王沐蘭， 楊生超， 郁步竹， 李唯奇*

( 1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) / 云南省優(yōu)勢中藥材規(guī)范化種植工程研究中心， 昆明 650201；2. 中國科學(xué)院昆明植物研究所 中國西南野生生物種質(zhì)資源庫， 昆明 650201 )

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紅豆杉高產(chǎn)懸浮細胞系建立及其紫杉醇誘導(dǎo)的研究進展

王沐蘭1， 楊生超1， 郁步竹2， 李唯奇2*

( 1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) / 云南省優(yōu)勢中藥材規(guī)范化種植工程研究中心， 昆明 650201；2. 中國科學(xué)院昆明植物研究所 中國西南野生生物種質(zhì)資源庫， 昆明 650201 )

紫杉醇是一種四環(huán)二萜酰胺類化合物，是從紅豆杉科紅豆杉屬植物中提取分離出來的次生代謝物，是世界公認廣譜、活性強的天然抗癌新藥。但直接從植物中提取紫杉醇的傳統(tǒng)生產(chǎn)方式，不僅產(chǎn)量低，且會對野生紅豆杉資源造成嚴重破壞，同時紫杉醇的化學(xué)全合成也由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜而不具備商業(yè)價值。與之相反，細胞培養(yǎng)技術(shù)具有受外界影響少、生產(chǎn)成本低、次生代謝產(chǎn)物多、細胞生長周期短的優(yōu)勢，是目前最具前景的紫杉醇生產(chǎn)方式。近年來隨著科研水平的不斷提升，紫杉醇無論在生理代謝調(diào)控、關(guān)鍵基因挖掘,還是新藥物制劑與劑型及其類似物的開發(fā)和運用等方面,都取得了進展，但要建立紫杉醇商業(yè)化高產(chǎn)體系，還必須和前人的研究經(jīng)驗相結(jié)合。該文對紅豆杉高產(chǎn)懸浮細胞系建立及其紫杉醇誘導(dǎo)的研究進展進行了綜述，主要包括前人對紅豆杉屬植物組織與細胞培養(yǎng)相關(guān)的外植體、培養(yǎng)基、激素、培養(yǎng)條件、褐化等問題的研究，以及從代謝調(diào)節(jié)、培養(yǎng)方式、基因工程等多方面提高紫杉醇含量的最新進展，最后總結(jié)了當前研究的不足，并對今后通過多種組合方式來提高紫杉醇含量的生產(chǎn)途徑進行了展望。以期促進紅豆杉組織培養(yǎng)技術(shù)的進步，為藥用資源保護和利用提供一定的理論基礎(chǔ)與生產(chǎn)指導(dǎo)。

紅豆杉, 抗癌藥物, 細胞培養(yǎng), 懸浮細胞系建立, 紫杉醇誘導(dǎo)

紅豆杉中的紫杉醇是公認的近三十年來發(fā)現(xiàn)的最有效的抗癌藥物之一，它可以穩(wěn)定微管聚集并防止微管正常的生理解聚，“凍結(jié)”有絲分裂的紡錘體，抑制細胞有絲分裂，使細胞活動終止于對放療敏感的G2和M期，直至死亡(Schiff et al,1979)。紫杉醇在紅豆杉植物細胞中含量極低，即使是當前公認含量最高的短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)樹皮中也僅含0.069%(周忠強等,2001)。由于人們不合理的砍伐，樹木數(shù)量銳減，紅豆杉已經(jīng)處于瀕危狀態(tài)。雖然目前可以通過巴卡亭Ⅲ等前體物質(zhì)人工半合成紫杉醇，但是伴隨著如Cabazitaxel(Cheetham & Petrylak,2013)等一系列紫杉醇類新藥的研制，紫杉醇的使用藥譜更廣，市場需求更大。因此，使用細胞培養(yǎng)技術(shù)是提高紫杉醇產(chǎn)量、紫杉醇藥源緊缺的當務(wù)之急。

要建立紫杉醇商業(yè)化高產(chǎn)體系，必須與前人研究經(jīng)驗相結(jié)合，不斷優(yōu)化懸浮體系建立的相關(guān)環(huán)節(jié)，并通過分子生物學(xué)手段探索紫杉醇的合成過程，從細胞水平與分子水平共同促進紫杉醇的生產(chǎn)。隨著基因組學(xué)檢測手段的不斷進步，目前已知的紫杉醇生物合成過程包括19個步驟，紫杉環(huán)碳環(huán)骨架形成、側(cè)鏈生物合成、紫杉烷環(huán)系統(tǒng)和側(cè)鏈酯化反應(yīng)三個階段，其中12個酶測序已經(jīng)完成，但仍有7個步驟依然未知(Cusido et al,2014)。本研究結(jié)合最新分子生物學(xué)進展與前人研究經(jīng)驗，從高產(chǎn)紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)建立以及紫杉醇誘導(dǎo)方法兩個方面，綜述了紫杉醇商業(yè)化高產(chǎn)體系建立的方法，并對今后提高紫杉醇含量的生產(chǎn)途徑進行了展望。

