許　剛，張云鋒，孟　磊，周章劍，張　昊，宋永春*(.西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，西安 7006；. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院胸外科，西安 7006)

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蔓荊子黃素抑制p53突變型人肺癌細胞生長及其機制研究

許剛1，張云鋒2，孟磊1，周章劍1，張昊1，宋永春1*(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤外科，西安 710061；2. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院胸外2科，西安 710061)

摘要：目的了解蔓荊子黃素對p53突變型人肺癌H322細胞增殖的影響，并對其機制進行初步研究。方法在不同時間點(24，48和72 h)采用MTT法檢測不同濃度(0，0.1，0.2，0.5，1.0 μmol·L-1)蔓荊子黃素對細胞增殖的影響。在不同濃度蔓荊子黃素的作用下，采用Western blot法檢測c-myc基因表達情況。 結(jié)果蔓荊子黃素能抑制H322細胞增殖，且呈劑量和時間依賴性，24，48和72 h的IC50分別為0.577，0.501和0.473 μmol·L-1。不同濃度的蔓荊子黃素在同一時間點、相同濃度的蔓荊子黃素在不同時間點對 H322細胞增殖的抑制作用均存在明顯差異(P<0.05)。c-myc基因表達與蔓荊子黃素的濃度呈反比。 結(jié)論蔓荊子黃素能抑制人肺癌H322細胞的增殖，其機制可能是通過抑制c-myc的表達。

關(guān)鍵詞：蔓荊子黃素；肺癌；增殖；c-myc蛋白

肺癌是全世界發(fā)病率和病死率都位居第1的惡性腫瘤，每年有近160萬患者死于該病[1]。蔓荊子黃素是植物蔓荊子果實的有效成分，是眾多具有抗腫瘤活性的中藥成分之一[2-4]。多項研究顯示， 蔓荊子黃素是一種可以抑制惡性細胞增殖和引起凋亡的多靶向分子[2,5-6]。既往的研究發(fā)現(xiàn)， 蔓荊子黃素對p53突變的乳腺癌Hs578T細胞增殖有抑制作用[7]。目前，蔓荊子黃素對p53突變的人肺癌細胞增殖的影響及其機制仍不清楚，而p53突變也是肺癌對很多化療藥物產(chǎn)生耐藥的一個分子生物學基礎[8-9]。所以研究蔓荊子黃素對p53突變肺癌細胞增殖的影響及其機制有著重要的意義。

1儀器與材料

1.1儀器細胞培養(yǎng)箱，凈化工作臺，倒置熒光顯微鏡，水浴鍋，電轉(zhuǎn)儀，流式細胞儀，LEICA-Q550CW圖像采集與分析系統(tǒng)等。

1.2材料與試劑細胞株(人肺癌H322細胞)由西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心饋贈。蔓荊子黃素購自陜西盺泰生物科技有限公司(質(zhì)量分數(shù)≥98%)。配制：溶解于二甲基亞砜(DMSO)。存儲液的濃度為1 mmol·L-1(0.374 mg·mL-1)，4 ℃下儲存?zhèn)溆谩Ｊ褂们坝煤?.1 mL·L-1胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制備成5種濃度(0，0.1，0.2，0.5和1.0 μmol·L-1)的工作液。噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma公司。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司。BCA蛋白質(zhì)試劑盒購自Pierce公司。一抗：c-myc鼠單抗以及β-actin鼠多抗；二抗：羊抗鼠HRP單抗， 均購自Abcam公司。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)H322細胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含0.1 mL·L-1胎牛血清，100 u·mL-1青霉素，100 u·mL-1鏈霉素)，經(jīng)2.5 mg·L-1胰蛋白酶溶液消化傳代，細胞在37 ℃、飽和濕度、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2細胞增殖實驗(MTT法) 將H322細胞以5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設置3個復孔。24 h后實驗組更換含各種濃度的蔓荊子黃素(0.1，0.2，0.5和1.0 μmol·L-1)的培養(yǎng)基，陰性對照組更換不含蔓荊子黃素的培養(yǎng)基， 分別于24，48和72 h后更換為100 μL培養(yǎng)基和20 μL MTT溶液(5 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4~6 h后，吸除MTT溶液，加入DMSO溶液150 μL/孔，置于搖床振蕩10 min后用酶標儀在490 nm處測吸光度值(A值)。細胞生長率=[實驗組A值/陰性對照A值]×100%。

2.3Western blot檢測使用不同濃度蔓荊子黃素工作液處理細胞72 h后收集細胞，吸去培養(yǎng)基后，加入含蛋白酶抑制劑和去磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液使細胞充分裂解，離心后留取上清液，經(jīng)BCA蛋白質(zhì)試劑盒定量后，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，上樣量均為30 μg，再用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜。PVDF膜經(jīng)蛋白封閉后，4 ℃下一抗孵育過夜；然后加入二抗，常溫下孵育3 h后用ECL化學發(fā)光法配置HRP底物，按照1∶1的比例充分混合1 min后，均勻滴加至膜上，反應1 min后將膜置于ChemiDocTMMP成像系統(tǒng)進行檢測，記錄曝光1~65 s的圖像，選取對比度最明顯的照片進行解讀。

2.4統(tǒng)計學方法應用GraphPad Prism統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)及t檢驗分析各組間的差異是否具有統(tǒng)計學意義，顯著性水平α=0.05。

3結(jié)果

3.1蔓荊子黃素對H322細胞增殖的抑制作用蔓荊子黃素對H322細胞增殖在24，48和72 h有抑制作用，蔓荊子黃素抑制人肺癌H322細胞增殖作用的IC50分別為0.577，0.501和0.473 μmol·L-1。不同濃度蔓荊子黃素在同一時間點對H322細胞增殖的抑制作用與對照組相比均存在明顯差異，見表1。雙因素方差分析(two-way ANOVA)顯示，各組間生長率有顯著性差異(P<0.000 1)。

