郭蕊萌，尹利榮

?

異位內膜氧化應激及雌激素受體水平與盆腔痛關系的研究

郭蕊萌，尹利榮△

摘要:目的探討異位內膜氧化應激（OS）及雌激素受體（ER）水平與盆腔痛的關系。方法取輕、中、重度盆腔痛子宮內膜異位癥（EMs）患者異位內膜作為輕度組（29例）、中度組（34例）及重度組（26例），取正常子宮內膜作為對照組（30例）。采用黃嘌呤氧化酶法檢測和對比各組內膜中超氧化物歧化酶（SOD）水平；采用硫代巴比妥酸比色法檢測和對比各組內膜中丙二醛（MDA）水平；采用免疫組化法檢測和對比各組內膜中ER水平；分析3組異位內膜中MDA、SOD與ER水平相關性。結果3組異位內膜中SOD水平均低于對照組，MDA及ER水平均高于對照組（均P<0.05）；3組異位內膜中，隨疼痛程度增加，SOD水平逐漸降低，MDA及ER水平逐漸升高（均P<0.05）；輕度組內膜中MDA水平與ER水平無相關性，中度及重度組內膜中MDA水平與ER水平呈正相關（P<0.05），3組異位內膜中SOD水平與ER水平均無相關性。結論異位內膜存在OS及ER過表達，二者參與EMs盆腔痛的發(fā)生并發(fā)揮協同作用。

關鍵詞：子宮內膜異位癥；氧化性應激；受體,雌激素；超氧化物歧化酶；丙二醛；盆腔痛

盆腔痛是子宮內膜異位癥（endometriosis,EMs）主要臨床癥狀之一，其包括痛經、性交痛、排尿痛、排便痛、慢性盆腔痛，一直困擾著罹患婦女。EMs是一種雌激素依賴性疾病[1]，異位內膜中存在雌激素受體（ER）過表達[2]，可促進疾病的發(fā)展。雌激素亦被證實與痛覺有關[3]。氧化應激（oxidative stress,OS）是指體內氧化與抗氧化作用失衡，組織中活性氧大量產生并蓄積，激發(fā)鏈式脂質過氧化反應，導致脂質過氧化物增多，參與機體病理的過程。諸多報道已證明OS可參與疼痛發(fā)生[4]。丙二醛（malondialdehyde,mDA）是脂質過氧化物的最終代謝產物，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是體內抗氧化系統中存在的多種酶之一，二者是反映機體OS水平的標志物。本研究通過檢測并對比不同程度盆腔痛患者異位內膜及正常內膜中OS及ER水平，探討異位內膜中OS及ER水平與盆腔痛的關系，并通過分析異位內膜中MDA、SOD與ER相關性，探討OS及ER水平在致EMs盆腔痛過程中的聯系。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2013年12月—2015年6月在我院行手術治療輕度盆腔痛EMs患者29例，平均年齡（37.01± 4.78）歲，中度盆腔痛EMs患者34例，平均年齡（36.73±5.18）歲，重度盆腔痛EMs患者26例，平均年齡（35.11±3.98）歲，術中分別留取異位內膜作為輕、中、重度組。選擇同期在我科行診刮術患者30例，平均年齡（39.06±3.62）歲，留取內膜組織作為對照組（病理證實均為正常子宮內膜）。所有EMs患者均以痛經代表盆腔痛，并按照主訴疼痛程度（VRS）標準進行疼痛分級。所選患者術前3個月無激素治療史，無內外科合并癥。各組患者年齡比較差異無統計學意義(F=0.813，P > 0.05)。

1.2方法

1.2.1樣本制備所有標本均一式2份。一份加入2.5mL PBS溶液，勻漿后放入4℃保存?zhèn)溆?；一份制成石蠟切片，待行免疫組化染色。

1.2.2檢測方法SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法，MDA含量測定采用硫代巴比妥酸比色法。兩種指標測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。ER檢測行免疫組化染色，ER抗體及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。ER為細胞核顯示棕黃色顆粒。顯色即記為陽性細胞，計算陽性細胞率（陽性細胞數/觀察細胞數×100%）。標本均在低倍鏡下（10×10）選取3個高密度區(qū)，再在高倍鏡下（20×10）計數，最后取3個區(qū)域計數平均值。操作由3位病理科醫(yī)師分別完成，最終結果取三者平均值。

