孫秀霞，于 超，賴?yán)棼?，李守明，曾沂輝，薛 琳

(新疆石河子蔬菜研究所，新疆石河子 832000)

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加工番茄Tm-22基因的SCAR鑒定

孫秀霞，于 超，賴?yán)棼?，李守明，曾沂輝，薛 琳

(新疆石河子蔬菜研究所，新疆石河子 832000)

摘要：【目的】建立利用SCAR標(biāo)記技術(shù)鑒定番茄花葉病毒病抗性基因Tm-22的技術(shù)體系，開展分子標(biāo)記輔助選擇育種，選育加工番茄抗病品種?！痉椒ā恳?份ToMV表現(xiàn)型鑒定已知的加工番茄材料為試材，選用與Tm-22基因連鎖的SCAR標(biāo)記，通過PCR擴(kuò)增和Hind III酶切鑒定有無Tm-22基因，并將其應(yīng)用于加工番茄品種選育?！窘Y(jié)果】抗感試材均產(chǎn)生950 bp和1 100 bp的特異片段，純合抗病基因型無Hind III酶切位點(diǎn)，雜合抗病基因型和感病基因型有Hind III酶切位點(diǎn)，酶切結(jié)果為：純合抗病1 100 bp+950 bp、雜合抗病1 100 bp+950 bp+500 bp+300 bp+150 bp、感病基因1 100 bp+500 bp+300 bp+150 bp?！窘Y(jié)論】通過酶切產(chǎn)生的特異性片段就可鑒定出Tm-22基因，成本低，操作不受時(shí)間、地域、發(fā)育時(shí)期的限制，提高了選擇的準(zhǔn)確性，加快了育種進(jìn)程。

關(guān)鍵詞：SCAR標(biāo)記；加工番茄；Tm-22基因；分子標(biāo)記輔助選擇

0引 言

【研究意義】加工番茄(Solanumlycopersicum)原產(chǎn)自南美洲西部太平洋沿岸，因其風(fēng)味獨(dú)特、富含多種維生素及礦物質(zhì)、番茄紅素含量高、適應(yīng)性廣、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，已發(fā)展成為世界范圍內(nèi)廣泛種植的蔬菜之一，在世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和農(nóng)業(yè)市場(chǎng)中占有重要的地位[1]。新疆具有得天獨(dú)厚的資源優(yōu)勢(shì)和生態(tài)條件，已成為全球加工番茄種植和加工的三大中心之一，番茄生產(chǎn)能力占到全國(guó)的90%以上[2]，加工番茄產(chǎn)業(yè)已成為新疆的特色型“紅色”支柱產(chǎn)業(yè)和創(chuàng)匯產(chǎn)業(yè)[3-4]。隨著種植面積和規(guī)模的不斷擴(kuò)大，連作年限延長(zhǎng)，以番茄花葉病毒(Tomato Mosaic Virus, ToMV)為主的病毒病頻繁爆發(fā)，常造成品質(zhì)下降，產(chǎn)量銳減，甚至絕收，危害十分嚴(yán)重[5-6]。培育和推廣抗病品種是防御病害最安全、經(jīng)濟(jì)、有效的途徑，通過分析與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記來判斷抗病基因是否存在，可以大大加速抗病基因的轉(zhuǎn)移和利用，從而提高抗病育種的效率?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物抗病育種依賴于抗病基因的鑒定和利用，目前已鑒定出番茄花葉病毒病的3個(gè)顯性抗病基因Tm-1、Tm-2和Tm-22(或Tm-2a)，其中Tm-22基因?qū)Σ煌晗稻憩F(xiàn)高抗性[7]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已在番茄中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與Tm-22基因連鎖的分子標(biāo)記并應(yīng)用于輔助育種[8-12]，但在加工番茄中鮮有報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于加工番茄中Tm-22基因的鑒定及分子標(biāo)記輔助選擇研究報(bào)道較少，建立利用序列特異性擴(kuò)增區(qū)域(sequence characterized amplified region，SCAR)標(biāo)記篩選Tm-22基因的技術(shù)體系并應(yīng)用于加工番茄的品種選育，加快抗病育種進(jìn)程?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用與抗病基因緊密連鎖的SCAR標(biāo)記進(jìn)行Tm-22基因的鑒定與輔助選擇，為番茄花葉病毒病的分子輔助育種、抗性基因精細(xì)定位及多基因聚合育種等研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　材 料

