任光明，葛雪琴（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

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響應(yīng)面法研究β-環(huán)糊精微波協(xié)同提取甘草黃酮的工藝研究

任光明，葛雪琴
（忻州師范學(xué)院化學(xué)系，山西忻州034000）

摘要：用β-CD微波協(xié)同提取甘草中的黃酮，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面（RSM）分析法，考察β-CD用量、微波功率、料液比、微波時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、對(duì)黃酮提取率的影響。單因素試驗(yàn)確定最佳提取條件為：甘草∶β-CD（質(zhì)量比）為1∶0.8、微波功率200 W、料液比1∶30（g/mL）、微波提取時(shí)間150 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %；響應(yīng)面法試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果為：微波功率200 W、微波提取時(shí)間145s、料液比1∶32（g/mL）。

關(guān)鍵詞：甘草；黃酮；微波提??；響應(yīng)面法

甘草又名粉草、蜜草、甜草等，屬植物的干燥根，甘草味干、平，性溫、微涼，無(wú)毒。藥用價(jià)值歷史悠久[1]，功能主治清熱解毒，祛痰止咳、益氣補(bǔ)中等。在中草藥中具有眾藥之王的美譽(yù)。其主要成分有甘草酸、甘草黃酮類、甘草多糖類化合物。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)甘草研究的深入，發(fā)現(xiàn)甘草中黃酮類物質(zhì)有抗炎、抗病毒、強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用；后又發(fā)現(xiàn)它們能抗氧化、抗衰老、抗腫瘤。另外，甘草黃酮對(duì)糖尿病和肥胖也有一定預(yù)防作用[2]。甘草主要生長(zhǎng)在法國(guó)、意大利、西班牙、伊拉克、伊朗、前蘇聯(lián)各加盟共和國(guó)以及中國(guó)[3]。

環(huán)糊精（CD）具有疏水性的內(nèi)腔和親水性的表面，是超分子化學(xué)中的基礎(chǔ)物質(zhì)之一，它具有的包合特性使其在理論和實(shí)際應(yīng)用中得到迅速發(fā)展[4]。尤其在醫(yī)藥方面，CD和CD衍生物與傳統(tǒng)藥物載體材料相比，無(wú)毒，性質(zhì)穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)獨(dú)特，可用于提高藥物溶解度和穩(wěn)定性，增強(qiáng)藥物利用率[5]。這樣，方法簡(jiǎn)便，效果明顯，便于工藝加工。

目前已有多種方法用于提取和測(cè)定黃酮，其中微波輔助提取就是一種快速有效的方法。微波輔助提取，又稱微波萃取，Microwave Extraction（ME）或Microwave Assisted Extraction（MAE），它是微波和傳統(tǒng)的溶劑萃取法相結(jié)合后形成的一種新的萃取方法[6]。由于微波有很強(qiáng)的穿透性、高的加熱效率和破碎植物細(xì)胞壁的能力，這樣不僅提高了提取效率，縮短了提取時(shí)間，還能大大節(jié)約能源。另一方面微波的快速高溫處理可以將細(xì)胞內(nèi)某些降解有效成分的酶滅活，從而使這些有效成分在藥材保存或提取時(shí)間內(nèi)不會(huì)遭到破壞。所以微波萃取法具有萃取時(shí)間短，溶劑用量少，提取率高，溶劑回收率高，所得產(chǎn)品品質(zhì)好，成本低，投資少等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于食品、化學(xué)合成、分析、環(huán)保等領(lǐng)域[7]。本文選取了β-CD為提取介質(zhì)，采用單因素和響應(yīng)面法試驗(yàn)確定了微波輔助提取黃酮的優(yōu)化條件，直接用可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其含量，并為提取黃酮的工業(yè)生產(chǎn)提供了重要的試驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器和材料

1.1.1儀器

LWMC-201型可調(diào)功率微波化學(xué)反應(yīng)器：南京陵江科技開(kāi)發(fā)公司；725可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.1.2原料

甘草：由忻州惠康藥店提供，粉碎，過(guò)篩，裝瓶待用。

1.1.3試劑

亞硝酸鈉（分析純）、無(wú)水乙醇（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市申泰化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁（分析純）、β-環(huán)糊精（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；試驗(yàn)所用其他試劑為分析純，試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1微波萃取法