1　高產(chǎn)紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)體系的建立

1.1 誘導(dǎo)愈傷組織

誘導(dǎo)出符合要求的愈傷組織是建立高產(chǎn)懸浮細胞系的關(guān)鍵，后續(xù)的繼代培養(yǎng)和懸浮細胞系的建立要求愈傷組織具備高的分化能力、質(zhì)地松散、生長旺盛，而紫杉醇的誘導(dǎo)則要求誘導(dǎo)出顏色淺、塊狀或顆粒明顯、次生代謝產(chǎn)物含量較高的細胞團。在實驗操作的過程中，愈傷組織的誘導(dǎo)主要受到外植體、培養(yǎng)基、激素等因素影響。

1.1.1 外植體紅豆杉的莖段、芽、假種皮、葉、胚、根均可用于愈傷組織的誘導(dǎo)。愈傷組織中紫杉醇的含量是建立高產(chǎn)的懸浮細胞系選擇外植體的重要依據(jù)。張芳芳等(2010)比較了南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)、曼地亞紅豆杉(T.media)和短葉紅豆杉不同外植體來源的愈傷組織的生長特點和紫杉醇含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中以南方紅豆杉種胚為最佳外植體，其誘導(dǎo)的愈傷組織不僅紫杉醇含量高，而且污染率低。同時，Zhang et al(2000)總結(jié)前人的研究發(fā)現(xiàn)當前紫杉醇產(chǎn)量在100 mg·L-1以上的細胞株系都來自于胚誘導(dǎo)的愈傷組織。

1.1.2 培養(yǎng)基誘導(dǎo)紅豆杉愈傷組織常見的培養(yǎng)基為MS、B5，但它們在愈傷組織誘導(dǎo)與紫杉醇積累中的作用不同。杜亞填等(2006)認為南方紅豆杉的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS，B5則是愈傷組織的增殖、馴化和紫杉醇的最佳培養(yǎng)基。然而也有不同的研究結(jié)果報道。金貞蘭等(2010)以東北紅豆杉(T.cuspidata)莖為外植體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最好的基本培養(yǎng)基是WPM，其次是B5。因此，可以采用階段培養(yǎng)法，根據(jù)不同種的紅豆杉在細胞培養(yǎng)的不同生長階段可以選擇不同的培養(yǎng)基。

1.1.3 激素誘導(dǎo)愈傷組織的激素與植物內(nèi)源激素相關(guān)，葛麗麗等(2006)對紅豆杉內(nèi)源激素進行測定，發(fā)現(xiàn)紅豆杉枝、葉中均含有ABA、IAA、GA、ZA，因此培養(yǎng)基中激素的種類、濃度及不同的激素組合對愈傷組織誘導(dǎo)和培養(yǎng)起著重要作用。在適宜濃度范圍內(nèi)的6-BA，對解除胚休眠和萌發(fā)具有顯著促進作用。當6-BA添加濃度為1.5 mg·L-1時，紅豆杉的萌發(fā)率和成苗率分別較對照提高了30.6% 和17.5%(臧新等,2006)。翟雪霞(2009)的研究表明，對愈傷組織的誘導(dǎo)以1.0 mg·L-12,4-D，1.0 mg·L-1NAA和0.5～1.0 mg·L-16-BA配合最佳。杜亞填等(2006)則發(fā)現(xiàn)當NAA濃度高于0.4 mg·L-1時，對愈傷組織誘導(dǎo)不利，單獨使用2 mg·L-1的2,4-D或與適宜濃度的KT、6-BA、KT+GA3相配合，有利于紫杉醇的合成。綜上所述，適宜濃度的2,4-D、6-BA、NAA、GA3、KT等都可促進紅豆杉愈傷組織的誘導(dǎo)，但在愈傷組織產(chǎn)生的時間均表現(xiàn)出較顯著差異，不同紅豆杉品種、不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)應(yīng)選用不同的培養(yǎng)基與不同濃度的激素組合。

1.1.4 培養(yǎng)條件愈傷組織的培養(yǎng)條件主要是指培養(yǎng)基內(nèi)的pH、光照、溫度等因素。紅豆杉愈傷組織對pH要求較小，培養(yǎng)基的pH值在4.8～7.8時生長沒有明顯差異(Fett-Neto et al,1995)。同時，紅豆杉細胞適宜的生長溫度范圍也較寬，在20～30 ℃進行培養(yǎng)，均能誘導(dǎo)出愈傷組織。而光照條件對愈傷組織的影響較大，在黑暗條件下誘導(dǎo)的愈傷組織與光照條件相比不僅生長速度快，而且紫杉醇含量高。

1.1.5 添加物向培養(yǎng)基中添加適量的有機附加物能對愈傷組織的生長率與紫杉醇的含量產(chǎn)生顯著影響。研究表明添加水解酪蛋白能顯著提高紫杉醇的含量，其濃度為0.1%時，紫杉醇含量最高(盛長忠, 2000)。同時天然添加物椰子汁(甘煩遠等,1996)、馬鈴薯汁(趙繼鵬,2013)也對愈傷組織的生長有促進作用。然而能促進細胞培養(yǎng)的有機物僅是少部分，司徒琳莉和李振山(2001)發(fā)現(xiàn)附加0.1%的酵母菌膏、0.1%的玉米胚提取液、0.1%的紫杉外植體粉末、0.1%的土壤提取液或0.1%的牛肉蛋白胨浸膏，均對愈傷組織的生長速度無顯著影響。

