黃飛飛， 常平安

(重慶郵電大學，重慶 400065)

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家蠶LPH基因的生物信息學分析及表達模式研究

黃飛飛， 常平安

(重慶郵電大學，重慶 400065)

摘要[目的]對家蠶LPH基因進行系統(tǒng)的分析。 [方法]以家蠶基因組數據和EST數據為基礎，用比較基因組學方法從基因組層次系統(tǒng)地鑒定家蠶LPH基因，對基因的結構、染色體分布、基因進化以及與其他模式昆蟲的LPH基因進行比較分析，并利用基因芯片數據對LPH基因在家蠶5齡3 d組織中的表達情況進行研究。 [結果]家蠶LPH是一個基因家族，包含19個直向同源基因，分布于6條染色體上，系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明它們主要分成二大類群；基因芯片數據分析表明家蠶LPH基因具有不同的表達模式，推測可能具有不同的功能，其中絕大部分基因在中腸組織中有表達，推測其可能參與黃酮類物質在家蠶體內的轉運途徑。[結論]該研究為家蠶LPH自身功能的研究提供分子基礎，更重要的是為研究其他昆蟲的LPH基因提供參考。

關鍵詞乳糖酶-根皮苷水解酶；生物信息學；表達模式；功能分析

Bioinformatics Analysis and Expression Study of SilkwormLPHsGene

HUANG Fei-fei,CHANG Ping-an (Chongqing University of Posts and Telecommunications,Chongqing 400065)

Abstract[Objective] To systematically analyze the silkwormLPHgene.[Method] Based on silkworm genome sequences and EST data,silkwormLPHgene was identified at genome layer by comparative genomics method.The genetic structure,chromosome distribution,genetic evolution andLPHgene of other model insects were comparatively analyzed.SilkwormLPHgene expression in 3-day-old fifth-larvae tissues was studied by gene chip data.[Result] SilkwormLPHwas a gene family,which contained 19 orthologous genes and was distributed on six chromosomes.Phylogenetic analysis showed that they were mainly divided into two groups.Analysis of gene microarray data indicated that silkwormLPHgene had different expression patterns that might have different functions.But the vast majority of genes were expressed in intestinal tissues,which might participate in the transport pathway of flavonoids in the silkworm.[Conclusion] This research provides molecular basis for the research on silkwormLPHfunction,and offers important references for theLPHof other insects.

Ker wordsLactase-phlorizin hydrolase; Bioinformatics; Expression pattern; Function analysis

乳糖酶-根皮苷水解酶(lactase-phlorizin hydrolase,LPH)是一種存在于腸上皮細胞微絨膜上的糖蛋白，具有乳糖酶和根皮苷水解酶活性，在碳水化合物的消化中起重要作用。關于LPH的研究，在哺乳動物中研究較深入。編碼人類LPH基因位于第2號常染色體上[1]，由1 927個氨基酸組成[2-3]。人類中LPH主要表現為2種類型，一種類型為持續(xù)高活性，另一種類型則為非持續(xù)高活性。后一種表型的人由于其LPH表達水平低，不能將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，未被消化的乳糖在小腸內堆積，并被腸道細菌發(fā)酵而引起惡心、嘔吐、腹脹、腹痛和腹瀉等一系列癥狀，稱為乳糖不耐受癥，這是臨床上最常見的胃腸病癥之一[4-6]。這種LPH的非持續(xù)高活性表型自從被發(fā)現以來一直受到研究者的普遍關注，并在其他哺乳動物如鼠、兔、豬等中也開展了相關研究[7-8]。此外有研究指出哺乳動物LPH可參與水解黃酮苷類化合物[9]。與哺乳動物相比，關于昆蟲LPH的研究很少。筆者前期從家蠶(Bombyxmori)基因組中成功鑒定了一個LPH基因，命名為BmLPH014192[10]。筆者以家蠶基因組序列和大規(guī)模EST數據為基礎，用比較基因組學方法從基因組層次系統(tǒng)地鑒定了家蠶LPH基因，并對基因的結構、染色體分布、進化以及與其他模式昆蟲的LPH基因進行了比較。該研究不僅為家蠶LPH自身功能的研究提供分子基礎，更重要的是為研究其他昆蟲的LPH基因提供參考。