1.3統計學方法采用SPSS 19.0進行分析，計量數據均以±s表示，多組間比較采用方差分析，多重比較采用q檢驗；相關性分析采用Pearson相關。P < 0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1各組內膜中SOD及MDA水平比較3組異位內膜SOD水平均低于對照組，MDA水平均高于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05）；3組異位內膜中，隨疼痛程度增加，SOD水平逐漸降低，MDA水平逐漸升高，差異均有統計學意義（P < 0.05），見表1。

2.2各組內膜中ER水平比較3組異位內膜ER陽性細胞率均高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.05）；3組異位內膜中，隨疼痛程度增加，ER陽性細胞率逐漸升高，差異有統計學意義（P < 0.05），見表1，圖1～4。

Tab.1　Comparison of SOD,mDA and ER levels between four groups of endometrium表1　各組內膜SOD、MDA及ER水平比較　（±s）

Tab.1　Comparison of SOD,mDA and ER levels between four groups of endometrium表1　各組內膜SOD、MDA及ER水平比較?。ā纒）

＊P＜0.05,＊＊P＜0.01;a與對照組比較，b與輕度組比較，c與中度組比較，P＜0.05

對照組輕度組中度組重度組F 30 29 34 26 6.68±0.60 4.73±0.46a2.91±0.22ab1.23±0.41abc207.760＊＊41.98±8.87 194.76±22.18a385.07±31.07ab598.12±35.44abc693.857＊＊17.13±2.37 28.44±2.32a42.11±3.19ab57.58±4.84abc112.873＊

2.33組異位內膜中MDA、SOD水平與ER水平的相關性輕度組內膜中MDA水平與ER水平無相關性（r =0.202，P > 0.05）；中度組及重度組異位內膜中MDA水平與ER水平均存在明顯正相關（r分別為0.870、0.681，均P < 0.05）。輕、中、重度組異位內膜中SOD水平與ER水平均不存在相關性（r分別為0.276、0.291、-0.198，均P > 0.05）。

3　討論

大量研究表明，EMs盆腔痛與盆腔無菌性炎癥、異位病灶內及周圍神經異常生長、中樞及外周神經敏化有關[5]。OS與疼痛密切相關，抗氧化劑的應用可以減輕機體疼痛程度[6]。本研究發(fā)現，異位內膜存在OS，其與抗氧化系統中SOD的減少有關；且隨盆腔痛程度增強，病灶內OS水平逐漸加劇。OS能夠誘導巨噬細胞、細胞因子等多種致痛活性因子，并能夠誘導多種炎癥反應中介物[7]，致異位病灶內及周邊環(huán)境產生無菌性炎癥，觸發(fā)神經異常生長，激活前列腺素信號共同途徑[8-10]。OS導致異位病灶內所產生的毒性過氧化產物能夠影響信號傳導通路及疼痛相關離子通道，增強突觸間神經遞質的效能，調節(jié)疼痛相關蛋白激酶的活性，影響膠質細胞活性[11]。OS能夠誘導異位病灶細胞變性或死亡而參與神經退行性病變。這些作用均可導致外周或中樞神經敏化，從而導致EMs盆腔疼痛的產生。

雌激素能夠促進EMs的發(fā)生發(fā)展，其在疼痛產生中亦發(fā)揮著重要作用。本研究表明，EMs異位內膜ER表達水平隨盆腔痛程度增加逐漸升高。雌激素與ER結合后參與神經纖維生長發(fā)育、神經元存活、神經遞質合成以及髓鞘和軸突的再生過程[3]。雌激素與ER結合后從多個水平改變傷害性刺激信號傳導通路，并作用于傳導通路中多種神經遞質，促進前列腺素F2α（PGF2α）的合成或抑制其分解[12]。這些均可導致外周及中樞神經敏化。此外，雌激素與ER結合后可通過刺激組織產生炎性因子，導致無菌性炎癥，繼而誘發(fā)疼痛[13]。

