孔令平，劉愛芹，周旋，任玉，黃媛媛，劉速，張侖△

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STAT-3抑制劑WP1066增強順鉑對口腔鱗狀細胞癌侵襲能力抑制作用的體外研究

孔令平1，劉愛芹1，周旋1，任玉2，黃媛媛1，劉速1，張侖1△

摘要：目的探討信號轉導及轉錄激活因子3（STAT-3）調控miR-21增強化療藥物順鉑抑制人口腔鱗狀細胞癌侵襲能力的作用。方法實驗共分3組：二甲基亞砜組（DMSO組）、順鉑組（DDP組）、小分子抑制劑+順鉑組（WP1066+DDP組）。實時定量PCR檢測miR-21表達水平；Western blot檢測STAT-3及p-STAT-3、基質金屬蛋白酶組織抑制因子3（TIMP-3）、基質金屬蛋白酶2/9（MMP-2/9）的表達；用Matrigel基質生長實驗和Transwell體外侵襲實驗檢測腫瘤細胞生長形成球形克隆、侵襲能力；熒光素酶報告基因實驗檢測miR-21的表達水平。結果WP1066+DDP處理組的STAT3/pSTAT-3表達水平比DDP組低；WP1066+DDP組miR-21表達比前兩組低；通過Transwell小室聚碳酸酯膜的細胞數(shù)WP1066+DDP組少于DDP組；WP1066+DDP組細胞生長形成球的能力明顯較DDP組減弱；TIMP-3蛋白表達較前兩組升高；MMP-2/9表達水平較前兩組明顯下調。熒光素酶實驗證明WP1066+ DDP組的熒光素酶活性明顯低于DDP組和DMSO組。結論通過抑制舌癌細胞中STAT-3活性，下調miR-21表達，可以增強化療藥物抑制口腔鱗狀細胞癌的侵襲能力，為使WP1066聯(lián)合DDP化療成為靶向治療人口腔鱗狀細胞癌提供了實驗依據(jù)。

關鍵詞：癌,鱗狀細胞；口腔腫瘤；腫瘤侵潤；STAT3轉錄因子；順鉑；miR-21

鱗狀細胞癌是口腔頜面部腫瘤中最常見的病理類型。進展期口腔鱗狀細胞癌常呈浸潤性生長，并伴有頸部淋巴結轉移或遠處轉移，影響患者預后。STAT-3在口腔鱗癌中異常激活并影響腫瘤的轉移及放化療的敏感性等生物學行為[1]。Loffler等[2]在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)現(xiàn)STAT-3能夠通過促進miR-21的轉錄影響腫瘤的生長。本課題組進而研究證明WP1066抑制STAT-3的表達可以降低人舌鱗狀細胞癌的侵襲能力[3]。研究認為STAT-3極有可能成為腫瘤治療的新靶點[4-5]。順鉑（DDP）是治療人舌鱗狀細胞癌的一線藥物，但舌鱗癌對其產(chǎn)生耐藥嚴重影響治療效果，因此，逆轉化療耐藥、提高舌鱗癌對其敏感性及尋找更有效的治療靶點和藥物越來越受到關注。本文擬通過使用STAT-3小分子抑制劑WP1066拮抗STAT-3信號通路活性，探討WP1066聯(lián)合DDP治療口腔鱗癌的分子機制。