1材料與方法

1.1數據庫和基因組序列采用的家蠶基因組數據庫(http://silkworm.swu.edu.cn/silkdb/)是由中日雙方合作測序、組裝和注釋的9倍覆蓋度的全基因組數據。家蠶全基因組oligo芯片數據來源于http://silkworm.swu.edu.cn/。果蠅(Drosophilamelanogaster)、按蚊(Anophelesgambiae)和蜜蜂(Apismellifera)的編碼基因序列下載自flybase homopage，Ensemble (AgamP 3.45) and BeeBase (release 2)。

1.2工具軟件信號肽預測 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；跨膜區(qū)預測 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)；預測基因的外顯子、內含子結構采用Sim 4(http://pbil.univ-lyon1.fr/sim4.php)；Blast、Clustal X 1.83、Bioedit、MEGA 4.0、PAUP 4.0和PHYLIP。

1.3家蠶LPHs基因的鑒定從GenBank數據庫中下載人類、老鼠、兔子LPH基因的蛋白質序列，以這些已知的LPH序列為檢索序列(query)與預測的家蠶蛋白質數據庫進行BLASTP比對，同時與家蠶9倍基因組數據庫作TBLASTN檢索[11]，根據比對結果收集E值較高的候選基因。采用SMART軟件預測這些候選基因編碼蛋白質序列的功能域。果蠅、按蚊和蜜蜂的LPH基因也是按照相同的方法進行鑒定。

1.4系統(tǒng)發(fā)生樹的構建進化樹采用家蠶、果蠅、按蚊和蜜蜂4個物種LPH基因的功能域序列構建，將LPH的功能域蛋白質序列用ClustalX[12]進行多序列聯配。進化樹主要采用MEGA4.0[13]軟件中的鄰近方法[14]構建，1 000次抽樣分析。通過構建進化樹推測家蠶LPH基因可能的進化。

1.5EST與芯片數據分析以預測的LPH基因蛋白質序列與家蠶EST數據庫進行BLASTN比對，比對結果中序列一致性大于95%且E值小于1e-20的EST作為該基因的表達序列標簽。

利用家蠶基因芯片數據分析LPH基因在家蠶5齡3d組織(精巢、卵巢、脂肪體、中腸、頭、血液、馬氏管、體壁、絲腺)中的轉錄情況。

2結果與分析

2.1家蠶LPH基因的鑒定從美國國立生物技術信息中心NCBI網站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載人類、老鼠和兔子的LPH基因序列,與家蠶基因組數據庫進行同源性比對。經過比對分析，最終從家蠶基因組中鑒別出19個LPH基因，基因的性質及其探針號見表1。功能域分析表明這些基因都具有名稱為Glyco-hydro-1的結構域，屬于水解酶1超家族。分別從果蠅、按蚊和蜜蜂基因組中鑒別出1、6和1個LPH基因。與果蠅、按蚊、蜜蜂基因組相比，家蠶基因組具有更多的LPH基因。對家蠶所有鑒定的LPH基因進行跨膜區(qū)分析，結果表明家蠶所有LPH基因均無跨膜區(qū)域。

表1　家蠶LPH基因

2.2家蠶LPH基因家族的系統(tǒng)發(fā)生分析圖1表明，4個物種27個LPH基因主要分成三大類群，將其命名為I~Ⅲ群。I群只包含家蠶的8個LPH基因，這些基因均位于家蠶20號染色體上，并在染色體上呈串聯重復排列。II群只包含家蠶的7個LPH基因，這些基因分別位于4條不同的染色體上。其中BmLPH010536和BmLPH010537基因位于12號染色體；BmLPH010812、BmLPH010811和BmLPH010735基因位于26號染色體；BmLPH014178和BmLPH005602基因分別位于20號和17號染色體。Ⅲ群是同屬雙翅目昆蟲的按蚊和果蠅的LPH基因聚在一起，包含果蠅的1個LPH基因和按蚊的6個LPH基因。家蠶的BmLPH003512、BmLPH002660和BmLPH002540基因，蜜蜂的Am18896-PA基因以及按蚊的Ag000481-PA基因均單獨成一分支，均沒有與上述三大類群聚在一起。

圖1　家蠶、果蠅、按蚊、蜜蜂LPH構建的進化樹Fig.1　Phylogentic tree of LPH in B.mori,D.Melanogaster,A.Gambiae and A.mellifera