1.1.6 褐化的控制在愈傷組織培養(yǎng)過程中形成的酚類物質(zhì)易氧化，并會分泌出大量的棕色色素物質(zhì)使其顏色加深，這種現(xiàn)象稱為褐化。褐化抑制了細胞內(nèi)多種酶的活性，擾亂了其正常代謝過程，且由于紫杉醇的次生代謝途徑與防御反應(yīng)相重疊，使得紅豆杉褐化程度加劇。在培養(yǎng)基中，加入適量的抗氧劑或吸附劑可達到抑制愈傷組織褐化的目的，如維生素C(何康,2006;李麗等, 2006)、活性碳(黃寧珍等,2007)、聚乙烯吡咯烷酮(鄭超,2013;趙繼鵬和楊叔慎,2014)、檸檬酸(趙繼鵬,2013)等。除此之外，通過改變細胞培養(yǎng)環(huán)境中的氧水平(胡凱等,2004)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)過程中的光照(于婭和陳嘉棋,2012)、激素組合(韓曉紅等,2013)，低溫預(yù)處理(高明波等,2011)等手段，也能一定程度上減少褐化。

2　細胞懸浮培養(yǎng)及紫杉醇誘導(dǎo)

2.1 生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器培養(yǎng)是實現(xiàn)紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)、大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇的最好途徑，用于懸浮培養(yǎng)的生物反應(yīng)器主要有機械攪拌式和氣升式(余響華等,2013)。目前，加拿大的Phyton Biotech、韓國的Samyang Genex和德國的Nattermann等世界一流制藥公司生產(chǎn)紫杉醇的生物反應(yīng)器已達75 000 L(Malik et al,2011)。

對于懸浮細胞培養(yǎng)方式的研究，當前的熱點主要集中于細胞培養(yǎng)的動力學(xué)過程。氧傳質(zhì)系數(shù)是表征反應(yīng)器操作性能的重要參數(shù)，是反應(yīng)器優(yōu)化設(shè)計和放大的關(guān)鍵，張長銀等(2013)通過測定了紅豆杉懸浮細胞在10 L通氣攪拌反應(yīng)器中的氧傳質(zhì)系數(shù)，發(fā)現(xiàn)通氣量對氧傳質(zhì)系數(shù)的影響大于攪拌轉(zhuǎn)速對氧傳質(zhì)系數(shù)的影響，且隨著細胞生物量增加、氧傳質(zhì)系數(shù)減少、攝氧率增加，比耗氧速率呈現(xiàn)出先增加后緩慢下降的趨勢。反應(yīng)器中懸浮細胞的培養(yǎng)還與細胞生長狀況的評價與控制相關(guān)。Zhang et al(2013)根據(jù)Logistic方程，建立了在15 L生物反應(yīng)器中的懸浮細胞生長動力學(xué)模型，它由底物消耗的動力學(xué)非結(jié)構(gòu)化模型、產(chǎn)物合成、流變行為和能量溢出四個部分構(gòu)成，其中降低能量溢出能夠優(yōu)化紫杉醇的誘導(dǎo)過程。與實驗室小規(guī)模培養(yǎng)不同，商業(yè)生產(chǎn)的大規(guī)模生物反應(yīng)器會產(chǎn)生巨大剪切力，它對細胞生長代謝會造成顯著影響。Han et al(2013)研究了21種紫杉烷類物質(zhì)在生物反應(yīng)器剪切力作用下的代謝變化，結(jié)果表明除了紫杉醇和巴卡亭Ⅲ含量顯著降低外，許多與紫杉醇代謝途徑無關(guān)的紫杉烷類物質(zhì)也顯著降低。通過進一步定位檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)剪切力會破壞其前體GGPP的環(huán)化過程，擾亂后續(xù)羥化與?；樞?，影響官能團環(huán)氧丁烷環(huán)形成，從而限制了紫杉醇的合成。

2.2 代謝調(diào)節(jié)

2.2.1 添加誘導(dǎo)子誘導(dǎo)子是誘發(fā)植物在抗病生理過程中產(chǎn)生植保素或引發(fā)過敏反應(yīng)的因子，是調(diào)控植物次生代謝產(chǎn)物生物合成的重要手段。它能夠顯著提升紫杉醇及其衍生物的含量，具有專一性、快速性的特征(Khosroushahi et al, 2006)。根據(jù)其來源不同，誘導(dǎo)子可分為生物誘導(dǎo)子與非生物誘導(dǎo)子。對新誘導(dǎo)子的篩選以及紫杉醇合成調(diào)控有關(guān)的信號分子與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究是當前熱點。

(1)生物誘導(dǎo)子：生物誘導(dǎo)子是植物在防御過程中為對抗微生物感染而產(chǎn)生的物質(zhì)，包括內(nèi)生真菌與有機體產(chǎn)生的各種代謝物(仇燕等,2003)。

內(nèi)生真菌是植物內(nèi)環(huán)境中一種重要的組成部分，它能夠選擇性地誘導(dǎo)藥用植物特定基因的表達，從而促進藥用活性成分的積累(譚燕等,2013)。Jian et al(2013)從南方紅豆杉樹皮中分離出了192株內(nèi)生真菌，經(jīng)過檢測，僅有真菌Diaporthephaseolorum能產(chǎn)生紫杉醇的前體物質(zhì)巴卡亭Ⅲ。Li et al(2009)將內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子美麗鐮刀菌與紅豆杉懸浮細胞在20 L的攪拌式共生生物反應(yīng)器中進行培養(yǎng)，結(jié)果表明共生系統(tǒng)中的紫杉醇含量和分泌率分別是對照的2倍與6.8倍。同時，作者還發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌的使用加速了培養(yǎng)基內(nèi)的蔗糖消耗，這可能是由于內(nèi)生真菌通過轉(zhuǎn)化能量或激活膜上轉(zhuǎn)運酶的方式促進了紫杉醇向胞外分泌從而消耗了糖份。

茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)廣泛存在于植物防御信號的傳遞途徑中，它能將外部逆境信息傳遞給胞內(nèi)大分子產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)從而促進次生代謝產(chǎn)物的合成，是一種生物誘導(dǎo)子。MeJA的處理時間與濃度，都會顯著影響紫杉醇的誘導(dǎo)效果(Ketchum et al,1999;Khosroushahi et al,2006)。當前研究表明，在MeJA誘導(dǎo)紫杉醇合成過程中，細胞色素氧化酶P450受到miRNA的調(diào)控，Qiu et al(2009)用Illumina測序研究紅豆杉細胞中的小RNA轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)用MeJA誘導(dǎo)紫杉烷合成后，3個miRNA表達上調(diào)，14個表達下調(diào)。Li et al(2012)用高通量測序技術(shù)對MeJA處理后的紅豆杉轉(zhuǎn)錄組進行了測序，得到了200 bp序列讀長和46 581個非冗余重疊群，通過功能注釋，發(fā)現(xiàn)MeJA處理后的代謝途徑涉及茉莉酸、苯丙烷類和萜類化合物的生物信息學(xué)重建。但經(jīng)過MeJA處理的懸浮細胞，具有不同細胞系之間紫杉醇分泌不穩(wěn)定的缺點，Patil et al(2012)通過qRT-PCR技術(shù)研究了不穩(wěn)定性的分子機制關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同細胞系紫杉醇合成途徑基因的表達量均劇烈增加，雖系間產(chǎn)量差異巨大，但基因表達量的差異不顯著。

冠菌素(Coronatine，Cor)是一種由菌株P(guān)seudomonassyringae分泌于細胞外，結(jié)構(gòu)及活性與茉莉酸相近的植物激素(梁垚,2011)。Cor能夠作為茉莉酸-異亮氨酸復(fù)合物(jasmonoyl-isoleucine，JA-Ile)的強效抑制劑來啟動植物防御反應(yīng)(Katsir et al, 2008)。Onrubia et al(2013)研究了Cor與MeJA對紅豆杉懸浮細胞系中紫杉醇的誘導(dǎo)作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cor誘導(dǎo)的紫杉醇及其前體物質(zhì)巴卡亭Ⅲ的含量為MeJA的4.8、3.6倍，較大地提高了萜類物質(zhì)的產(chǎn)量。通過qRT-PCR檢測，結(jié)果表明雖然冠菌素與茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)效果差異較大，但兩者基因誘導(dǎo)表達模式相似。

環(huán)糊精(Cyclodextrin,CD)是6～12個D-吡喃葡萄糖基由α-1,4-葡萄糖苷鍵連接而成的環(huán)狀低聚糖(沈海民等,2014)。它能夠作用于細胞結(jié)構(gòu)，形成環(huán)糊精包合物將不親水的次生代謝物運送出胞外，促進細胞內(nèi)次生代謝物向培養(yǎng)基的分泌。當向培養(yǎng)基中單獨加入CD或茉莉酸甲酯時，其基因表達變化較小或表現(xiàn)不穩(wěn)定，而同時添加兩種物質(zhì)時會出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，編碼轉(zhuǎn)運酶基因BAPT和DBTNBT表達量增加，紫杉醇含量增加到對照的55倍(Sabater-Jara et al, 2014)。

隨著學(xué)科之間的不斷交融與滲透，交叉學(xué)科已經(jīng)成為科學(xué)發(fā)展的重要趨勢，這為紫杉醇誘導(dǎo)提供了新的視角。鯊烯素是存在動物各組織器官中，終止細胞增殖的信號分子。Amini et al(2014)研究了鯊烯素對紫杉醇以及巴卡亭Ⅲ產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，鯊烯素的處理提高了紫杉醇合成過程關(guān)鍵基因ts的表達，紫杉醇以及巴卡亭Ⅲ產(chǎn)量顯著提高。同時H2O2含量也顯著增加，H2O2可能是紫杉烷類物質(zhì)合成過程的關(guān)鍵信號分子。

(2)非生物誘導(dǎo)子：非生物誘導(dǎo)子包括化學(xué)脅迫誘導(dǎo)子和物理脅迫誘導(dǎo)子，如稀土元素鈰(羅杰, 2003)、鑭(梅興國和田朝霞,2000)，金屬離子銅(胡蕾,2012)、銀(Zhang et al,2000)等。

Yang et al(2008)對稀土元素鈰促進紫杉醇分泌的信號通路展開了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其通過激活磷脂酶A2的高水平表達，釋放LysoPC和自由脂肪酸，從而強化胞內(nèi)茉莉酸不斷積累，促進紫杉醇的分泌。但鈰同時也激活了磷脂酶D，產(chǎn)生高濃度信使分子磷脂酸，啟動下游凋亡途徑。因此，稀土元素的使用有一個最適使用范圍，高濃度會造成細胞活力下降，甚至誘發(fā)細胞凋亡。