準(zhǔn)確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草和0.800 0 g β-CD加入100 mL的圓底燒瓶中，加入30mL的60 %乙醇，放入微波爐，在微波功率為200 W，輻射累計(jì)達(dá)150 s后，將提取液冷卻過(guò)濾，除去物料后將所得濾液用60 %乙醇定容到50 mL容量瓶刻度處。

1.2.2總黃酮的測(cè)定方法

用移液管吸取2 mL黃酮提取液于10 mL的比色管中，加5 %亞硝酸鈉溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加10 %硝酸鋁溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加4 %氫氧化鈉溶液2.0 mL，再用60 %氫氧化鈉的乙醇溶液定容，搖勻后放置15 min。在最大吸收峰510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，計(jì)算黃酮的含量。

甘草總黃酮得率的計(jì)算公式：

甘草總黃酮得率/%=（濾液中黃酮含量/所用甘草重）×100[8]

1.2.3響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）

采用多元二次回歸方程擬合與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求工藝函數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法[9]。

2結(jié)果與討論

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15.00 mg置于50 mL的容量瓶中，加入60 %的乙醇使之溶解，再加入60 %的乙醇定容至刻度，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，每1 mL含無(wú)水蘆丁0.300 0 mg。吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mL，分別置于10 mL比色管中，加5 %亞硝酸鈉溶液0.2 mL，搖勻后放置6 min，加10 %硝酸鋁溶液0.2 mL，搖勻后放置6min，加4%氫氧化鈉溶液2.0mL，再加入60 %的乙醇定容至刻度，搖勻，后放置15 min。在最大吸收峰510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度[10]，所得數(shù)據(jù)經(jīng)回歸處理，得回歸方程為：Y=9.926 4X + 0.016 5，式中：X為被測(cè)樣中黃酮的質(zhì)量；Y為吸光度，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

2.2單因素試驗(yàn)

2.2.1不同介質(zhì)對(duì)甘草中黃酮得率的影響

稱取處理好的1.000 0 g已粉碎的甘草3份分別置于3個(gè)100 mL圓底燒瓶中。分別加入30 mL 60 %乙醇、0.800 0 g β-CD、0.800 0 g HP-β-CD，按1.2.1的方法提取，在510 nm處測(cè)定其吸光度。計(jì)算黃酮的含量（見(jiàn)表1）。

表1不同介質(zhì)中黃酮的得率Table 1 The flavonoids extraction rate of different medium

由表1知，微波輔助β-CD提取甘草中黃酮效果最佳。

2.2.2 β-CD用量對(duì)得率的影響

準(zhǔn)確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它條件不變，只改變?chǔ)?CD用量，甘草β-CD（質(zhì)量比）為1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1，按1.2.1節(jié)方法提取并在510 nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算黃酮的含量，見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，隨著β-CD用量的增加，得率有明顯增加。但當(dāng)增加至0.8000 g后，再增加β-CD用量，得率沒(méi)有進(jìn)一步增大，故選擇最佳β-CD用量為0.800 0 g。

圖1 β-CD用量對(duì)得率的影響Fig.1 Effect of β- cyclodextrin amount on the yield

2.2.3微波功率對(duì)得率的影響

準(zhǔn)確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它條件不變，只改變微波功率為（160、200、240、280、320 W）按1.2.1的方法提取并在510 nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算黃酮的含量，見(jiàn)圖2。

圖2微波功率對(duì)得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on the yield

從圖2可看出，微波功率在160 W~200 W內(nèi)，得率隨著微波功率的增大有明顯增加。但當(dāng)微波功率增大到50 %以上時(shí)，隨著微波功率的增大，得率下降。故選擇200 W為最佳微波提取功率。

2.2.4料液比對(duì)得率的影響

準(zhǔn)確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它條件不變，只改變液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/ g）按1.2.1節(jié)方法在510 nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算黃酮的含量得率，見(jiàn)圖3。

圖3液料比對(duì)得率的影響Fig.3 Effect of ratio of material to liquid on the yield

從圖3可看出，在料液比為1∶30（g/mL）的條件下，得率達(dá)最大值，繼續(xù)增加料液比，得率明顯下降，故選擇1∶30（g/mL）為最佳料液比。

2.2.5時(shí)間對(duì)得率的影響

準(zhǔn)確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它條件不變，只改變微波輻射時(shí)間為（60、90、120、150、180s），按1.2.1節(jié)方法在510 nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算黃酮的含量，見(jiàn)圖4。