雌激素能夠加劇組織內氧化應激狀態(tài)[14]。本研究發(fā)現，在輕度盆腔痛的EMs患者異位內膜中，ER水平及OS各司其職，沒有相關性。而當疾病發(fā)展到一定程度，異位內膜中ER上升到一定水平，異位內膜中OS狀態(tài)隨ER水平升高明顯加劇，二者在EMs盆腔痛的產生中發(fā)生協同作用。而這個作用并不是雌激素通過降低異位內膜SOD水平來達到的，其可能與異位內膜活性氧產生增加或其他抗氧化酶活性受到影響有關，具體機制有待深入研究。此外，雌激素具有抗細胞凋亡的作用，而氧化應激具有促進細胞損傷、凋亡的作用[15]，ER過表達與OS同時存在于增殖能力極強的異位內膜中，并具有一定的相關性，說明雌激素在加劇組織OS狀態(tài)的同時，其抗凋亡能力起主導作用，能夠抑制OS造成的組織損傷、凋亡，僅保留氧化應激致痛、致炎作用，進而加重疾病發(fā)展。

綜上所述，EMs患者異位內膜存在ER過表達及OS狀態(tài)，二者均與EMs盆腔痛相關。隨著EMs發(fā)展，當異位內膜ER水平升高到一定程度時，其能夠加劇異位內膜OS狀態(tài)，二者在致EMs盆腔痛中發(fā)揮協同作用，但具體機制有待進一步研究。

（圖1～4見插頁）

參考文獻

[1] Sheng W,Yin LR,Wang YQ,et al.Efforts of estrogen on expressions of EGFmRNA and EGFRmRNA in endometrial cells[J].Tianjinmed J,2013,41(4):321-323.[盛威，尹利榮，王宇全，等.雌激素對子宮內膜細胞EGFmRNA、EGFRmRNA表達的影響[J].天津醫(yī)藥，2013，41(4): 321- 323].doi:10.3969/j.issn.0253- 9896.2013.04.010.

[2]mori T,Ito F,Matsushimah,et al.G protein-coupled estrogen recep?tor 1 agonist G-1 induces cell cycle arrest in themitotic phase,lead?ing to apoptosis in endometriosis [J].Fertil Steril,2015,103(5):1228-1235.doi:10.1016/j.fertnstert.2015.01.026.

[3] Qi ZY,Yin LR.The Changes of serum estradiol and TNF-alpha lev? els in endometriosis patients with pelvic pain[J].Tianjinmed J, 2014,42(2):138-140.[齊之迎，尹利榮.子宮內膜異位癥盆腔痛患者血清雌二醇與TNF-α水平變化的研究[J].天津醫(yī)藥，2014，42 (2): 138-140].doi:10.3969/j.issn.0253-9896.2014.02.012.

[4] Santanam N,Kavtaradze N,Murphy A,et al.Antioxidant supplementa?tion reduces endometriosis-related pelvic pain inhumans[J].Transl Res,2013,161(3):189-195.doi: 10.1016/j.trsl.2012.05.001.

[5] Asante A,Taylor RN.Endometriosis: the role of neuroangiogenesis[J].Annu Rev Physiol,2011,73:163-182.doi:10.1146/annurev-physiol-012110-142158.

[6] Sesti F,Capozzolo T,Pietropolli A,et al.Dietary therapy:a new strate?gy formanagement of chronic pelvic pain[J].Nutr Res Rev,2011,24 (1):31-38.doi: 10.1017/S0954422410000272.

[7] Wang SY,Cong J,Wu XK.The role of overexpression in preeclamp?sia and emdomriosis[J].Reproduction and Contraception,2008,28 (2):121-123.[王淑言，叢晶，吳效科.氧化應激在子癇前期與子宮內膜異位癥中的作用[J].生殖與避孕，2008，28(2): 121-123].

[8]mcKinnon B,Bersinger NA,Wotzkow C,et al.Endometriosis-associat?ed nerve fibers,peritoneal fluid cytokine concentrations,and pain in endometriotic lesions from different locations[J].Fertil Steril,2012,97 (2):373-380.doi: 10.1016/j.fertnstert.2011.11.011.