二甲基亞砜(DMSO)是一種非質(zhì)子極性溶劑，它能夠溶解紫杉醇，并具有抑制細胞的生長、誘導(dǎo)細胞凋亡的功能(Sánchez et al,1999; Sharma et al,1998)。Kajani et al(2012)發(fā)現(xiàn)二甲基亞砜不僅可以促進紫杉醇產(chǎn)量的提高，還能增加細胞的紫杉醇的胞外釋放率，其最佳使用濃度為5%。

潘學(xué)武和董妍玲(2010)研究了脈沖及微交流電刺激對中國紅豆杉懸浮培養(yǎng)體系紫杉醇分泌與釋放的影響。結(jié)果表明，兩種電刺激均能不同程度的促進了紫杉醇的誘導(dǎo)與釋放，其中在脈沖電刺激作用下，紫杉醇最高產(chǎn)量達到12.24 L·mg-1，為對照的7～9倍，胞外釋放率是對照的4～5倍。

O3是一種強氧化劑，它會迅速與細胞隙存在的H2O反應(yīng)，產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，ROS會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氧化、脂質(zhì)過氧化，從而加速細胞衰老(Fuhrer & Booker,2003;Kangasjarvi et al,2005)。Xu et al(2011)發(fā)現(xiàn)暴露在O3環(huán)境中的中國紅豆杉懸浮細胞ABA含量與紫杉醇產(chǎn)量顯著上升。為了檢測ABA是否促進了紫杉醇的產(chǎn)生，作者用ABA抑制劑氟化物進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABA的抑制不僅降低了O3對紫杉醇的誘導(dǎo)作用，而且具有劑量效應(yīng)。實驗證明ABA在O3誘導(dǎo)中紫杉醇含量上升的過程中具有重要作用。鑒于ABA和紫杉醇合成的緊密關(guān)系，Li et al(2012)通過過表達ABA合成途徑中的關(guān)鍵酶9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED)基因，也獲得了高產(chǎn)紫杉醇轉(zhuǎn)基因細胞系。由此可見，雖然人們可以通過挖掘調(diào)控紫杉醇代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子，構(gòu)建多個關(guān)鍵酶基因組合表達的轉(zhuǎn)基因細胞系、高表達相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子來激活紫杉醇生物合成的關(guān)鍵酶，但依靠基因工程來提高紫杉醇含量實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)依然需要其他因素的支撐。

(3)生物與非生物誘導(dǎo)子的協(xié)同作用：在植物的防御反應(yīng)中，會出現(xiàn)多個信號途徑同時反應(yīng)的情況(Zhao et al,2005)，因此生物與非生物誘導(dǎo)子的聯(lián)合使用可能具有協(xié)同效應(yīng)，能共同促進紫杉醇的生產(chǎn)。水楊酸是一種誘導(dǎo)多種植物對細菌、病毒產(chǎn)生抗性，參與植物對病原防衛(wèi)反應(yīng)的生物誘導(dǎo)子。而超聲波則通過增加膜透性，促進細胞次生代謝物積累，是一種非生物誘導(dǎo)子。Rezaei et al(2011)研究了超聲波與水楊酸對紅豆杉懸浮細胞系紫杉醇含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)量比兩種誘導(dǎo)子單獨使用時分別高出4倍與1.2倍，比對照高出8倍。但并不是所有生物與非生物誘導(dǎo)子的聯(lián)合使用都具有協(xié)同效應(yīng)，不同誘導(dǎo)子可能涉及不同的細胞防御機制，因此會出現(xiàn)相互干擾的情況。Onrubia et al(2010)用MeJA與水合硫酸氧釩共同處理紅豆杉懸浮細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫杉醇最高產(chǎn)量的出現(xiàn)時間要比對照與單獨使用誘導(dǎo)子的情況延遲4 d，但其次生代謝物分泌量比單獨使用MeJA作為誘導(dǎo)子時低。

2.2.2 前體飼喂紫杉醇是一個基本骨架為紫杉烷類的三環(huán)二帖，生物合成以乙酰輔酶A為原料，經(jīng)甲瓦龍酸、牛兒醇、牛兒醇基牛兒醇基焦磷酸、紫杉二烯等一系列步驟，因此補加其生物合成過程的中間體可能促進細胞中紫杉醇的合成。翟雪霞和李友勇(2009)發(fā)現(xiàn)甘氨酸、絲氨酸、L-苯丙氨酸三種前體物質(zhì)能提高細胞的紫杉醇合成能力，但會抑制愈傷組織的生長；與其不同的是D-苯丙氨酸，它不僅能促進愈傷組織的生長，而且顯著提高了紫杉醇合成能力，經(jīng)D-苯丙氨酸處理后，紫杉醇含量高達0.224%。 紫杉烷是紅豆杉懸浮培養(yǎng)中具有五甲基十五碳烯骨架的二萜類產(chǎn)物的總稱，大部分都可以作為紫杉醇的半合成原料(程立超等,2013)。周忠強等(2005)發(fā)現(xiàn)丙酮酸鈉、苯甲酸鈉、乙酸鈉和丙酮酸鈉等前體物質(zhì)也能促進紫杉烷的合成，其中苯甲酸鈉可使11-二烯產(chǎn)率提高245.2%。

