周莉質(zhì)，宗 凱，呂俠影，余曉峰*，姚 劍

(1.安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局，安徽合肥 230022；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥 230036)

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蜂蜜蛋白提取以及雙向電泳技術(shù)分析蜂蜜蛋白條件優(yōu)化

周莉質(zhì)1，2，宗 凱1，呂俠影1，余曉峰1*，姚 劍1

(1.安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局，安徽合肥 230022；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽合肥 230036)

摘要[目的]研究蜂蜜中蛋白質(zhì)提取的有效方法，優(yōu)化蜂蜜蛋白電泳條件。[方法]該試驗(yàn)使用丙酮、鎢酸鈉、硫酸銨、尿素-硫脲4種方法提取蜂蜜中的蛋白并進(jìn)行比較，然后進(jìn)行雙向電泳分析，對(duì)影響雙向蛋白電泳的IPG膠條的選擇、蛋白質(zhì)上樣量、等電聚焦時(shí)間等主要因素進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，采用硫脲法提取蜂蜜蛋白獲得的蛋白含量最高，硫脲法和丙酮沉淀法獲得的蛋白純度最好，而硫脲法因干擾物質(zhì)較少、易于裂解適于雙向電泳技術(shù)，采用硫脲法提取的蜂蜜蛋白選擇IPG膠條pH 5~8，蛋白上樣量為150 μg，等電聚焦時(shí)間達(dá)到32 000 V·h的情況下能充分地聚焦，獲得的雙向電泳圖譜最佳，優(yōu)化后的洋槐蜜雙向電泳圖譜上可檢測到326個(gè)蛋白點(diǎn)，重復(fù)性和分辨率均較好。[結(jié)論]蜂蜜類含糖樣品中使用硫脲法提取蛋白能減少糖類物質(zhì)干擾。

關(guān)鍵詞蜂蜜蛋白；雙向電泳；蛋白提取

Extraction of Protein from Honey and Its Optimization by Two-dimensional Electrophoresis

ZHOU Li-zhi1,2, ZONG Kai1, LYU Xia-ying1, YU Xiao-feng1*et al(1. Anhui Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Hefei, Anhui 230022; 2.Anhui Agricultural University, Hefei, Anhui 230036)

Abstract[Objective] To research a effective method for protein extraction from honey, and to optimize the protein electrophoresis conditions of honey. [Method] Protein was extracted from honey by acetone, sodium tungstate, ammonium sulfate and urea-thiourea. Their results were compared and two-dimensional electrophoresis was analyzed. [Result] Protein content was the maximum by thiourea method; protein purity was the highest in thiourea method and acetone precipitation method. Since thiourea method had few interfering substances, and was suitable for two-dimensional electrophoresis technology, we selected thiourea method to extract protein. The IPG adhesive tape was pH 5-8; loading quantity of protein was 150 μg; isoelectric focusing time was 32 000V h. Under these conditions, the optimal two-dimensional electrophoretogram was obtained. A total of 326 protein spots were detected with relatively good repeatability and resolution. [Conclusion] Extracting protein from honey by thiourea method reduces the interference of glucose.

Key wordsHoney protein; Two-dimensional electrophoresis; Protein extraction

蜂蜜是由糖、花粉、蛋白和氨基酸以及少量維生素、礦物質(zhì)組成的天然食品，是由蜜蜂采集花蜜釀造而成。蜂蜜蛋白是蜂蜜中重要的組成部分，含量一般為0~10 mg/g，主要來自蜜蜂和花粉。目前，從蜂蜜中提取蜂蜜蛋白主要有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀等。葉云等按照85%的硫酸銨飽和度加入硫酸銨并水處理沉淀蜂蜜蛋白[1]，胡慶銀等采用0.335 mol/L硫酸和10%鎢酸鈉沉淀蜂蜜中蛋白[2]，Won S R等采用透析過夜再超濾離心濃縮獲得分泌蛋白用于后續(xù)電泳分析和質(zhì)譜鑒定[3]。筆者擬比較4種不同的蛋白提取方法對(duì)蜂蜜中蛋白提取含量的影響，選擇提取含量相對(duì)較高，且適合用于后續(xù)電泳的蜂蜜蛋白提取方法。