1　材料與方法

1.1材料及試劑RPMI1640培養(yǎng)基、MEM/EBSS培養(yǎng)基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；鱗狀細胞癌細胞株Tscca購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所，Tca8113P160購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。Western blot相關試劑購自上海索萊寶生物科技有限公司；PVDF膜購于瑞士羅氏公司；辣根過氧化物酶二抗購自北京天根生化科技有限公司；Western發(fā)光試劑購自美國Pierce公司。STAT-3 （CST，美國）、pSTAT-3（SAB，美國）、基質金屬蛋白酶組織抑制因子-3（TIMP-3）購自美國Santa Cruz公司，基質金屬蛋白酶2/9（MMP-2/9）及3-磷酸甘油酸（GAPDH）購自北京中杉金橋生物技術有限公司。WP1066購自德國Calbiochem公司；DDP、DMSO溶劑購自美國Sigma公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；RNA逆轉錄試劑盒購自日本Takara公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；pmiR-21熒光素酶報告載體購自美國Signosis公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和實驗分組用含10%胎牛血清的MEM/EBSS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人口腔鱗狀細胞癌細胞株Tscca，含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人口腔鱗狀細胞癌細胞株Tca8113P160，并均置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。實驗分為3組。二甲基亞砜（DMSO）組：（1）將14 μL的DMSO加入4mL的Tca8113P160細胞培養(yǎng)基內。（2）將12.4 μL的DMSO加入4mL的Tscca細胞培養(yǎng)基內。順鉑（DDP）組：（1）以DDP終濃度為0.9mg/L（半數(shù)抑制濃度，IC50）的培養(yǎng)基處理Tca8113P160。（2）以DDP終濃度為1.0mg/L（IC50）的培養(yǎng)基處理Tscca。WP1066和順鉑共處理組（WP1066+DDP組）：（1）以DDP終濃度為0.9mg/L且WP1066終濃度為3.5 μmol/L（IC50）的培養(yǎng)基處理Tca8113P160。（2）以DDP終濃度為1.0mg/L且WP1066終濃度為3.1 μmol/L（IC50）的培養(yǎng)基處理Tscca。

1.2.2舌癌細胞相關蛋白表達的檢測采用Western blot法。常規(guī)培養(yǎng)對數(shù)生長期舌癌細胞Tscca、Tca8113P160，經(jīng)3種實驗分組處理細胞24h后，加入RIPA裂解液冰上裂解30min，離心，取上清液，使用Nanodrop紫外分光光度計（Gene，美國）測定總蛋白濃度和純度，其余上清液與等體積2×上樣緩沖液混勻、煮沸，分裝并置于-80℃冰箱中保存。制膠上樣，80 V電泳40min，150 V電泳1h，4℃轉膜1.5h。實驗采用GAPDH作為內對照。GAPDH一抗（1∶2 000稀釋），STAT-3、pSTAT-3、MMP-2/9、TIMP-3一抗（1∶1 000稀釋）4℃搖床孵育過夜，PBST洗滌3次，每次5min，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1h，PBST洗去二抗，將化學發(fā)光底物滴加于聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.3舌癌細胞miR-21表達水平檢測采用實時定量PCR法。常規(guī)培養(yǎng)細胞，用3種實驗處理組分別處理細胞24h后，棄培養(yǎng)基，加1mL Trizol試劑混勻，吹下置于1.5mL離心管中；加入0.2mL氯仿，混勻，4℃、12 000 r/min離心15min，取上清液加入0.4mL異丙醇混勻，靜置10min，12 000 r/min離心20min，棄盡上清液，75%乙醇1mL洗滌3遍；7 500 r/min離心5min，棄盡上清液；加入DEPC水完全溶解，紫外分光光度計測其濃度及完整性。按試劑盒配成20 μL反轉錄體系，制成cDNA保存于-80℃；按試劑盒配成20 μL擴增體系。Opticon 3軟件計算ΔCt值，使用（2-ΔΔCt）表示miR-21相對表達量。

1.2.4舌癌細胞侵襲能力的檢測分別處理3組細胞，用無血清培養(yǎng)基制備成單細胞懸液；在Transwell板上室的聚碳酸酯膜上加入稀釋后的Matrigel（3.9 g/L）70μL，在Transwell下室中加入完全培養(yǎng)基600μL，將單細胞懸液向上室孔中加入1×104個/孔，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。待培養(yǎng)時間結束后，棄去上室液體，使用蘇木精染色，PBS清洗，DP-70熒光相差倒置顯微鏡（×100）采集圖像，選取3個視野，計算穿過膜的細胞數(shù)。

1.2.5舌癌細胞球形克隆形成能力的檢測采用Matrigel基質生長實驗檢測法。分別處理3組細胞，Matrigel基質膠置于4℃過夜溶解，24孔板每孔中預鋪100μLmatrigel基質膠，置于37℃培養(yǎng)箱30min；常規(guī)消化細胞并調節(jié)細胞密度至2×107個/L，按2∶1體積比將Matrigel與細胞懸液混合，置于37℃培養(yǎng)箱30min；加入完全培養(yǎng)基；每隔2 d更換完全培養(yǎng)基并加入WP1066、DDP，培養(yǎng)至2周，采集圖像。