2.2.3 添加抑制劑添加代謝旁路抑制劑能夠抑制某些分支代謝中關(guān)鍵酶的活性，從而使反應(yīng)朝有利于特定化合物的合成方向進行。植物中存在兩條合成萜類代謝的途徑，胞漿中的甲羥戊酸途徑和質(zhì)體中的非甲羥戊酸途徑。劉智等(2005)采用甲羥戊酸途徑抑制劑洛伐它汀和非甲羥戊酸途徑抑制劑磷甘霉素，對紅豆杉懸浮細胞進行處理，發(fā)現(xiàn)兩種途徑對紫杉醇的生物合成都有促進作用，而非甲羥戊酸途徑貢獻較大。通過定量PCR技術(shù)分別檢測兩條途徑的關(guān)鍵酶5-脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶(DXR)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)mRNA水平變化，發(fā)現(xiàn)兩種抑制劑都能夠激活HMGR和DXR的轉(zhuǎn)錄，因此推斷兩種代謝途徑存在協(xié)同作用，共同為紫杉醇的生物合成提供前體。Wang et al(2007)的研究也表明在水楊酸存在條件下，DXP途徑的激活是紫杉醇前體IPP形成的主要原因。

2.2.4 前體、誘導(dǎo)子、抑制劑的協(xié)同誘導(dǎo)在適宜的濃度范圍內(nèi)，多種因子的協(xié)同誘導(dǎo)較單因子誘導(dǎo)更能提高紫杉醇產(chǎn)量。李干雄等(2008)檢測了在中國紅豆杉懸浮細胞生長和紫杉醇積累的過程中，水楊酸、硝酸銀、氨基酸前體、D-果糖和硫酸鑭的添加時間的影響，發(fā)現(xiàn)這些促進劑的添加時間對細胞的生長沒有顯著的影響，但都能顯著促進紫杉醇的合成。同時作者也發(fā)現(xiàn)蔗糖、檸檬酸三銨、水楊酸和氨基酸的組合對細胞生長和紫杉醇積累具有促進作用，在培養(yǎng)初始添加1.67 mg·L-1硝酸銀，第9天添加10 g·L-1蔗糖與1 540 mg·L-1檸檬酸三銨顯著提高紫杉醇的合成能力，紫杉醇達到可達到39.2 mg·L-1(李干雄等,2010)。云南紫杉烷C是紅豆杉懸浮培養(yǎng)的主要次生代謝產(chǎn)物之一，高明波等(2010，2011)在特定時間用100 μmol·L-12, 3- 二羥丙基茉莉酸、20 g·L-1蔗糖和100 g·L-1XAD-7HP原位吸附進行處理，使得云南紫杉烷C產(chǎn)量達(1 517±37)mg·L-1，是對照處理的11.1倍；同時作者采用RT-PCR揭示了云南紫杉烷C合成過程中6個關(guān)鍵酶基因的動態(tài)變化，結(jié)果表明2, 3-二羥丙基茉莉酸的加入可使6個基因表達水平顯著提高，而吸附劑的加入雖然會延緩基因表達水平的提高速度，但能使基因表達維持在較高水平(高明波等,2010,2011)。

2.3 基因工程

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，對紅豆杉轉(zhuǎn)基因器官的培養(yǎng)和目的基因的分離轉(zhuǎn)化已經(jīng)取得了突破性進展。Han et al(1994)用根癌農(nóng)桿菌B0542和C58感染紅豆杉幼莖，誘導(dǎo)出了可在不含植物激素培養(yǎng)基上快速生長的冠癭瘤，并用Southern雜交檢測到T-DNA的存在，首次證明了紅豆杉可被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。苗莉云等(2013)通過構(gòu)建C-13苯丙素側(cè)鏈CoA-乙酰轉(zhuǎn)移酶基因Bapt的表達載體，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化中國紅豆杉細胞，qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因細胞Bapt的mRNA表達量是未轉(zhuǎn)化細胞的1.26倍，HPLC檢測其紫杉醇含量高達為37.4 μg·g-1，是未轉(zhuǎn)化細胞1.87倍。Zhang et al(2011)通過克隆10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-O-乙?；D(zhuǎn)移酶基因dbat，構(gòu)建其表達載體LBA4404和pCAMBIA1303 轉(zhuǎn)化中國紅豆杉細胞系，經(jīng)潮霉素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因細胞系。分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因細胞dbat的mRNA表達量是未轉(zhuǎn)化細胞的(5.3±0.6)倍，紫杉醇產(chǎn)量約為(35±0.61) mg·g-1，是未轉(zhuǎn)化細胞的1.7倍。作者同時對3'-N-去苯甲酰紫杉醇N-苯甲酰轉(zhuǎn)移酶的基因Dbtnbt過表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達Dbtnbt基因能提高中國紅豆杉細胞中的紫杉醇產(chǎn)量約37%(張鵬等, 2014)。抑制特異基因的表達也能促進紫杉醇的合成，Li et al (2011)使用反義RNA技術(shù)抑制了合成紫杉醇側(cè)鏈的紫杉烷14β-羥基化酶，結(jié)果表明三種主要的C-14氧取代紫杉烷類化合物yunnanxane, taxuyunnanine C,sinenxan C產(chǎn)量下降，紫杉醇含量提高。