所用加工番茄材料共6份，均由新疆石河子蔬菜研究所提供，其中4份材料通過傳統(tǒng)方法鑒定為ToMV抗病，其余2份被鑒定為ToMV感病。YF08(EFS，SSC≥6%，LERCOPERION CONTENT≥15 mg/100 g)是高代加工番茄自交系，用于配置雜交組合。Tm-22基因的SCAR標(biāo)記引物參照Dax[13]等設(shè)計(jì)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。表1，表2

表1材料的抗病性及SCAR標(biāo)記擴(kuò)增的特異性片段
Table l The disease resistance of the materials and the specific fragments amplified by SCAR markers

編號(hào)No.材料Material抗病性DiseaseResistance擴(kuò)增產(chǎn)物Amplifiedproducts(bp)HindⅢ酶切結(jié)果(bp)DigestedproductsbyHindⅢ1LM43感病950、11001100、500、300、1502ES29感病950、11001100、500、300、1503TJ31抗病950、11001100、500、300、1504LP17抗病950、11001100、950、500、300、1505GF35抗病950、11001100、950、500、300、1506TX24抗病950、11001100、950

表2引物信息
Table 2 The information of the primers

引物名稱Primername引物序列Primersequence(5’→3')片斷長(zhǎng)度Fragmentlength(bp)SCARFCACCTTTCCCTCTCCAASCARRCACCTTTCCCCTAAAGC950、1100

1.2　 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取

取離心管蓋大小、還未展開的嫩葉0.1 g左右，參照Hemming等[14]利用改良的CTAB法提取基因組DNA，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SCAR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

反應(yīng)總體系25 μL，包含Buffer 2.5 μL、dNTPs 0.1 mmol/L、Mg2+1.5 mmol/L、引物0.2 μmol/L、TaqDNA聚臺(tái)酶1 U、模板DNA 20 ng，終體積用水加至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1min，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓5 V/cm條件下電泳2 h，EB替代物染色，GelDoc-it2凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.3 酶 切

Tm-22基因的SCAR標(biāo)記為共顯性，其PCR產(chǎn)物需要酶切[13]，酶切體系為擴(kuò)增產(chǎn)物7 μL，5 U的HindIII，最終用Buffer加至終體積10 μL。反應(yīng)體系在37 ℃保溫4 h，結(jié)果用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓5 V/cm條件下電泳2 h，EB替代物染色，GelDoc-it2凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.4 分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)的應(yīng)用

選取鑒定結(jié)果為Tm-22基因純和的加工番茄材料做父本，以綜合性狀優(yōu)良的自交系YF08為母本配置雜交組合，利用建立的SCAR標(biāo)記技術(shù)體系，對(duì)其F2代單株進(jìn)行Tm-22基因的篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1　Tm-22基因的SCAR標(biāo)記

利用SCAR正反引物對(duì)全部試材擴(kuò)增，結(jié)果表明無論是抗病材料還是感病材料均擴(kuò)增出了950 bp和1 100 bp的特異性片段(圖1 A)。經(jīng)HindIII酶切后，感病材料的950 bp條帶被切開產(chǎn)生約500、300和150 bp的三條帶(圖1 B 1和2)?？共〔牧铣霈F(xiàn)兩種酶切結(jié)果：950 bp條帶被不完全切開，產(chǎn)生約950、500、300和150 bp四條帶(圖1 B 4和5)；950 bp條帶未被切開(圖1 B 6)。參照陳麗靜[11]、李君明[12]等的研究結(jié)果可得出，在抗病材料中，950 bp條帶被不完全切開的是雜合抗病基因型，950 bp條帶未被切開的是純和抗病基因型。圖1