與果蠅1個LPH基因、按蚊6個LPH基因和蜜蜂1個LPH基因相比，家蠶19個LPH基因數目明顯增多。I群和II群是家蠶LPH特有的類群，共有15個LPH基因；Ⅲ群是雙翅目昆蟲所特有的類群，只包含果蠅和按蚊的LPH基因。在Ⅲ群里，果蠅的CG9701-PA和按蚊的Ag006425-PA可能是直系同源基因，節(jié)點處具有較高的自展值為100%。在II群中，BmLPH010536 和BmLPH010537在12號染色體上串聯重復，BmLPH010812和BmLPH010811在26號染色體上串聯重復，因此它們可能是通過位點復制而產生的。這些相似的現象也存在于I群中。家蠶的LPH基因主要分成兩大類群I群和II群，沒有與其他昆蟲的LPH基因聚在一起，是家蠶所特有的類群，每個群上的LPH基因都表現出較高的序列相似性，表明該家族在基因進化過程中發(fā)生了基因重復事件。家蠶基因組中的大部分LPH基因可能經歷了種族特異性的膨脹。

2.3家蠶LPH基因家族在基因組上的分布LPH基因常呈簇分布于基因組中。已鑒別的家蠶19個LPH基因位于6條染色體上。不同染色體上LPH基因數目從1~9個不等，位于相同染色體上的LPH基因表現出較高的序列相似性。20號染色體上共具有9個LPH基因，是主要的一大類群；此外5號和26號染色體都包含3個LPH基因，12號染色體包含2個基因；而9號和17號染色體均只包含1個基因。家蠶LPH基因家族存在基因轉座現象，如有些位于相同染色體上的基因卻分布在不同的分支上，這可能是基因轉座產生的。基因BmLPH014178雖然位于20號染色體上，但其并沒有與位于該染色體的其他LPH基因聚在一起。BmLPH005602與BmLPH010811和BmLPH005602聚在一起，但它們卻位于不同的染色體上。BmLPH014178、BmLPH010536和BmLPH010537基因亦是如此。

2.4家蠶LPH基因在家蠶5齡3 d幼蟲組織中的表達情況

2.4.1基于EST數據的表達分析。EST數據分析表明，家蠶LPH基因中有13個基因具有EST證據。家蠶LPH基因主要在某些組織中具有轉錄活性，包括中腸、絲腺、馬氏管等。不同群的LPH基因，組織分布存在差異；而且位于相同群的LPH基因，組織表達情況也不同。

2.4.2基于芯片數據的表達分析。由家蠶5齡3 d的各個組織(包括精巢、頭、卵巢、脂肪體、體壁、馬氏管、血液、絲腺和中腸)組成家蠶全基因組的組織表達譜芯片。芯片數據分析表明，19個家蠶LPH基因中有18個基因有探針序列。將這18個LPH基因的不同組織芯片數據構建了聚類圖。由圖2可知，絕大多數基因具有不同的表達模式，其中16個基因在中腸組織中具有轉錄活性；BmLPH014178、BmLPH014190、BmLP002660等基因在家蠶組織中廣泛表達；BmLPH010735、BmLPH010536、BmLPH010537、BmLPH002450、BmLPH014192、BmLPH014188呈組織特異性表達模式，只在中腸組織中有表達；BmLPH014148只在馬氏管中有表達，而其他基因在某幾個特定的組織中有表達。

注：紅色代表陽性；黑色代表0；綠色代表陰性Note: Red color represented positive; black color represented zero; and green color represented negative.圖2　芯片數據分析家蠶LPH基因在5齡3 d幼蟲組織中的表達水平Fig.2　Expression levels of silkworm LPH genes in different tissues of three-day-old fifth-larvae tissues by microarray analysis

3結論與討論

3.1家蠶LPH基因的數目 利用已組裝的家蠶全基因組數據，通過生物學信息分析，在家蠶基因組中共鑒定出19個乳糖酶-根皮苷水解酶基因(LPH)。家蠶與果蠅(1個LPH)、按蚊(6個LPH)、蜜蜂(1個LPH)等其他昆蟲相比，具有更多的LPH基因。