2.4 其他處理

為克服組織培養(yǎng)過程中細胞具有的易變性的缺陷，科研人員把目光聚焦在了具有生長和遺傳優(yōu)勢的植物干細胞上。Lee et al(2010)將去除木質(zhì)部的紅豆杉莖段在B5培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得了新生的干細胞。再將干細胞進行懸浮培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)它們生長速度快、性狀穩(wěn)定，在添加了誘導(dǎo)子茉莉酸甲酯、殼聚糖和前體物質(zhì)苯丙胺酸的條件下，細胞分泌了102 kg·mg-1的紫杉醇，而同期由莖段和胚誘導(dǎo)的愈傷組織僅僅分泌了23.39 kg·mg-1。且由于干細胞具有游離生長、液泡分散的特性，對大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)、不同規(guī)格的氣升式、攪拌槳式生物反應(yīng)器均具有較高適應(yīng)性。

在懸浮培養(yǎng)過程中，細胞通常由于分裂的不均一性以聚集體形式存在，而細胞聚集體的大小通常與紫杉醇的含量有關(guān)。Kolewe et al(2010)研制了一種利用庫爾特計數(shù)器來衡量細胞聚集體的方法，它可以讓實驗者在組織培養(yǎng)過程中實時監(jiān)測細胞的生長狀況，評價聚集體的大小及細胞的生物量的積累。且該方法比傳統(tǒng)過濾與圖像分析的方法操作更便捷、結(jié)果更為可靠。Bonfill et al(2006)將不同紫杉醇分泌能力的細胞系相混合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)細胞系能夠促進混合細胞系紫杉醇的分泌，但這種影響能力在多次繼代后效果下降。

3　問題與展望

為提高細胞中紫杉醇的含量，前人對紅豆杉懸浮體系建立過程中的各個環(huán)節(jié)、紫杉醇生物合成的分子機制已進行了大量研究，對不同誘導(dǎo)子、前體物質(zhì)、抑制劑的使用也已趨于成熟，可從細胞、分子不同水平，添加誘導(dǎo)子、前體飼喂等不同方式共同促進紫杉醇的生產(chǎn)。實驗證明，云南紅豆杉、東北紅豆杉、曼地亞紅豆杉等不同種均能建立起穩(wěn)定的懸浮細胞系，但與此同時人類面臨的癌癥問題也日益嚴峻。目前全球每年新增癌癥病人數(shù)約1 600萬，死亡人數(shù)約720萬，據(jù)《全球癌癥報告》預(yù)測，到2025年全球每年新增患癌病例將增至1 900萬，到2030年將增至2 200萬，這些癌癥病人均為紫杉醇的主要使用者。而紫杉醇作為醫(yī)院首選的抗腫瘤藥物，其供應(yīng)依然無法滿足市場需求(Malik et al,2011)。

通過當前傳統(tǒng)的方法來提高紫杉醇含量，主要面臨兩個問題：(一)大規(guī)模生物反應(yīng)器生產(chǎn)紫杉醇不穩(wěn)定，細胞表觀形態(tài)、生長速率和紫杉醇合成能力在培養(yǎng)過程中均會發(fā)生顯著變化。Fu et al(2012)發(fā)現(xiàn)經(jīng)過5 a懸浮培養(yǎng)的紅豆杉細胞系，顏色由棕色變?yōu)榘咨驘o色，雖然生物量積累比率逐漸上升，但紫杉醇的產(chǎn)量逐漸降低。同時，由于懸浮細胞對培養(yǎng)基成分、細胞密度、溫度等環(huán)境因素非常敏感，培養(yǎng)過程中細微的變化都會對顯著影響懸浮系統(tǒng)的穩(wěn)定性(Kim et al,2004)。(二)誘導(dǎo)子的使用會影響細胞的正常生長。紫杉醇是一種植保素，它在植物受到逆境脅迫時起防御作用，而誘導(dǎo)子則通過激活細胞的防御反應(yīng)來改變紅豆杉細胞合成紫杉醇的速率和積累，因此使用誘導(dǎo)子雖然可以在短期內(nèi)促進紫杉醇含量提高，但不利用細胞長期培養(yǎng)。Patil et al(2014)發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯會破壞細胞從G1期到S期的過渡過程，減緩細胞周期的進行，抑制細胞生長。而添加提取自Fusariumoxysprum的生物誘導(dǎo)子，則會在提升紫杉醇含量的同時直接造成細胞凋亡(Yuan et al,2002)。為解決這些的問題，紫杉醇產(chǎn)量的提升可從以下幾個方向發(fā)展：(一)研究紅豆杉細胞在組織培養(yǎng)過程中發(fā)生遺傳變異的影響因素，揭示紫杉醇在細胞離體培養(yǎng)中發(fā)生變化的分子調(diào)控機制。當前研究表明，長期培養(yǎng)的低產(chǎn)量細胞通常具有較高的甲基化水平(Fu et al，2012)，而經(jīng)過長時間限制生長保存的紅豆杉愈傷組織在恢復(fù)處理過程中紫杉醇含量的降低也與基因的甲基化相關(guān)(Li et al,2013)。同時Li et al(2009)也發(fā)現(xiàn)，紫杉醇含量下降的細胞系其代謝途徑關(guān)鍵酶dxr、hmgr、ggpps、dbat轉(zhuǎn)錄水平降低。隨著研究的不斷深入，以分子生物學(xué)手段解決次生代謝物不穩(wěn)定性的問題指日可待。(二)利用代謝組學(xué)，研究誘導(dǎo)子促進作用與協(xié)同效應(yīng)的分子機制，篩選低毒、高效、廣譜、專一的誘導(dǎo)子，以不影響后續(xù)培養(yǎng)的方式激活紫杉醇的防御響應(yīng)。內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子是一種具有發(fā)展?jié)摿Φ纳镎T導(dǎo)子，它不僅能在簡單的培養(yǎng)基上生長良好，產(chǎn)生大量發(fā)酵產(chǎn)物(Zhou et al,2010)，而且誘導(dǎo)效果高于普通誘導(dǎo)子(Li et al,2009)，可進一步通過誘變育種等方式來提高菌種性能以促進紫杉醇的分泌。(三)開發(fā)出性能更高的生物反應(yīng)器。大規(guī)模長期培養(yǎng)過程中，環(huán)境不穩(wěn)定性是提升紫杉醇含量的阻礙之一，因此開發(fā)出即能建立穩(wěn)定環(huán)境滿足細胞生長需求，又考慮產(chǎn)物運輸與貯藏以減少紫杉醇在貯運分解過程中損失的生物反應(yīng)器，是實現(xiàn)細胞工程規(guī)模化生產(chǎn)紫杉醇的必經(jīng)途徑。(四)采用基因工程技術(shù)合成紫杉醇。隨著紫杉醇生物合成分子生物學(xué)的深入研究，紫杉醇的生物合成過程已基本闡明，大部分功能與相關(guān)酶基因得到了克隆與表達。由于紫杉醇的合成主要受其下游調(diào)控，因此利用分子生物技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇，控制后生物合成特別是下游修飾過程以生產(chǎn)有特定性質(zhì)的代謝產(chǎn)物，是未來實現(xiàn)紫杉醇的高效率生產(chǎn)的重要途徑。