2.2　 SCAR標(biāo)記對(duì)傳統(tǒng)鑒定結(jié)果的驗(yàn)證

將SCAR標(biāo)記的鑒定結(jié)果與田間抗病性表現(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，材料TJ31的標(biāo)記鑒定結(jié)果(感病)(圖1 B 3)與其田間抗病性表現(xiàn)(抗病)不符。導(dǎo)致這種現(xiàn)象發(fā)生的原因，除去基因之間可能產(chǎn)生的交換重組外，還應(yīng)考慮到接種發(fā)病情況和抗病調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)等。圖1

圖1 SCAR引物擴(kuò)增產(chǎn)物(A)和HindIII酶切結(jié)果(B)
Fig.1The products amplifiedby SCAR primer(A)and digested byHindⅢ enzyme(B)

2.3　 SCAR標(biāo)記技術(shù)在加工番茄育種中的應(yīng)用

根據(jù)酶切產(chǎn)生的特異性片段，選取鑒定結(jié)果為純和抗病基因型的TX24做父本，以綜合性狀優(yōu)良的自交系YF08為母本配置雜交組合。利用建立的SCAR標(biāo)記技術(shù)對(duì)其F2代單株進(jìn)行鑒定，所有材料均擴(kuò)增出了950 bp和1 100 bp的特異性片段。經(jīng)HindIII酶切后，出現(xiàn)三種結(jié)果：(1)950 bp條帶被切開產(chǎn)生約500 bp、300 bp和150 bp的三條帶(圖2 B 1~3、7~15)，即感病基因型；(2)950 bp條帶被不完全切開，產(chǎn)生約950、500、300和150 bp四條帶(圖2 B4、16和18)，即雜合抗病基因型；(3)950 bp條帶未被切開(圖2 B5、6和17)，即純和抗病基因型。圖2

圖2 部分F2代單株的SCAR擴(kuò)增產(chǎn)物(A)和HindIII酶切結(jié)果(B)
Fig.2The SCAR amplification (A)and caps products (B) of the partial F2individuals

3 討 論

病毒病是加工番茄生產(chǎn)中的主要病害之一。近年來，隨著加工番茄的大面積種植和連續(xù)種植，連作和重茬增多，病毒病害也日趨嚴(yán)重，一旦爆發(fā)，常造成產(chǎn)量銳減，甚至絕收。在我國(guó)其主要病原為番茄花葉病毒，因藥劑難以防治，抗病毒育種受到高度重視[15]。傳統(tǒng)的表型鑒定和人工接種抗病性鑒定程序煩瑣、耗時(shí)、耗力，還因受環(huán)境條件、人為鑒定標(biāo)準(zhǔn)的差異造成鑒定結(jié)果不穩(wěn)定，延長(zhǎng)育種周期。DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為解決以上問題帶來了契機(jī)，它能從DNA水平上鑒定抗病位點(diǎn)，不受時(shí)間、地域的限制，提高了選擇效率，加速了育種工作進(jìn)程，為早期抗病基因快速篩選鑒定提供了一項(xiàng)有力手段。研究利用與ToMV抗性基因Tm-22緊密連鎖的SCAR標(biāo)記[13]，通過PCR擴(kuò)增和酶切結(jié)果來鑒定抗性基因的有無。參照前人研究結(jié)果可以得出，純和抗病基因型無HindIII酶切位點(diǎn)，酶切結(jié)果為：1 100 bp+950 bp；雜合抗病基因型和感病基因型有HindIII酶切位點(diǎn)，酶切結(jié)果為：雜合抗病1 100 bp+950 bp+500 bp+300 bp+150 bp、感病基因1 100 bp+500 bp+300 bp+150 bp。酶切結(jié)果與李君明等[12-13]有一定的差異，其原因可能是與所使用的Marker、電泳時(shí)間及PCR擴(kuò)增體系、酶切條件不同有關(guān)。研究經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)和不同材料驗(yàn)證，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于Tm-22基因的鑒定。

