謝 輝，陳振波，吳定昌，鐘振鑫，胡金良

（1.肇慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東肇慶 526040；2.肇慶市高新區(qū)恒豐動物保健品有限公司，廣東肇慶 526238）

不同免疫劑量和途徑對豬流行性腹瀉血清抗體的試驗

謝 輝1，陳振波1，吳定昌2，鐘振鑫2，胡金良1

（1.肇慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東肇慶 526040；2.肇慶市高新區(qū)恒豐動物保健品有限公司，廣東肇慶 526238）

文章對不同免疫劑量、不同免疫途徑與豬只體內(nèi)血清中和抗體水平相關(guān)性進行研究，為今后研究中對疫苗的生產(chǎn)工藝改進，優(yōu)化免疫程序等研究提供理論依據(jù)，從而為制定有效的防控措施，促進養(yǎng)豬業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展做好鋪墊。

豬流行性腹瀉 免疫 研究

豬流行性腹瀉（PED）是由冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一種以仔豬水樣腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征的接觸性腸道傳染病。2010年以來，豬流行性腹瀉瘋狂肆虐我國廣大養(yǎng)殖戶，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。通過疫苗免疫，提高了豬對該病的抗體水平，從而達到免疫預防的效果，是控制該病最常用的方法。該文對不同免疫劑量和途徑與豬體內(nèi)血清抗體水平相關(guān)性進行研究，為今后對疫苗的生產(chǎn)工藝改進，優(yōu)化免疫程序等研究，提供理論依據(jù)，也為制定有效的防控措施，促進養(yǎng)豬業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展做好鋪墊。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

32頭25 d齡PEDV抗體陰性的斷奶仔豬及豬流行性腹瀉氫氧化鋁膠滅活疫苗（A疫苗）購自廣東某公司；Vero細胞、CV777病毒液、基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基（Hyclone）、胎牛血清（Gibco）、PBS液、0.05%胰蛋白酶-EDTA消化液等購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與免疫

將30頭仔豬分成6組，每組5頭，以A疫苗按照使用劑量為0.5 ml/頭、1 ml/頭、2 ml/頭，分別進行后海穴注射和頸部肌肉注射免疫。同時，設(shè)陰性對照2頭。同等條件下分組飼養(yǎng)，定期采血檢查，以血清中和試驗法測定PEDV抗體效價。首免后3周以相同的疫苗、免疫劑量及免疫途徑2免。

1.2.2 免疫后抗體檢測

（1）抗體監(jiān)測。首次免疫前采集每頭豬血液2 ml，監(jiān)測抗體是否為陰性。首次免疫后7 d、14 d和21 d采血，分離血清，檢測中和抗體產(chǎn)生情況。首免后21 d進行2免，監(jiān)測2免后7 d、14 d和21 d的抗體產(chǎn)生情況。

（2）血清分離處理方法。血液2～8℃靜置過夜后，以1.2萬r/min以上離心10 min，吸取上清至無菌離心管中，-20℃以下長期保存?zhèn)溆?。按計劃使用量?.1倍取血清樣，用含抗生素的無血清細胞培養(yǎng)基4倍稀釋后，1.2萬r/min離心10 min，取上清至離心管中。56℃熱滅活30 min用于中和試驗。

（3）中和抗體檢測操作。取50 ul無血清細胞培養(yǎng)基到96孔細胞板中，然后加等量待檢血清到第1孔，混勻后再吸等量到第2孔，如此2倍稀釋至1∶256的稀釋度。每孔加入等量用含抗生素2%FBS的細胞培養(yǎng)基稀釋200TCID50/0.1 ml的病毒液，混勻后，置濕盒中37℃中和1 h，期間搖動2～3次，每個樣作4孔。中和完成后，中和物加入到生長24 h以內(nèi)，鋪滿80%左右單層細胞的細胞板中。37℃吸附作用1 h后，放置在 37℃ 的5%二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3～5 d判斷結(jié)果。設(shè)立病毒對照：用含抗生素2%血清的細胞培養(yǎng)基200TCID50/0.1 ml病毒液稀釋成0.1、1、10倍作為病毒對照，同樣放37℃中和1 h。同時，設(shè)置健康對照細胞（即不接種病毒和待檢血清的細胞懸液孔）。正常細胞對照應在整個中和試驗中，一直保持良好的形態(tài)和生活特征。整個過程必須是無菌操作完成。

中和抗體檢測結(jié)果判斷，以50%以上不出現(xiàn)CPE的血清最高稀釋度倍數(shù)判定。該血清的抗體效價滴度按Reed-Muench法計算中和指數(shù)。

2 結(jié)果

根據(jù)免疫后中和抗體效價結(jié)果可知，當免疫劑量相同時，不同的免疫途徑對免疫后中和抗體水平有影響，以后海穴注射和肌肉注射作為免疫途徑，抗體效價在首免后2周達到峰值，而后消降；在首免后第3周2免，抗體在首免后第5周再次出現(xiàn)峰值，而后消降，且后海穴注射免疫比肌肉注射免疫抗體效價更高，抗體維持時間更長。

當免疫途徑相同時，不同的免疫劑量對免疫后中和抗體水平有影響，以2 ml、1 ml、0.5 ml免疫劑量的免疫實驗豬，抗體效價在首免后2周達到峰值，而后消降；在首免后第3周2免，抗體在首免后第5周再次出現(xiàn)峰值，而后消降，且免疫2 ml的抗體整體水平比免疫1 ml的更高，免疫0.5 ml的中和抗體水平最低。

3 討論

以后海穴注射免疫、頸部肌肉注射免疫為免疫途徑，2 ml、1 ml、0.5 ml不同的免疫劑量，研究對疫苗中和抗體效價消長規(guī)律。當免疫劑量相同時，后海穴注射比肌肉注射免疫抗體效價更高，且抗體維持時間更長；當免疫途徑相同時，免疫2 ml的抗體整體水平比免疫1 ml的更高，免疫0.5 ml的中和抗體水平最低。

后海穴位于肛門與尾根之間的凹陷處，在此穴位對癥注射藥物，能刺激動物的神經(jīng)系統(tǒng)，對治療胃腸道系統(tǒng)疾病有很好效果。但免疫以氫氧化鋁膠為佐劑的疫苗抗體消減快，持續(xù)時間短（3周左右），對整個哺乳階段不能提供完整的保護。因此，在今后的研究中重視疫苗生產(chǎn)工藝的改進，可從油佐劑、油包水佐劑疫苗方向進行研究，目的是提高疫苗對豬體的保護力，優(yōu)化免疫程序，制定有效的防控措施，促進養(yǎng)豬業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。

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[2] 田野，張海明．不同免疫途徑對豬流行性腹瀉血清抗體的影響．養(yǎng)豬，2013，5（01）：128

[3] 郝偉偉，張麗燕．免疫接種途徑及佐劑對豬傳染性胃腸炎、流行性腹瀉二聯(lián)活疫苗免疫效果的影響．養(yǎng)豬，2014，1（02）：106～107

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