圖4時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.4 Effect of time on the yield

從圖4可看出，隨著微波輻射時(shí)間的增加，得率有明顯的增加，但當(dāng)增至150 s后，得率隨著輻射時(shí)間的增加而減少，故選擇150 s為最佳微波輻射時(shí)間。

2.2.6乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)得率的影響

準(zhǔn)確稱量1.000 0 g的已粉碎的甘草，固定其它條件不變，只改變乙醇的體積分?jǐn)?shù)為50 %、60 %、70 %、80 %、90 %，按1.2.1節(jié)方法在510 nm處測(cè)定其吸光度，計(jì)算黃酮的含量，見(jiàn)圖5。

圖5乙醇濃度對(duì)得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the yield

從圖5可看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)在40 %~60 %內(nèi)，得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大有明顯增加。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增大到60 %以上時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，得率下降，在80 %有小幅度上升，但考慮耗能等因素。故選擇60 %為最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.3響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上[最優(yōu)條件為：β-CD用量為0.800 0 g、微波功率200 W、輻射時(shí)間150 s、料液比1∶30（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60 %]，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案做響應(yīng)曲面研究，3個(gè)自變量微波功率、提取時(shí)間、料液比分別以X1，X2和X3代表，以+1，0，-1分別代表各自的不同水平，編碼因素及水平、試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。

2.3.2模型建立及顯著性檢驗(yàn)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，以微波功率、提取時(shí)間、料液比為參數(shù)，黃酮得率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表2響應(yīng)面法分析因素及水平Table 2 Analytical factors and levels for response surface methodology analysis

表3響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案和結(jié)果Table 3 Experiment design and results of response surface methodology

利用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到黃酮得率（Y）對(duì)編碼自變量：微波功率（X1）、提取時(shí)間（X2）、液料比（X3）之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

回歸方程系數(shù)及顯著性檢查見(jiàn)表4。

表4回歸方程系數(shù)及顯著性檢查Table 4 Regression coefficient and significance test

續(xù)表4回歸方程系數(shù)及顯著性檢查Continue table 4 Regression coefficient and significance test

從表4黃酮得率回歸模型方差分析（ANOVA）可以看出：F回=243.599 3，P<0.000 1，表明本試驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)式模型具有高度的顯著性與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好。模型的R2=0.996 8，模型的校正決定系數(shù)R2Adj=0.992 7，表明僅有不到0.8 %的黃酮提取率的總變異不能由此模型來(lái)解釋。同時(shí)，由表4可見(jiàn)，一次項(xiàng)中X1，X2顯著；交互項(xiàng)中X2X3極顯著，二次項(xiàng)中X12，X22，X32極顯著。

Design Expert軟件中Box-Benhnken法[11]計(jì)算甘草中黃酮得率回歸模型的調(diào)整系數(shù)（Adj R-squared）Adj R2=0.996 8，即該模型能解釋99.68 %響應(yīng)值的變化，表示該模型擬合程度良好，且試驗(yàn)誤差小，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化甘草中黃酮的提取條件是可行的。

2.3.3響應(yīng)曲面分析

利用Design Expert 7.0.0軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及響應(yīng)曲面見(jiàn)圖6~圖8。

根據(jù)二次模型所得到的等高線及響應(yīng)面可以評(píng)價(jià)試驗(yàn)因素之間的交互作用程度，以及確定各因素的最佳水平范圍。

由圖6可知：當(dāng)料液比為1∶30（g/mL），提取時(shí)間不變的條件下，微波功率在160 W~200W范圍內(nèi)增大時(shí)，甘草中黃酮得率增加，并在200 W附近達(dá)到極大之后降低，與單因素試驗(yàn)結(jié)果吻合。提取時(shí)間的影響不大，曲面比較平滑。

由圖7可知：微波功率、料液比的影響都顯著，兩個(gè)曲面都比較陡。等高線呈圓形，說(shuō)明兩因素作用很強(qiáng)，影響顯著[12]。

由圖8可知：微波功率固定的條件下，液料比不變的情況下，甘草中黃酮得率受提取時(shí)間的影響不太顯著，表現(xiàn)為曲面比較平緩，先升高后平緩降低的曲線。

圖6微波功率、提取時(shí)間的等高線和響應(yīng)曲面圖Fig.6 Contour and response surface plots for the effects of microwave power and extraction time on the yield of flavonoids