雙向電泳技術(shù)是分析蛋白組學(xué)的經(jīng)典方法，優(yōu)化蜂蜜蛋白電泳條件對(duì)于蜂蜜蛋白種類鑒定是十分必要的。清晰的可重復(fù)的2-DE電泳圖是對(duì)蜂蜜蛋白鑒定的必要條件。筆者主要比較了幾種提取蜂蜜蛋白的方法，選擇合適2-DE的電泳條件，包括IPG膠條的選擇、蛋白質(zhì)上樣量、等電聚焦時(shí)間等，以期獲得分辨率高、質(zhì)量好的2-DE圖。

1材料與方法

1.1材料試驗(yàn)所用蜂蜜為原蜜，未加工，由阜陽市百合食品有限公司提供，分別編號(hào)為5號(hào)墨西哥尤卡坦蜜、9號(hào)新西蘭麥奴卡蜜、58號(hào)中國油菜蜜。

蛋白電泳系統(tǒng)為美國伯樂BIO-RAD公司產(chǎn)品：Mini-PROTEAN3垂直電泳系統(tǒng)、等點(diǎn)聚焦電泳儀。

1.2蜂蜜總蛋白提取方法比較

1.2.1TCA丙酮法。稱取5 g蜂蜜入 40 mL 離心管中，加入5 mL超純水溶解蜂蜜之后加入 30 mL 預(yù)冷的三氯乙酸(TCA)丙酮溶液(TCA∶丙酮=1∶9)，混勻，-20 ℃ 沉淀過夜，離心棄上清。加入20 mL預(yù)冷的丙酮清洗沉淀塊(重復(fù)1次)，放入通風(fēng)櫥風(fēng)干。稱取約20 mg沉淀粉末，加入1 mL上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min。超聲破碎(80 W，超聲10 s，間歇15 s，共10次)，沸水浴5 min，離心取上清。

1.2.2鎢酸鈉沉淀法。取蜂蜜5 mL 放入40 mL的離心管，往離心管中加入 10 mL超純水，搖勻。向離心管中分別加入5 mL 10%的鎢酸鈉溶液和5 mL 0.335 mol/L硫酸溶液，迅速混勻，放在80 ℃水浴中加熱30 min。在加熱過程中每隔5~10 min旋轉(zhuǎn)并混合離心管中內(nèi)容物20 s，會(huì)有絮狀沉淀析出。用超純水注滿離心管并混合后，在1 500 r/min下離心5 min，傾掉上層清液，再以約 5 mL 水充分洗滌沉淀物并離心，如此反復(fù)洗滌沉淀物5 次，最后倒干上清液，沉淀即為所得蜂蜜的蛋白質(zhì)樣品。向蛋白質(zhì)樣品中加入超純水 60 μL，充分混勻溶解。將所得蛋白樣品 1 000 r/min離心2 min，取上清液作為待測樣品。

1.2.3硫酸銨鹽析法。將蜂蜜與0.01 mol/L pH 8.0的Tris緩沖液按1∶4的比例混合均勻，按85%的硫酸銨飽和度加入硫酸銨，攪拌使硫酸銨溶解，在冰水中放置8 h左右，離心(12 000 r/min，10 min)，棄上清液，再用一定量的0.01 mol/L pH 8.0的Tris緩沖液溶解沉淀，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4尿素-硫脲法。稱取5 g蜂蜜，加入5 mL提取液(5 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，10% SDS，2 g/L DTT)，常溫下振蕩1.5 h，12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，上清加入3倍體積丙酮，-20 ℃過夜。離心后收集沉淀，沉淀加入100 μL裂解液裂解備用。

1.3蜂蜜總蛋白含量的測定上述方法提取的蜂蜜總蛋白采用BCA法測定蛋白濃度。

1.4蜂蜜蛋白2-DE條件優(yōu)化

1.4.1第一向IEF等電聚焦IPG膠條的選擇。以洋槐蜜為研究對(duì)象，采用Bio-Rad IEF等電聚焦系統(tǒng)，7 cm IPG預(yù)制膠條選擇pH 3～10、5～8、4～7范圍的膠條進(jìn)行優(yōu)化。