1.2.6熒光素酶活性檢測將細胞接種于96孔板，待細胞貼壁后，按3種實驗組的方法處理細胞，將0.2 μg pmiR-21熒光素酶報告載體（將miR-21啟動子區(qū)域調控序列插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒）與2mL Lipofecta?min3000混勻，加入細胞，常規(guī)培養(yǎng)48h，棄去培養(yǎng)基，使用細胞裂解緩沖液充分裂解細胞20min，加入底物70 μL/孔，反應后，使用ELX800酶標儀測定熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學方法用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包處理實驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析對不同處理組的蛋白相對表達量、miR-21表達水平、克隆形成球直徑、穿過聚碳酸酯膜的細胞數(shù)目及熒光素酶實驗熒光強度進行統(tǒng)計學分析，以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1WP1066+DDP組對舌癌細胞STAT-3/pSTAT-3蛋白表達的影響WP1066+DDP處理后，Tscca、Tca8113P160舌癌細胞株STAT-3下調，pSTAT-3蛋白相對表達量較DMSO組和DDP組顯著下調，提示W(wǎng)P1066+DDP能夠有效下調pSTAT-3蛋白的表達，見圖1。

A：Tscca舌癌細胞；B：Tca8113P160舌癌細胞1：DMSO組；2：DDP組；3：WP1066+DDP組Fig.1　The expression of STAT3/pSTAT3 upon WP1066 treatment in tongue squamous carcinoma cells圖1　WP1066處理后舌癌細胞系中STAT3/pSTAT3蛋白表達

2.2WP1066+DDP組處理后miR-21的表達變化DMSO組和DDP組舌癌細胞株miR-21表達水平差異無統(tǒng)計學意義。WP1066+DDP共同處理后，舌癌細胞株miR-21表達水平較DDP組顯著下降（Tscca：F=259.750；Tca8113P160：F=301.302，均P < 0.01），見圖2。

Fig.2　The relative expression ofmiR-21 wasmeasured by RT-PCR圖2　實時定量PCR法檢測WP1066+DDP處理后miR-21的表達水平

2.3WP1066+DDP對舌癌細胞遷移能力的影響結果以穿過聚碳酸酯膜的Tscca、Tca8113P160舌癌細胞株的細胞數(shù)目表明細胞的侵襲和遷移能力。結果顯示，WP1066 + DDP組舌癌細胞Tscca和Tca8113P160均少于DMSO組和DDP組（F分別為181.691和216.766），見圖3、4。

2.4WP1066對舌癌細胞生長形成球形克隆能力的影響結果經(jīng)過15 d觀察，DDP組較DMSO組舌癌細胞克隆形成能力略有下降，DMSO組細胞生長狀態(tài)良好，WP1066+DDP處理后的細胞生長能力明顯下降，絕大多數(shù)不能貼壁生長。且WP1066+DDP組[Tscca：（58.67±9.50）μm；Tca8113P160：（111.33± 17.04）μm]克隆形成球的平均直徑明顯小于DDP組[Tscca：（121.06±19.08）μm；Tca8113P160：（216.05± 19.52）μm]和DMSO組[Tscca：（204.03±24.76）μm；Tca8113P160：（315.33±21.50）μm],（Tscca：F=44.826；Tca8113P160：F=82.615，均P < 0.01）。見圖5。

A:Tscca舌癌細胞；B：Tca8113P160舌癌細胞1：DMSO組；2：DDP組；3：WP1066+DDP組Fig.3　WP1066+DDP significantly inhibited cellmigration and invasion as shown by transwell assays圖3　舌癌細胞經(jīng)WP1066+DDP處理后侵襲和遷移能力下降（×100）

Fig.4　The number of cells thatmigrated through transwellmatrigel in two tongue squamous cell carcinoma cell lines圖4　Transwell檢測舌癌細胞穿膜細胞數(shù)目

A：Tscca舌癌細胞；B：Tca8113P160舌癌細胞1：DMSO組；2：DDP組；3：WP1066+DDP組Fig.5　WP1066 + DDP treatment inhibited cell growth onmartrigelmatrix effectively（×100）圖5　2組舌癌細胞系經(jīng)WP1066+DDP處理后Matrigel基質生長實驗克隆形成結果（×100）