分子標(biāo)記輔助選擇的前提條件是篩選到與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記， 一經(jīng)確定與某一目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，就可以在分離群體的早代、植株發(fā)育的早期，甚至在一個(gè)生長(zhǎng)季進(jìn)行多次選擇，可顯著加快育種速度。在眾多分子標(biāo)記中，SCAR因其具有快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、成本低、適用于樣品的大量分析等優(yōu)點(diǎn)，在標(biāo)記輔助選擇實(shí)踐中最易成為與具體性狀連鎖并能自動(dòng)化的首選標(biāo)記[16]，在分子標(biāo)記輔助選擇領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[17-18]。研究篩選的SCAR標(biāo)記，在不同研究報(bào)道中，因所使用的Marker、電泳時(shí)間及PCR擴(kuò)增體系、酶切條件不同會(huì)造成酶切產(chǎn)物不同，但其核心本質(zhì)都在于950 bp的條帶能否被切開。即：950 bp的條帶不被切開，材料被鑒定為純和抗病基因型；950 bp的條帶被不完全切開，材料被鑒定為雜合抗病基因型；950 bp的條帶被完全切開，材料被鑒定為純和感病基因型。根據(jù)950 bp條帶的酶切結(jié)果，就可在F2代單株篩選Tm-22基因，配合使用花藥培養(yǎng)技術(shù)和組織培養(yǎng)技術(shù)，就可加快育種材料純和的研究與應(yīng)用。

4 結(jié) 論

建立了利用SCAR標(biāo)記技術(shù)鑒定ToMV抗性基因Tm-22的技術(shù)體系，通過酶切產(chǎn)生的特異性片段來鑒別材料的基因型，并將其應(yīng)用于加工番茄的輔助選擇育種，結(jié)果穩(wěn)定、可靠，提高了選擇的準(zhǔn)確性，加快了育種進(jìn)程，對(duì)加工番茄抗病品種的選育具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。

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Fund project:Supported by National Science and Technology Supporting Program (2012BAD02B04), the Special Fund for Youth Scientific and Technological Innovation of XPCC (2013CB007), Agricultural Science and Technology Program for Tackling Key Problems of Shihezi (2013NY10) and the Special Fund for Non-profit Research Institutions of Ministry of Agriculture, P. R. China (201303115)

Identification of the Tm-22Gene by SCAR Markers in

Solanum lycopersicum

SUN Xiu-xia，YU Chao，LAI Li-li，LI Shou-ming，ZENG Yi-hui，XUE Lin

(TheVegetableResearchInstituteofShihezi，ShiheziXinjiang832000，China)

Abstract：【Objective】 This research attempts to identify Tm-22gene which is resistant to tomato mosaic virus by SCAR markers and a technical system for molecular marker-assisted breeding is intended to be established in the hope of providing a theoretical basis for disease resistant varieties breeding in Solanum lycopersicum.【Method】The SCAR markers which is tightly linked with Tm-22gene were used to amplify genome DNAs of six materials (the result of phenotype identification has been already known), using PCR amplification and Hind III enzyme to identify whether it contains Tm-22gene or not. After identification, the resistant breeding took advantage of it. 【Result】 Both resistant and susceptible materials produced 950 bp and 1,100 bp fragment. The amplified bands from susceptible and heterozygous were distinguishable after cleavage with the restriction enzyme Hind III. Genotype susceptible and heterozygous with Tm-22gene could produce respectively 1,100, 500, 300 and 150 bp and 1,100, 950, 500, 300 and 150 bp, homozygous genotypes still presented 1, 100 and 950 bp fragment.【Conclusion】According to the products which was digested by Hind Ⅲ enzyme we can make sure whether it contains Tm-22gene or not. The result of this method is obvious and reliable with low cost, not limited by time, region or growing periods, and it improves the accuracy of the selection and speeds up the breeding process.

Key words：SCAR marker; Solanum lycopersicum; Tm-22gene; molecular marker-assisted selection

通訊作者:薛琳(1964-)，男，陜西神木人，研究員，研究方向?yàn)槭卟擞N與栽培，(E-mail)xuelin1806@163.com

作者簡(jiǎn)介:孫秀霞(1985-)，女，甘肅天水人，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)榉堰z傳育種，(E-mail)sunxiuxia1983@sina.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAD02B04)；兵團(tuán)青年科技創(chuàng)新資金專項(xiàng)(2013CB007)；石河子農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃(2013NY10)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201303115)

收稿日期：2015-05-16

中圖分類號(hào)：S641.2;S188

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-4330(2016)02-0220-05

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.02.004