1.4.2蛋白質(zhì)上樣量優(yōu)化。每根膠條加135 μL水化上樣緩沖液，蛋白質(zhì)上樣量根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別調(diào)整為50、150、250 μg，采用被動(dòng)水化，放置4 ℃冰箱15~18 h。

1.4.3等電聚焦參數(shù)的設(shè)置。表1為等電聚焦參數(shù)設(shè)置情況。聚焦時(shí)間根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別調(diào)整為 20 000、32 000、40 000 V·h，聚焦溫度為20 ℃，每根膠條的限制電流為50 μA。

表1　等電聚焦參數(shù)

2結(jié)果與分析

2.1比較4種蜂蜜蛋白提取方法查找相關(guān)文獻(xiàn)，擬比較4種不同的蛋白提取方法對(duì)蜂蜜中蛋白提取的影響。以5號(hào)墨西哥尤卡坦原蜜和9號(hào)新西蘭麥奴卡原蜜為研究對(duì)象，按照“1.2”中4種蜂蜜蛋白提取方法，比較4種方法提取蜂蜜蛋白效果，結(jié)果見圖1。

注：圖(a)中從左到右依次為marker，5號(hào)硫酸銨鹽析法，9號(hào)硫酸銨鹽析法，5號(hào)TCA-丙酮法，9號(hào)TCA-丙酮法，5號(hào)尿素-硫脲法，9號(hào)尿素-硫脲法，5號(hào)鎢酸鈉法，9號(hào)鎢酸鈉法，marker；圖(b)中從左到右依次為marker，58號(hào)硫酸銨鹽析法，58號(hào)TCA-丙酮法，58號(hào)尿素-硫脲法，58號(hào)鎢酸鈉法。Note：In Fig.(a)，bands from left to right were marker，honey 5 by ammonium sulfate salting out method，honey 9 by ammonium sulfate salting out method，honey 5 by TCA-acetone method，honey 9 by TCA-acetone method，honey 5 by urea - thiourea method，honey 9 by urea - thiourea method，honey 5 by sodium tungstate method，honey 9 by sodium tungstate method, marker. In Fig.(b)，bands from left to right were marker，honey 58 by ammonium sulfate salting out method，honey 58 by TCA- acetone method，honey 58 by urea - thiourea method, honey 58 by sodium tungstate method.圖1　5號(hào)、9號(hào)和58號(hào)原蜜用4種方法提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳銀染圖Fig.1　SDS-PAGE electrophoretogram of protein extracted from honey 5，9 and 58 by four methods

從圖1可以看出，4種蜂蜜蛋白提取方法，均能從蜂蜜樣品中提取蛋白，泳道內(nèi)蛋白條帶染色清晰。從SDS-PAGE電泳銀染結(jié)果看，鹽析法提取的蜂蜜蛋白樣品電泳條整體帶較其他3種淡，表明鹽析法提取蜂蜜蛋白濃度較低；以尿素-硫脲法提取的蜂蜜蛋白樣品電泳條帶染色最深，條帶最清晰；TCA-丙酮法和鎢酸鈉法次之。試驗(yàn)采用非干擾型試劑盒對(duì)5號(hào)、9號(hào)和58號(hào)原蜜3種蜂蜜4種提取方法獲得的蛋白含量進(jìn)行了比較(表2)，結(jié)果得出，試劑盒法測定蛋白的濃度與電泳銀染結(jié)果對(duì)照表明，尿素-硫脲法、TCA丙酮法提取的蜂蜜蛋白濃度較高，電泳分離條帶背景較清晰。