[9] Barcena de ArellanomL,Arnold J,Vercellino F,et al.Overexpression of nerve growth factor in peritoneal fluid from women with endometriosismay promote neurite outgrowth in endometriotic lesions[J].Fertil Steril, 2011,95(3):1123-1126.doi: 10.1016/j.fertnstert.2010.10.023.

[10] Tran LV,Tokushige N,Berbicm,et al.Macrophages and nerve fibres in peritoneal endometriosis[J].Hum Reprod,2009,24(4):835- 841.doi:10.1093/humrep/den483.

[11] Lyuh,Chenh,Xiong NY.The study progress of themechanisms of reactive oxygen species in neurology pain[J].Chinese Journal of Painmedicine,2013,19(3):130-133.[呂虎，陳輝，熊能源.活性氧在神經病理性疼痛中的作用機制研究進展[J].中國疼痛醫(yī)學雜志，2013，19(3): 130-133].doi:10.3969/j.issn.1006-9852.2013.03.002.

[12] Daguati R,Somigliana E,Vigano P,et al.Progestogens and estropro?gestins in the treatment of pelvic pain associated with endometriosis [J].Minerva Ginecol,2006,58 (6):499-510.

[13] Capellino S,Montagna P,Villaggio B,et al.Role of estrogens in in?flamematory response:expression of estrogen receptors in peritone?al fluidmacrophages from endometriosis[J].Ann N Y Acad Sci,2006, 1069:263-267.

[14] El-MasmM,Abdel-Rahman AA.Estrogenmodulation of the etha?nol-evokedmyocardial oxidative stress and dysfunction via DAPK3/Akt/ERK activation inmale rats[J].Toxicol Appl Pharmacol,2015, 287(3):284-292.doi:10.1016/j.taap.2015.06.015.

[15] Kilic G,Alvarez-Mercado AI,Zarrouki B,et al.The islet estrogen re?ceptor-α is induced byhyperglycemia and protects against oxida?tive stress-induced insulin-deficient diabetes[J].PLoS One,2014,9 (2):e87941.doi: 10.1371/journal.pone.0087941.

（2015-08-13收稿2015-09-22修回）

（本文編輯李國琪）

應用研究

The relationship between oxidative stress and estrogen receptor levels in ectopic endometrium and pelvic pain

GUO Ruimeng, YIN Lirong△
Department of Gynecology, The Secondhospital, Tianjinmedical University, Tianjin 300211, China
△Corresponding Author E-mail:yinlirongfk@sina.com

Abstract:Objective To discuss the role of oxidative stress (OS) and estrogen receptor (ER) levels in ectopic endome?trium in patients with pelvic pain.Methods The ectopic endometrium was taken from patients withmild,moderate and se?vere pelvic pain, and samples were divided intomild group (n=29),moderate group (n=34) and severe group (n=26).The nor?mal samples of endometrium (n=30) were used as control group.Xanthine oxidasemethod was used to detect the level of su?peroxide dismutase (SOD), thiobarbituric acid colorimetricmethod was used to detect the level ofmalondialdehyde (MDA) and immunohistochemistry was used to detect the level of estrogen receptor (ER).The correlation ofmDA, SOD and ER lev?els was analysed between three ectopic endometrium groups.Results The SOD levels were significantly lower andmDA and ER levels were significantlyhigher in three ectopic endometrium groups than those in control group (P <0.05).The SOD levels were decreased, whilemDA and ER levels were gradually increased with increased pain intensity in three groups of ec?topic endometrium (P < 0.05).There was no correlation betweenmDA level and ER level inmild group (P > 0.05).A posi?tive correlation was found betweenmDA and ER levels inmoderate and severe groups (P < 0.05).There was no relationship between SOD and ER levels in three ectopic endometrium groups (P > 0.05).Conclusion Over-expression of OS and ER presents in ectopic endometrium, and both participate in the occurrence of pelvic pain, and create synergies in pelvic pain of ectopic endometrium.

Key words:endometriosis; oxidative stress; receptors, estrogen; superoxide dismutase;malondialdehyde; pelvic pain

通訊作者△E-mail:yinlirongfk@sina.com

作者簡介：郭蕊萌（1986），女，住院醫(yī)師，碩士，主要從事子宮內膜異位癥研究

中圖分類號：R711.71

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/20150114

作者單位：天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院婦科（郵編300211）