2.5不同處理后舌癌細胞腫瘤侵襲相關蛋白的表達變化WP1066+DDP共同處理后，TIMP-3蛋白相對表達量較DMSO組和DDP組顯著上調，而MMP-2、MMP-9蛋白相對表達量顯著下降，提示W(wǎng)P1066+ DDP共同處理后，Tscca、Tca8113P160舌癌細胞株細胞降解細胞外基質（ECM）能力下降，見圖6。

A：Tscca舌癌細胞；B：Tca8113P160舌癌細胞1：DMSO組；2：DDP組；3：WP1066+DDP組Fig.6　Expression of invasion related proteins after WP1066+DDP treatment圖6　WP1066+DDP處理后2細胞系腫瘤侵襲相關蛋白表達水平

2.6WP1066+DDP處理后熒光素酶活性熒光素酶實驗證實WP1066+DDP處理并轉染pmiR-21熒光素酶報告載體組熒光素酶活性較DMSO組和DDP組明顯降低（Tscca：F= 425.893；Tca8113P160：F=687.809，均P < 0.01），見圖7。

Fig.7　Luciferase activity in tongue squamous cell carcinoma after transfected withmiR-21 and treated with WP1066+DDP圖7　轉染miR-21后2組舌癌細胞熒光素酶活性

3　討論

3.1STAT3在腫瘤中的作用STAT3是一種致癌性的轉錄因子，與癌細胞的增殖、侵襲及炎癥反應有著密切的關系。當激活其上游信號通路時，STAT3發(fā)生磷酸化并形成二聚體或者與其他STAT家族成員形成異二聚體。被激活的STAT3復合物轉移至細胞核內使cyclin D1、Bcl-xL、c-myc及血管內皮生長因子（VEGF）等下游靶基因發(fā)生轉錄[6]?，F(xiàn)研究已證實在頭頸部鱗癌[7]、骨髓瘤[2]、乳腺癌[8]、胰腺癌[9]、卵巢癌[10]及肺癌[11]等多種腫瘤中，STAT3增強了癌細胞的生長、侵襲及轉移能力。

3.2MiR21促進腫瘤發(fā)展MiR21轉錄自染色體17q23.2，是較為常見并被廣泛研究的miRNA之一。已在多個腫瘤中證實，miR-21過表達可以促進癌細胞的增殖、侵襲以及遷移[12]。目前的研究表明，miR-21作為人舌癌的獨立預后因子，能夠通過促進舌鱗癌細胞的生長、侵襲及轉移，影響患者的預后[13]。

3.3STAT3與miR21的關系目前，已有大量的研究表明STAT3可以直接激活miR-21。在多發(fā)性骨髓瘤細胞中，miR-21的轉錄可直接被其上游包含有2個STAT3結合位點的增強子所控制[2]。另外，白細胞介素（IL）-6誘導miR-21的產(chǎn)生是依賴STAT3完成的，敲低STAT3的表達后，會影響IL-6上調miR-21的能力[14-16]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，口腔鱗癌組織中STAT3及miR-21的表達均明顯高于瘤旁組織，并且進一步證實抑制了STAT3通路可以使受miR-21抑制的PTEN、PDCD4、TIMP-3等抑癌基因表達增高，從而影響口腔鱗癌細胞的生長和遷移能力[7]。因此，WP1066作為STAT3磷酸化水平的小分子抑制劑，有望成為口腔鱗狀細胞癌新的靶向治療藥物[17]。

3.4WP1066增強DDP抑制舌癌細胞侵襲的能力本研究主要探討WP1066增加DDP抑制人舌鱗狀細胞癌侵襲的能力。3-Dmatrigel基質生長實驗模擬了腫瘤細胞降解ECM的過程，并且在一定程度上反映了腫瘤細胞的增殖能力。WP1066+DDP聯(lián)合處理Tscca和Tca8113P160后，舌癌細胞形成球形克隆的直徑較其他2組明顯減小。Transwell體外遷移實驗模擬了細胞遷移的過程，WP1066+DDP聯(lián)合處理舌癌細胞，抑制STAT3磷酸化水平后，舌癌細胞穿過Transwell小室膜孔數(shù)明顯減少，兩舌癌細胞系的侵襲能力明顯減弱。