2.2蜂蜜蛋白2-DE條件優(yōu)化

2.2.1第一向IEF等電聚焦IPG膠條的選擇。由圖2可見，pH 3～10能較好地呈現(xiàn)蜂蜜中蛋白分布特征，但是蛋白點(diǎn)過于緊密地分布在凝膠的中間區(qū)域，造成大量蛋白堆積或重疊在一起，未能有效分開，不便于質(zhì)譜分析。pH 4～7能較好地拉開左半部分55 K和72 K大小的蛋白，但是右半部分蛋白等電點(diǎn)超過7不能完整在凝膠上呈現(xiàn)。pH 5～8能完整地呈現(xiàn)右半部分蛋白，能將同一分子量的蛋白在不同等電點(diǎn)上拉開。通過PDQuest軟件對(duì)pH 3～10、5～8、4～7的3張凝膠圖進(jìn)行蛋白點(diǎn)提取，分別提取到148、312、294個(gè)蛋白點(diǎn)，比較之下pH 5～8獲得的蛋白點(diǎn)較多，pH 3～10圖譜相對(duì)較完整地分離蜂蜜蛋白點(diǎn)。

表25號(hào)、9號(hào)和58號(hào)原蜜用4種方法提取蛋白含量測定

Table 2 Protein content detection in honey 5，9 and 58 by four methods

序號(hào)Honeynumber蜂蜜產(chǎn)地與品種Productionareaandcultivarofhoney提取方法Extractionmethod蛋白濃度Proteinconcentrationmg/g5號(hào)墨西哥尤卡坦蜜硫酸銨鹽析法1.94TCA-丙酮法3.02尿素-硫脲法3.22鎢酸鈉法1.989號(hào)新西蘭嘜奴卡蜜硫酸銨鹽析法2.14TCA-丙酮法3.06尿素-硫脲法4.98鎢酸鈉法5.1058號(hào)中國洋槐蜜硫酸銨鹽析法0.919TCA-丙酮法3.898尿素-硫脲法7.609鎢酸鈉法1.319

圖2　58號(hào)洋槐蜜選用不同pH范圍IPG膠條2-DE電泳結(jié)果Fig.2　Two-dimensional electrophoresis of IPG adhesive tapes of honey 58 in different pH ranges

2.2.2蛋白質(zhì)上樣量。試驗(yàn)采用7 cm pH 5～8 IPG預(yù)制膠條，所得圖譜經(jīng)PDQuest軟件分析。選擇合適的上樣量對(duì)獲得清晰的雙向凝膠電泳圖譜十分重要，蛋白上樣量過低會(huì)造成低豐度蛋白不能在凝膠上顯現(xiàn)，上樣量過高則會(huì)造成高豐度蛋白濃度過大成片狀或連成線，不能使蛋白以單個(gè)點(diǎn)狀呈現(xiàn)。該試驗(yàn)選擇7 cm的pH 5~8的IPG膠條，考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行染色，當(dāng)上樣量為50 μg時(shí)，通過PDQuest分析，只有130個(gè)蛋白點(diǎn)較清晰，能采用的蛋白點(diǎn)少且模糊。當(dāng)上樣量為150 μg時(shí)，檢測到181個(gè)蛋白點(diǎn)，蛋白點(diǎn)增多。蛋白質(zhì)上樣量為250 μg時(shí)，蛋白點(diǎn)清晰，可在凝膠上檢測到的蛋白點(diǎn)最多，聚焦效果好，分辨率高，圖譜的質(zhì)量最佳。

圖3　58號(hào)洋槐蜜不同上樣量的2-DE電泳結(jié)果Fig.3　Two-dimensional electrophoresis of honey 58 under different loading quantities

2.2.3等電聚焦參數(shù)的設(shè)置。試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)等電聚焦電泳的聚焦時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。聚焦時(shí)間的長短直接影響凝膠中蛋白成像質(zhì)量，聚焦時(shí)間過短容易造成蜂蜜蛋白聚焦不完全、蛋白點(diǎn)成像不規(guī)整等；聚焦時(shí)間過長則有可能造成橫向拖尾，因此選擇合適的聚焦時(shí)間對(duì)獲得清晰、高質(zhì)量的凝膠圖譜十分重要。試驗(yàn)選擇等電聚焦時(shí)間分別設(shè)定為20 000、32 000、40 000 V·h，當(dāng)聚集時(shí)間為20 000 V·h時(shí)，發(fā)現(xiàn)凝膠中100 kD左右蛋白區(qū)域蛋白連成一條很細(xì)的線，不見規(guī)整的蛋白點(diǎn)；當(dāng)聚集時(shí)間為40 000 V·h時(shí)，凝膠中55 kD靠中間區(qū)域以及72 kD附近靠右側(cè)蛋白豐度過高，蛋白點(diǎn)堆積嚴(yán)重，圖像模糊；在32 000 V·h聚焦時(shí)，在凝膠上顯現(xiàn)的蛋白質(zhì)點(diǎn)多且清晰，PDQuest軟件分析檢測到蛋白點(diǎn)數(shù)為326個(gè)。