在紫杉醇生物合成過程研究不斷深入的條件下，其次生代謝調(diào)節(jié)途徑不斷清晰，屆時將前人建立懸浮細胞的經(jīng)驗與最新生物技術(shù)相結(jié)合，將可以促進紫杉醇的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，造福廣大癌癥病患者。

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Research progress in high yielding suspension cell lines and the induction of Taxol inTaxus

WANG Mu-Lan1， YANG Sheng-Chao1， YU Bu-Zhu2， LI Wei-Qi2*

( 1.YunnanResearchCenteronGoodAgriculturePracticeforDominantChineseMedicinalMaterials,YunnanAgricultureUniversity, Kunming 650201, China; 2.GermplasmBankofWildSpecies,KunmingInstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences, Kunming 650201, China )

Taxol, a diterpene alkaloid secondary metabolite ofTaxusspecies, has been considered as one of the most promising anticancer drugs used for the treatment of several types of cancer. However, due to the difficulties in obtaining enough this compound fromTaxustrees, the traditional approach extracted directly from plants not only produces low yield, but also triggers serious damage to the wild resource ofTaxus. At the same time, the complex structure Taxol has impeded efforts to find a method to fulfill an economically feasible strategy via total synthesis. By constrast, cell culture ofTaxusis a potential alternative for the production of Taxol and analogue compounds in a large scale culture, which possesses a multitude of advantages such as high purity product of secondary metabolite, low production cost, short cell growth cycle and less influence from external factors. Huge efforts have been made to develop a more sustainable source of Taxol. The main target of ongoingTaxus-related research in recent years are on the regulation ofTaxusmetabolism, key genes mining, application and development in new pharmaceutical preparations. Different ways, including application of precursors and elicitors, optimizing of cultural conditions, screening of high yielding cell lines, optimization of growth and production media, have been already tested to improve the yield of Taxol in cultures ofTaxus. It is necessary to take into account the latest achievements based on empirical procedures to establish a high yielding system. In this review, we have summarized the latest endeavors to establish a high yield suspension cell line and increase its yield of Taxol, with a special focus on the key issues related to tissue culture ofTaxussuch as explants, culture medium, hormone treatment, culture conditions, browning and other issues. Developments for new and more effective elicitation treatments and the application of metabolic engineering to design new transgenic cell lines ofTaxuswith an improved capacity for taxane production have also been described. In the end, the article discusses the faultiness of current researches and prospects various combinational methods for raising Taxol content. This paper is helpful for promoting technology progress of tissue culture in Tuaxs and it will provide the guidance for the protection and application of medicinal resources.

Taxus, anticancer drugs, cell culture, suspension cell lines, Taxol induced

10.11931/guihaia.gxzw201412021

2014-12-15

2015-07-06

國家自然科學(xué)基金(31070262)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(31070262)]。

王沐蘭(1991-)，女，云南彌勒人，碩士研究生，研究方向為植物學(xué)，(E-mail)670428366@qq.com。

李唯奇，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為植物對非生物脅迫響應(yīng)的信號過程，(E-mail)liweiqi@mail.kib.ac.cn。

Q943.1， Q946.889

A

1000-3142(2016)09-1137-10

王沐蘭，楊生超，郁步竹，等. 紅豆杉高產(chǎn)懸浮細胞系建立及其紫杉醇誘導(dǎo)的研究進展 [J]. 廣西植物， 2016， 36(9):1137-1146

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