MMPs幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移中起關鍵性作用，其中MMP-2和MMP-9最為重要[18]。WP1066+DDP聯(lián)合處理舌癌細胞，MMP2/9表達較DDP組明顯降低，表明細胞降解ECM的能力下降，從而舌癌細胞的侵襲轉移能力也大大被削弱。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，它可以共價鍵的形式與MMPs結合成1∶1復合體，特異性抑制MMPs的活性。其中TIMP-3蛋白的表達受miR-21的抑制，WP1066+DDP聯(lián)合處理舌癌細胞，miR-21表達水平較DDP組下降明顯，并且受miR-21抑制的TIMP-3蛋白表達顯著上升。這些數(shù)據(jù)表明WP1066抑制miR-21的表達可明顯增加體外細胞系對DDP的敏感性。

綜上所述，經(jīng)WP1066和DDP聯(lián)合處理后，2個舌癌細胞系的侵襲能力明顯低于DDP單獨處理。因此，WP1066可以通過增強舌癌細胞對DDP的敏感性，從而有效抑制細胞侵襲。更重要的是，聯(lián)合治療有望降低DDP化療劑量，減少患者化療時產(chǎn)生的不良反應。通過阻滯STAT-3信號通路，增加舌癌細胞系對DDP的敏感性，使WP1066成為舌鱗狀細胞癌的靶向治療藥物，但還需體內實驗進一步探究。

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（2015-07-20收稿2015-08-03修回）

（本文編輯李鵬）

The STAT-3 inhibitor WP1066 promotes oral squamous cell carcinoma invasiveness by cisplatin in vitro

KONG Lingping1，LIU Aiqin1，ZHOU Xuan1，REN Yu2，HUANG Yuanyuan1，LIU Su1，ZHANG Lun1△
1 Department ofmaxillofacial & E.N.T（ear, nose, and throat）Oncology, Tianjinmedical University Cancer Institute andhospital; National Clinical Research Center of Cancer; Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,
Tianjin 300060, China; 2 Tianjinmedical University△Corresponding Author E-mail：zhanglun@tjmuch.com

Abstract:Objective To investigate the effect of signal transducers and activators of transcription 3（STAT-3）on sen?sitizing oral squamous cell carcinoma to cis-dichlorodiamineplatinum via downregulatingmiRNA-21.Methods Tscca and Tca8113P160human tongue squamous cell carcinoma cell lines were employed in this study.WP1066 was used to suppress STAT-3 signaling pathway.Cells were divided into three groups: dimethyl sulphoxide (DMSO) group, cis-dichlorodiamine?platinum (DDP) group and WP1066+DDP group.Transcription level ofmiR-21 was assessed by real-time PCR, while the expression levels of STAT-3, p-STAT-3, tissue inhibitor ofmetalloproteinase-3 (TIMP-3) andmatrixmetalloproteinase-2/9 (MMP-2/9 ) were evaluated by Western blot assay.Matrigelmatrix and transwell assay were used to determine cancer cell colony formation and invasive ability respectively.Expression level ofmiR-21 was examined by luciferase reporter gene as?say.Results Expression levels of STAT-3, pSTAT-3 andmiR-21 were significantly suppressed by WP1066 treatment.The diameters of culture colony in cells treated with WP1066 and DDP were smaller than those in control group.The number of tongue cancer cells thatmigrated through the transwellmembrane in WP1066 and DDP treated group was less than that in control group.Additionally,mMP- 2/9 expression decreased while TIMP- 3 increased dramatically in both cell lines in WP1066 + DPP group compared to the other two groups.ConclusionReduction of STAT-3 can sensitize oral squamous cell carcinoma to cis-dichlorodiamineplatinum via downregulatingmiR-21.Our study shows that DDP, in combination with WP1066,might be used as a potential target in the treatment ofhuman oral squamous cell cancer.

Key words:carcinoma, squamous cell；mouth neoplasms；neoplasm invasiveness；STAT3 transcription factor；cisplatin；miR-21

通訊作者△E-mail：zhanglun@tjmuch.com

作者簡介：孔令平（1988），女，碩士在讀，主要從事頭頸部鱗癌基礎研究

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81172573）

中圖分類號：R739.8

文獻標志碼：A

DOI:10.11958/20150010

作者單位:1天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院頜面耳鼻咽喉腫瘤科，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室(郵編300060)；2天津醫(yī)科大學