戴黃益，劉明志，呂鎮(zhèn)城

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院云南昆明 650224；2.惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東惠州 516007）

頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法鑒別產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生菌株J11和誘變菌株J11-8

戴黃益1，2，劉明志2*，呂鎮(zhèn)城2

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院云南昆明 650224；2.惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東惠州 516007）

采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（HS-SPME-GC-MS）對(duì)產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌J11及其誘變菌株J11-8的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析.結(jié)果表明，J11菌株可鑒定19種揮發(fā)性成分，J11-8菌株鑒定可鑒定24種揮發(fā)性成分，兩者揮發(fā)性化學(xué)成分及相對(duì)百分含量具有明顯差異.因此，HS-SPME-GC-MS可用于區(qū)分野生型真菌和突變真菌在代謝組學(xué)上的差異，在真菌的種屬鑒定上具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值.

內(nèi)生真菌；紫杉醇；頂空固相微萃取（HS-SPME）；氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）

目前，隨著研究的深入，在地球上新發(fā)現(xiàn)的真菌的種類比預(yù)想的要多得多，其中，新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生真菌的種類占據(jù)相當(dāng)大的比例.傳統(tǒng)的真菌的分類鑒定方法主要基于形態(tài)學(xué)的觀察和鑒定，形態(tài)學(xué)鑒定的主要依賴于無性孢子和有性孢子，特別是有性孢子及其生殖過程.對(duì)于內(nèi)生真菌來說，在很多情況下，無性孢子和有性孢子的形成需要與植物形成共生關(guān)系，這給鑒定工作造成了困難.目前，基于標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化程度較高的真菌鑒定方法逐步建立，如Biolog微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)［1］和BIOFOSUN系統(tǒng)鑒定［2］方法，但是，這兩種真菌鑒定方法操作復(fù)雜，應(yīng)用范圍有限，且需要專用的儀器設(shè)備，因而，難于推廣應(yīng)用.另一方面，基于DNA條形碼的分子生物學(xué)技術(shù)逐漸成熟，如ITS（Internal transcribed spacer）等條形碼技術(shù)成為鑒定真菌的可靠方法［3-5］.目前，在GeneBank和EMBL數(shù)據(jù)庫登記的真菌條形碼序列呈現(xiàn)出快速增長，在真菌的鑒定中發(fā)揮了重要作用，成為真菌分子鑒定的主要方法.

隨著現(xiàn)代高精度分析化學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，在生物學(xué)領(lǐng)域展示了越來越廣的應(yīng)用前景.基于代謝組學(xué)基礎(chǔ)上的對(duì)真菌的蛋白質(zhì)，次生代謝產(chǎn)物和揮發(fā)性物質(zhì)的微生物菌種鑒定方法成為可能，如基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）［6-9］，氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）［10，11］.在本研究中，筆者分離獲得一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌J11［12，13］并通過誘變育種，獲得產(chǎn)紫杉醇的高產(chǎn)菌株J11-8［14］.本文通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析鑒定了揮發(fā)性成分，結(jié)果表明，兩個(gè)菌株的揮發(fā)性組及相對(duì)含量具有顯著差異，這些結(jié)果可作為識(shí)別兩個(gè)菌株“身份”的“指紋圖譜”.該方法在真菌的菌種鑒定上可能具有應(yīng)用前景.

1 材料與方法

1.1 材料

產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌J11菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離獲得，經(jīng)形態(tài)和分子鑒定為葡萄座腔菌屬真菌［11，12］.J11-8菌株為J11菌株的突變株，紫杉醇產(chǎn)量可達(dá)1024.2μg/L［13］.

QP-2010-Plus型氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本島津公司）；手動(dòng)頂空固相微萃取裝置（德國IKA公司）；65 μm PDMS/ DVB統(tǒng)領(lǐng)取纖維頭（美國Supelco公司）；Rtx-5MS色譜柱（美國安捷倫公司）.

1.2 HS-SPME法

J11和J11-8菌株培養(yǎng)于含PDA固體培養(yǎng)基的100 mL頂空瓶中15 d，用于固相微萃取.使用手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器及萃取頭進(jìn)行吸附.萃取頭在使用前在氣相色譜進(jìn)樣口老化2 h，老化溫度為250℃.將老化的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，室溫下吸附30 min.吸附完成后插入GC樣口進(jìn)行解吸附.

1.3 GC-MS分析條件

升溫程序如下：起始溫度40℃，保留2 min，以4℃/min升溫到220℃，再以15℃/min升溫到250℃，保留2 min.進(jìn)樣口溫度250℃，連接口溫度280℃，解吸附5 min.載氣為高濃度He（99.99%），不分流進(jìn)樣，流速為1 mL/min.質(zhì)譜條件：連接口溫度280℃，電離方式EI，離子源溫度為230℃，四級(jí)桿溫度150℃；電子能量70 eV，Scan模式全程掃描.樣品經(jīng)過氣相色譜進(jìn)樣分離后，形成不同色譜峰.

2 結(jié)果與分析

采用GC-MS計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀分析J11菌株和J11-8菌株的化學(xué)組成，經(jīng)NIST/WILEY檢索及面積歸一化計(jì)算，分別確定2個(gè)菌株的揮發(fā)性化學(xué)組分.J11菌株的GC-MS總離子流圖見圖1，揮發(fā)性化學(xué)組分見表1，J11-8菌株的總離子流圖見圖2，揮發(fā)性化學(xué)組分見表2.