研究表明，哺乳動物LPH除參與乳糖水解作用外，還可參與水解黃酮苷類化合物。黃酮苷類的分子質量較大，其水溶性和脂溶性較差，很難靠被動擴散透過小腸上皮細胞。因此，黃酮苷類需要先被腸細胞存在的酶代謝成為苷元才能被吸收，而LPH就參與此種代謝[9]。與果蠅、按蚊、蜜蜂等昆蟲相比，家蠶的唯一取食植物——桑葉含有較多的黃酮類化合物，家蠶LPH基因數目發(fā)生了膨脹且產生了家蠶特有的LPH基因，可能與桑葉中的黃酮類物質在家蠶體內的轉運有關。推測，為了更好地吸收桑葉中的黃酮苷類物質，極有可能家蠶LPH基因數目發(fā)生了膨脹。

3.2家蠶LPH基因的結構迄今為止，研究最多的是哺乳動物LPH基因，研究表明哺乳動物LPH僅在小腸細胞中表達，在小腸的起始——空腸中段的含量最豐富，向兩端降低，使得回腸末段和十二指腸近段的表達活性最低[15]。人LPH基因由1 927個氨基酸組成，成熟型LPH嵌入小腸微絨毛中，酶蛋白的羧基端有一個跨膜結構域使之可在小腸刷狀緣形成二聚體，成為有活性的LPH[16]。通過對下載的兔、鼠LPH的結構分析表明，其蛋白羧基端都存在跨膜區(qū)域，而該研究對鑒別的家蠶LPH基因分析表明其不存在跨膜區(qū)域，推測其活性作用的方式可能與哺乳動物有所不同。

所鑒別的家蠶19個LPH基因分布于6條染色體上，系統(tǒng)發(fā)生樹分析表明這些基因主要分為二大類群。每個群上的基因都表現出較高的序列相似性，表明在這個家族進化過程中發(fā)生了幾個基因的重復事件。這些重復事件包括串聯事件，重復的拷貝相互之間臨近；此外還包括轉座事件，一個拷貝通過轉座位于其他不同的染色體上。2種類型的重復事件在基因BmLPH010536、BmLPH005602中可以看到。

3.3家蠶LPH基因的功能家蠶幼蟲5齡3 d的組織芯片數據分析表明，家蠶LPH基因表現出不同的表達模式，表明這些基因可能具有不同的功能。絕大部分家蠶LPH基因在中腸組織有表達，這與LPH的基本功能一致，表明LPH極有可能參與黃酮類化合物在家蠶體內的代謝。

家蠶幼蟲從它們唯一的寄主植物——桑葉中攝取黃酮類化合物，部分黃酮類化合物轉運到生成的繭中，但從桑葉中分離到的黃酮類物質與從家蠶繭層中分離到的黃酮類物質在結構上不同。桑葉中的黃酮苷類物質主要是3-O-糖苷，蠶繭中的黃酮苷類物質主要是5-O-糖苷[17]。鑒于LPH參與哺乳動物體內黃酮類物質的轉運，推測在家蠶中，首先是位于中腸上皮的LPH將黃酮苷類物質水解成分子量較小的苷元便于中腸的吸收，后被位于中腸、血液或絲腺中的尿苷二磷酸-糖基轉移酶(UGT)所催化[18]，從而生成家蠶體內特有的黃酮苷類物質。因此在中腸中高表達或特異表達的LPH基因如BmLPH010735、BmLPH010536、BmLPH010537等可能對家蠶從桑葉中更好地吸收黃酮類化合物起重要作用。此外，BmLPH014192基因已證明在綠色繭品種和白色繭品種的幼蟲中腸組織中出現序列選擇性剪接[10]，也間接表明LPH很有可能參與蠶體內黃酮類化合物的轉運機制。

家蠶LPH基因除在中腸表達外，在其他組織也有表達。BmLPH014178 基因在家蠶5齡3 d的各個組織中都有表達，表明該基因可能在家蠶發(fā)育過程中起到看家基因的作用。此外個別基因在精巢、卵巢、頭、脂肪體、體壁、馬氏管和絲腺中有表達，而在這些組織中表達的基因所起的作用尚不清楚，需進一步研究。

總之，家蠶19個LPH基因表達模式多樣，表明可能擔負的功能不同。對家蠶LPH基因的生物信息學分析及其表達模式的研究可為以后LPH基因的研究提供重要參考。

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收稿日期2015-12-30

作者簡介黃飛飛(1980- )，女，山東即墨人，講師，博士，從事生物化學與分子生物學方面的研究。

基金項目重慶市自然科學基金項目(cstc2013jcyjA10005；KJ1400424)。

中圖分類號S 188+.1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-111-04