3結(jié)論與討論

從蜂蜜中提取蛋白是分析蜂蜜蛋白的第一步，能否有效地從蜂蜜樣品中盡可能多地獲得較高的蜂蜜蛋白含量是關(guān)鍵。該研究比較了4種從蜂蜜中提取蛋白的方法，硫酸銨鹽析法是蛋白質(zhì)提取的最常用方法，提取的蛋白進(jìn)行除鹽后可以再次溶解，提取過程中蛋白未變性處理，適用于蛋白活性研究，但是鹽析法提取蛋白的濃度較低。鎢酸鈉法雖然提取蛋白含量較高，但是因酸化干擾，SDS-PAGE電泳背景較黑，分離的蛋白條在凝膠上呈現(xiàn)不清晰。丙酮法和尿素-硫脲法提取效果相差不大，尿素-硫脲能夠有效減少糖類與蛋白的結(jié)合，綜合比較，選擇尿素-硫脲法提取蜂蜜蛋白。

目前，分析蜂蜜中蛋白多采用SDS-PAGE電泳，如鄧建軍等采用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)對(duì)蜂蜜的電泳行為進(jìn)行分析，測定不同品種、不同產(chǎn)地的蜂蜜與摻假蜂蜜蛋白質(zhì)含量以及SDS-PAGE電泳行為[4]。但是蜂蜜蛋白主要是由蜜蜂咽下腺分泌的MRJP家族蛋白，分子量主要集中在55~72 kD，屬于蜂蜜中高豐度蛋白家族，SDS-PAGE電泳不能將這些蛋白分離開，因此需要2-DE電泳從分子量和等電點(diǎn)兩向?qū)⑦@些蛋白在凝膠上拉開分離[5]。目前采用2DE電泳多用來分析蜂王漿中蛋白[6-9]，采用2DE電泳對(duì)于蜂蜜中蛋白分析較少，主要是因?yàn)榉涿壑械鞍缀窟h(yuǎn)低于蜂王漿，通常含量只有0.1~10.0 mg/g；其次，蜂蜜含糖量非常高，要將蜂蜜中糖除去很

圖4　58號(hào)洋槐蜜不同聚焦時(shí)間的2-DE電泳結(jié)果Fig.4　Two-dimensional electrophoresis of honey 58 under different focusing times

困難，殘存在蜂蜜蛋白中對(duì)凝膠分析影響大。因此采用合適的蜂蜜蛋白提取純化方式以及合適的2-DE電泳條件對(duì)于獲得高質(zhì)量的2-DE蜂蜜蛋白電泳圖譜至關(guān)重要。該研究選擇IPG膠條的pH、上樣量、聚焦時(shí)間作為優(yōu)化2-DE電泳的主要和關(guān)鍵因素，每塊凝膠重復(fù)3次，結(jié)合PDQuest軟件分析掃描后的凝膠圖像，可以為下一步研究比較不同產(chǎn)地和品種蜂蜜中蛋白2-DE電泳圖譜尋找差異蛋白以及對(duì)2-DE電泳圖譜中蛋白點(diǎn)結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定打下基礎(chǔ)。

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收稿日期2015-12-24

作者簡介周莉質(zhì)(1990-)，女，云南普洱人，碩士研究生，研究方向：植物檢疫。*通訊作者，研究員，碩士，從事微生物研究。

基金項(xiàng)目國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014IK087)。

中圖分類號(hào)S 896.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)03-085-03