸至菌包外表面1/3處；菌絲濃密且差異較小。試驗(yàn)組的菌絲則剛長滿菌包上表面，開始向下往菌包外表面延伸；長勢緩慢的菌絲還沒長滿菌包上表面，且菌絲稀疏，可看到黑色培養(yǎng)基料。

圖8培養(yǎng)15 d的生產(chǎn)包Fig.8 The mycelium package of trained 15 days

生產(chǎn)包培養(yǎng)19 d的結(jié)果如圖9所示。

圖9菌絲培養(yǎng)19 dFig.9 The mycelium package of trained 19 days

對照組的菌絲基本長到菌包底部，長勢慢的亦至菌包1/2處；菌絲濃密、潔白，菌絲生長處看不到培養(yǎng)基料。實(shí)驗(yàn)組生長最快的生產(chǎn)包，其菌絲長到菌包的1/5處，部分生產(chǎn)包的上表面仍未覆蓋滿菌絲；菌絲稀疏，出現(xiàn)黑斑。

生產(chǎn)包進(jìn)入出菇階段，培養(yǎng)19 d的結(jié)果如圖10所示。

圖10出菇19 d菌包圖Fig.10 The mycelium package 19 days during the mushroom period

對照組出菇狀況良好，菌袋已長出菌柄和菌蓋，長勢較好的子實(shí)體可以進(jìn)如采摘環(huán)節(jié)；試驗(yàn)組的子實(shí)體只處于菌柄生長階段，后續(xù)長勢無力，究其原因?yàn)榫z生長量不足，無法提供足夠的營養(yǎng)供子實(shí)體進(jìn)一步發(fā)育生長。

綜上所述，試驗(yàn)組出現(xiàn)的癥狀與分離得到病害菌的初始菌包相同，故判定病害菌130305S的引入可導(dǎo)致菌絲生產(chǎn)包出現(xiàn)黑斑的污染。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)的研究對象為杏鮑菇生產(chǎn)廠（昆山振興食用菌有限公司）常見生產(chǎn)包黑斑污染現(xiàn)象的病害菌。通過分離純化得到病害菌（130305S）；根據(jù)菌體形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果以及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征，根據(jù)多相分類原則，可將病害菌130305S鑒定為巨大芽孢桿菌種（B. megaterium）的菌株。人工回染試驗(yàn)證實(shí)病害菌130305S可導(dǎo)致杏鮑菇生產(chǎn)包黑斑出現(xiàn)的污染癥狀。

分離得到的病害菌為B. megaterium，芽孢桿菌的芽孢對外界有害因子具有很強(qiáng)的抵抗能力和耐受能力。在工廠化生產(chǎn)過程中，生產(chǎn)包滅菌采用集中滅菌方式，由于滅菌量大，可能會導(dǎo)致部分生產(chǎn)包滅菌不徹底，致使芽孢殘存下來，造成菌包污染。因此，在集中滅菌時(shí)既要保證滅菌的數(shù)量，又要保證滅菌的質(zhì)量；即滅菌時(shí)，生產(chǎn)包之間要留有適當(dāng)?shù)目障?，保證高溫蒸汽能夠滲透到各個(gè)生產(chǎn)包內(nèi)部，從而有效地殺死芽孢。其次，生產(chǎn)料要攪拌均勻，裝料入袋時(shí)松緊度合適，避免出現(xiàn)結(jié)塊。

在保證滅菌質(zhì)量的前提下，也要對培養(yǎng)室及菇房采取可靠的消毒措施，避免在培養(yǎng)環(huán)節(jié)染菌；尤其在5、6月份病害高發(fā)階段，這時(shí)的氣候條件適宜細(xì)菌的生長繁殖。因此建議采用物理和化學(xué)防治相結(jié)合，培養(yǎng)前對培養(yǎng)環(huán)境用紫外燈或消毒劑消毒，培養(yǎng)過程控制好濕度，發(fā)現(xiàn)污染現(xiàn)象及時(shí)處理并結(jié)合使用殺菌劑防治[20-21]；而本研究內(nèi)容將為后續(xù)尋求合理可行的防治方案提供參考。

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Analysis of Disease Bacteria on Blackspot of Pleurotus eryngii Package

YAO Lu-ye，SHEN Jin-bo，PEI Dan-dan，SUN Dan-feng，JI Hong
（School of Biology and Food Engineering，Changshu Institute of Technology，Changshu 215500，Jiangsu，China）

Abstract：This study aimed to analysis the disease bacteria which caused blackspot in Pleurotus eryngii package. The strain named 130305S was isolated from the polluted mushroom fungus package from Pleurotus eryngii factory. According to its microstructure，physiological，biochemical properties and 16S rDNA sequences，the phylogenetic position of the strain was defined. The artificial infection experiment which affirmed the correlation between strain 130305S and blacksport was also done. The results showed that 130305S was identified as Bacillus megateriu. The phenomenon of blackspot appearance，that mycelium was no growth in package was caused by strain 130305S.

Key words：Pleurotusergngii；blackspot；disease bacteria；Bacillusmegaterium；artifical infection experiment

收稿日期：2014-08-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.046

作者簡介：姚璐曄（1983—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，研究方向：食用菌育種及其病害菌。

基金項(xiàng)目：蘇州應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（SYN201007；SYN201212）