圖1 J11菌株的GS-MS分析揮發(fā)性化學(xué)成分的總離子流圖

表1 J11檢測結(jié)果

圖2 J11-8菌株的GC-MS分析揮發(fā)性化學(xué)成分的部離子流圖

表2 J11-8

通過比較表1和表2，發(fā)現(xiàn)在野生型J11菌株的19個(gè)揮發(fā)性化學(xué)組分與其突變株J11-8的24個(gè)揮發(fā)性化學(xué)組分中，僅有3個(gè)組分相同，即二甲基硅烷二醇，檸檬油精和十二甲基環(huán)己硅氧烷，且其相對(duì)含量差異較大.在野生型菌株J11中，主要揮發(fā)性化學(xué)成分除了二甲基硅烷二醇（6.24%），檸檬油精（9.46）和十二甲基環(huán)己硅氧烷（31.26%）外，還包括十四甲基環(huán)庚硅氧烷（20.84%），十六甲基環(huán)辛硅氧烷（12.87%）以及對(duì)-乙?；?鄰-［（三甲基硅烷基）乙炔基］苯酚（9.73%），但在突變菌株中，除了二甲基硅烷二醇（19.71%）含量顯著增加外，檸檬油精（1.33%）和十二甲基環(huán)己硅氧烷（0.60%）的含量顯著降低，但是，乙醇（22.37%）和丙烷（13.78%）顯著升高，此外，碳酸氫銨，氨基甲酸銨，1-碘-3-甲基-2-戊酮，三甲基丁醇等組分也顯著升高.

3 討論

通過頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析野生型J11菌株和突變菌株J11-8的揮發(fā)性化學(xué)成分，可以看出兩者具有顯著差異，這說明野生型菌株和突變型菌株在代謝途徑上具有明顯不同的特性，可用于區(qū)分野生型和突變型菌株，是菌種或菌株“亞型”的“身份標(biāo)簽”和“指紋圖譜”.另一方面，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，由于野生型菌株和突變菌株在代謝組學(xué)上的差異程度顯然超過了DNA序列的差異程度，因而，該方法是否可用于真菌的菌種鑒定一直存在疑問.事實(shí)上，同一個(gè)菌株在不同培養(yǎng)基，不同培養(yǎng)條件以及不同的培養(yǎng)時(shí)間，通過該方法分析獲得的代謝“指紋圖譜”也可能存在顯著差異.因此，目前，在通過與DNA條形碼序列比較，獲得大量詳實(shí)和可靠的數(shù)據(jù)，以及在提出一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化方案以前，通過該方法鑒定菌株可能是一個(gè)有爭議的問題.雖然如此，該方法作為鑒別野生型菌株和突變型菌株的“指紋圖譜”還是可靠的.

相對(duì)于同時(shí)蒸餾萃?。⊿DE-GC-MS），HS-SPMEGC-MS操作更簡單.同時(shí)，相對(duì)于DNA條形碼ITS所進(jìn)行的菌種鑒定，利用HS-SPME-GC-MS進(jìn)行菌種鑒定，節(jié)省了大量的操作步驟，且操作簡單.如果能夠與ITS等條形碼比較，證明HS-SPME-GC-MS在鑒定菌種具有可靠性，以及建立標(biāo)準(zhǔn)化的方法，利用HS-SPMEGC-MS鑒定菌種為時(shí)不遠(yuǎn)，應(yīng)該具有廣闊的應(yīng)用前景.目前，利用MALDI-TOF-MS鑒定真菌有較多研究報(bào)道［15，16］，但是，該方法需要提取真菌的全部蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)是否提取完全，以及蛋白質(zhì)提取方法等將影響鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性.從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果來看，通過HSSPME-GC-MS所獲得的真菌揮發(fā)性化學(xué)組分較少，這將是影響其在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用前景方面的主要障礙.因此，通過分析GC-MS分析真菌提取物中的小分子天然化合物有助于鑒別和鑒定真菌.

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【責(zé)任編輯：吳躍新】

Identification of Paclitaxel-producing Wild-type Entophyte fungus J11 and Its Mutant Strain J11-8 by HS-SPME-GC-MS

DAI Huang-yi1，2，LIU Ming-zhi2*，LV Zhen-cheng2

（1.College of Life Science，Southwest Forestry University，Kunming 650224，Yunnan China；2.School of Life Science，Huizhou University，Huizhou 516007，Guangdong China）

The volatile components of paclitaxel-producing wild-type endophyte fungus J11 and its mutant strain J11-8 were analyzed by headspace solid-phase microextraction gas chromatography-mass spectrometry（HS-SPME-GC-MS）.Results showed that nineteen compounds in the J11 and twenty-four compounds in J11-8 were identified.The volatile components and their relative percentages in both strains had significant differences.The difference on metabolomics for wild-type fungus and mutant fungus could be distinguished by HS-SPME-GC-MS.The HS-SPME-GC-MS has an important theoretical and practical values on identification for fungus’s species and genus.

endophytic fungus；paclitaxel；headspace-solid-phase microextraction（HS-SPME）；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

R965.1

A

1671-5934（2016）06-0045-05

2016-10-15

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B060400026）

戴黃益（1991-），女，廣東龍川人，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿蛹?xì)胞生物學(xué).

＊通訊作者：劉明志，教授，Email：tlmz63@163.com.