表1不同濃度蔓荊子黃素對H322細胞增殖的影響

Tab.1 Effects of vitexicarpin on proliferation of H322 cell

±s)

注：*表示與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。3.2蔓荊子黃素對H322細胞增殖影響的比較不同濃度的蔓荊子黃素作用于H322細胞24，48和72 h，均表現(xiàn)出明顯的抗增殖作用，且各組間有統(tǒng)計學差異。在不同濃度的蔓荊子黃素作用下，H322細胞生長均受到抑制，生長率逐漸下降，濃度越大，細胞存活率越低。相同濃度的蔓荊子黃素隨著時間的推移，對細胞生長的抑制力增加，生長率逐漸下降。但其對照組生長率不受影響，見圖1。所以，蔓荊子黃素對人肺癌H322細胞有明顯抑制作用，且呈劑量和時間依賴性。

圖1不同濃度蔓荊子黃素對H322細胞增殖的影響

Fig.1 Effects of vitexicarpin on proliferation of H322 cell

3.3蔓荊子黃素對H322細胞c-myc蛋白表達的影響在蔓荊子黃素作用72 h后，采用Western blot檢測H322細胞c-myc蛋白的表達，結(jié)果顯示，隨著蔓荊子黃素濃度的升高，細胞中c-myc蛋白表達量逐漸降低。 見圖2。

圖2　不同蔓荊子黃素處理H322細胞c-myc蛋白的表達情況

Fig.2 Expression of c-myc protein in H322 cell treated with vitexicarpin

4討論

蔓荊子黃素又叫紫花牡荊素，是一種從中藥蔓荊子中提取的具有廣泛藥理活性的多甲氧基黃酮類化合物，是蔓荊子抗腫瘤的主要活性成分。目前國內(nèi)外對蔓荊子黃素抗腫瘤作用機制研究較少，有研究提示蔓荊子黃素可能通過影響腫瘤細胞有絲分裂的紡錘體形成而導致細胞周期停滯在G2/M期，并誘導凋亡[10-12]。同時它還能誘導p21蛋白表達，抑制 Cdk1活性，阻滯細胞G2/M期過渡[13]。

既往的研究發(fā)現(xiàn)，蔓荊子黃素能使p53突變的乳腺癌Hs578T細胞的增殖能力受到明顯抑制，并抑制c-myc和Bcl-2的表達，促進p21的表達，而且Bcl-2和p21的改變可以被c-myc基因所阻斷[7]。但是，在p53野生型的人乳腺癌MCF-7細胞中并無此現(xiàn)象[7]。這說明同一藥物對不同分子分型的腫瘤細胞有著不同的作用機制，這也是對癌癥進行基因分型研究的重要意義。p53基因突變也是肺癌常見的遺傳改變[14-15]，至今尚未見蔓荊子黃素對p53突變型肺癌細胞的研究報道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)蔓荊子黃素同樣抑制了p53突變型人肺癌H322細胞的增殖，為了進一步研究其抑制增殖作用的機制，我們通過Western blot檢測了不同濃度蔓荊子黃素處理H322細胞的c-myc蛋白表達情況。結(jié)果顯示，隨著蔓荊子黃素濃度的增加，c-myc蛋白的表達下降。c-myc是一種原癌基因，在各種腫瘤細胞中有高表達，并且在腫瘤的增殖、侵襲過程中起著重要作用[16-17]。同時，c-myc的異常表達造成其他癌基因的激活，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。我們推測蔓荊子黃素對H322細胞的增殖抑制作用是通過c-myc發(fā)揮作用的。c-myc是蔓荊子黃素抑制H322細胞增殖機制的重要環(huán)節(jié)，所以我們未來的研究將圍繞蔓荊子黃素通過c-myc抑制肺癌細胞增殖的具體上下游機制來開展，進一步闡明蔓荊子黃素抗腫瘤作用的具體機制，也為p53突變型肺癌的治療提供新的靶點。

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Inhibitory effects of vitexicarpin on mutated p53 lung cancer cell and its mechanism

XU Gang1，ZHANG Yunfeng2，MENG Lei1，ZHOU ZhangJian1， ZHANG Hao1，SONG Yongchun1*(1. Department of Surgical Oncology，the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University， Xi′an 710061，China；2. The 2nd Department of Thoracic Surgery， the First Affiliated Hospital of Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China)

Abstract:ObjectiveTo explore the effect and mechanism of vitexicarpin in H322 cell line，of which p53 gene was mutanted natively. Methods Cells were treated with various concentrations of vitexicarpin(0，0.1，0.2，0.5 and 1.0 μmol·L-1). MTT assays were used to detect cell proliferation, and Western blot assays were used to detect c-myc protein expression at different time points(24，48 and 72 h) with different doses of vitexicarpin. Results Proliferation of H322 cell was inhibited markedly by vitexicarpin，with IC50s was 0.577，0.501 and 0.473 μmol·L-1in different time points(24，48 and 72 h). Cells pretreated with higher concentrations of vitexicarpin expressed less c-myc. Conclusion The suppress mechanism of vitexicarpin for malignant tumour maybe through c-myc in p53 mutated H322 cell.

Key words:vitexicarpin； lung cancer； proliferation； c-myc protein

(收稿日期：2015-10-10)

*通信作者：宋永春，男，博士，主治醫(yī)師

作者簡介：許剛，男，在讀博士研究生，助理研究員

基金項目：陜西省社會發(fā)展科技攻關(guān)項目(編號：2014k11-01-01-22)

中圖分類號：R965

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)02-0161-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.02.015