圖7微波功率、液料比的等高線和響應(yīng)曲面圖Fig.7 Contour and response surface plots for the effects of microwave power and liquid-to-solid on the yield of flavonoids

圖8提取時(shí)間、液料比的等高線和響應(yīng)曲面圖Fig.8 Contour and response surface plots for the effects of extraction time and liquid-to-solid on the yield of flavonoids

由圖6~圖8可以看出等高線呈橢圓，說(shuō)明提取時(shí)間和微波功率、微波功率和液料比、液料比和提取時(shí)間之間交互影響顯著[13]，響應(yīng)面陡峭說(shuō)明提取得率對(duì)提取時(shí)間、微波功率和液料比的變化敏感[8]。

對(duì)回歸方程求導(dǎo)，并令其等于零，可以得到曲面的最大點(diǎn)，即3個(gè)因素的最佳水平值，轉(zhuǎn)換后得到提取的最佳條件為甘草∶β-CD（質(zhì)量比）為1∶0.8，微波功率200 W，提取時(shí)間145 s，料液比1∶32（g/mL），此時(shí)甘草中黃酮的得率達(dá)1.484 %。

2.4模型驗(yàn)證

對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，選擇的條件為甘草∶β-CD（質(zhì)量比）為1∶0.8、微波功率200 W、微波提取時(shí)間145s、料液比1∶32（g/mL），黃酮得率分別為1.472 %，1.462 %，1.402 %，平均為1.445 %，相對(duì)誤差為2.6 %，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性良好，偏差不大，吸光度測(cè)定值穩(wěn)定說(shuō)明每次測(cè)定的黃酮含量穩(wěn)定，說(shuō)明該結(jié)果是合理可靠的。

3結(jié)論與展望

本文以甘草為原料，運(yùn)用現(xiàn)代的微波提取技術(shù)，采用可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)甘草中黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定，獲得結(jié)論如下：

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面法的優(yōu)化，獲得微波輔助β-CD介質(zhì)提取甘草中黃酮的最佳工藝條件：甘草∶β-CD（質(zhì)量比）為1∶0.8，微波功率200 W，提取時(shí)間145 s，料液比1∶32（g/mL），此時(shí)甘草中黃酮的得率達(dá)1.484 %。模型經(jīng)驗(yàn)證后結(jié)果穩(wěn)定，表明響應(yīng)曲面法更好地反映了各因素對(duì)得率的影響，以及因素間的相互作用強(qiáng)度，是一種比較好的優(yōu)化工藝的方法。

黃酮類化合物是甘草中一類重要的活性成分。在甘草的根、葉中，均含有數(shù)量相當(dāng)可觀的黃酮類化合物，具有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。如何有效地提取這些化合物成為中藥研究的關(guān)鍵技術(shù)之一，文中數(shù)據(jù)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用黃酮這一自然資源提供了重要的試驗(yàn)依據(jù)。

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Research of Microwave and β-Cyclodextrin Coassisted Extraction Licorice Flavonoids by Response Surface Method

REN Guang-ming，GE Xue-qin
（Department of Chemistry，Xinzhou Teachers University，Xinzhou 034000，Shanxi，China）

Abstract：On the basis of single factor experiment using the response surface method，microwave-assisted extraction of licorice flavonoids with β-CD as media was investegated. The impact factor，such as the amount of β-CD，microwave power，solid-liquid ratio，microwave time and the concentration of ethanol were determined，the optimum extraction conditions was as follows：the amount of beta-CD 0.800 0 g，microwave power 200 W，solid-liquid ratio 1∶30（g/mL），microwave extraction time 150 s，the concentration of ethanol 60 %；response surface method for experimental optimization results as follows：microwave power 200 W，the microwave extraction time 145 s，the solid-liquid ratio of 1∶32（g/mL）.

Key words：licorice；flavonoids；microwave extraction；response surface method

收稿日期：2014-07-23

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.01.027

作者簡(jiǎn)介：任光明（1963—），男（漢），教授，本科，從事分析化學(xué)教學(xué)與科研工作。

基金項(xiàng)目：忻州師范學(xué)院化學(xué)化工創(chuàng)新實(shí)踐基地（院政字201331）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（2013328）