劉金劍，張玉民，楊翠紅，褚麗萍，黃帆，高紅林，劉鑒峰

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酸敏感阿霉素前藥納米粒的合成及其在治療腦膠質(zhì)瘤中的作用

劉金劍#，張玉民#，楊翠紅，褚麗萍，黃帆，高紅林，劉鑒峰△

摘要：目的合成一類新的具有酸敏感性能的阿霉素前藥納米粒（PEG-DOX NPs），對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并研究其在體外抗腦膠質(zhì)瘤中的作用和透過血腦屏障的效率。方法通過席夫堿反應(yīng)合成具有酸敏感的聚乙二醇-阿霉素（PEG-DOX）單體，通過自組裝制備PEG-DOX NPs。利用動態(tài)光散射（DLS）和核磁對單體進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，通過透射電鏡（TEM）對納米粒的微觀形貌進(jìn)行觀察，紫外檢測法測定PEG-DOX NPs在酸性條件下的釋放行為，熒光顯微鏡觀察腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對PEG-DOX NPs的攝取行為。利用MTT法測定PEG-DOX NPs與阿霉素（DOX）對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用。PEG-DOX NPs修飾吐溫80（PS-80）獲得PS80-PEG-DOX NPs。將9只BALB/c小鼠隨機均分為Free DOX組、PEG-DOX NPs組和PS80-PEG-DOX NPs組，利用小動物活體成像系統(tǒng)比較其修飾前后腦及主要臟器內(nèi)DOX的熒光強度。結(jié)果PEG-DOX能夠自組裝成直徑100 nm左右的納米粒；在酸性條件下PEG-DOX NPs能夠快速釋放DOX，腫瘤細(xì)胞對PEG-DOX NPs的攝取雖然比DOX慢，但蓄積時間更長；PEG-DOX NPs和Free DOX 對C6細(xì)胞的增殖抑制均呈現(xiàn)濃度依賴性，PEG-DOX NPs組細(xì)胞增殖抑制率在各個濃度下均低于Free DOX組。PS-80修飾后，PS80-PEG-DOX NPs透過血腦屏障的效率顯著高于DOX和PEG-DOX NPs組。結(jié)論PEG-DOX NPs具有良好的體外抗腫瘤作用，修飾后可高效透過血腦屏障，使其體內(nèi)治療腦膠質(zhì)瘤成為可能。

關(guān)鍵詞：血腦屏障；阿霉素前藥；納米粒；腦膠質(zhì)瘤；酸敏感

#共同第一作者

腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤簡稱腦膠質(zhì)瘤(Brain glioma)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）最常見的腫瘤，發(fā)病率約為12/100 000，據(jù)文獻(xiàn)報道其在顱內(nèi)腫瘤中所占比例為35%～60%[1-2]，是嚴(yán)重危害人類健康的疾病之一。血腦屏障（BBB）是治療腦膠質(zhì)瘤疾病中遇到的最大瓶頸，其作為鄰近內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接可以阻擋分子質(zhì)量大于500 u的物質(zhì)進(jìn)入腦中，僅能使小分子通過被動擴散的方式進(jìn)入CNS[3]。膜表面存在的特異性轉(zhuǎn)運系統(tǒng)能夠使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)，同時能夠阻止?jié)撛诘膿p害CNS的毒性物質(zhì)進(jìn)入。BBB為保護(hù)腦組織的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和CNS的正常生理功能提供了保障；然而這一屏障的存在也阻礙了治療藥物的輸送，為腦膠質(zhì)瘤的診斷和治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。本實驗針對腦膠質(zhì)瘤設(shè)計并合成了具有酸敏感的前藥納米粒，通過體外包吞試驗和細(xì)胞毒性試驗，探討其抗腫瘤作用；并探討經(jīng)修飾后的阿霉素前藥納米粒（PEG-DOX-NPs）能否有效透過BBB，進(jìn)而為體內(nèi)抗腫瘤試驗和臨床治療腦膠質(zhì)瘤提供指導(dǎo)和實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與動物醛基化聚乙二醇（mPEG-CHO，分子質(zhì)量為2 000 u）購自北京鍵凱科技有限公司；鹽酸阿霉素（DOX-HCL）購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自美國Sigma公司；其他化學(xué)試劑均購于希恩思生化科技有限公司。大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞系由南開大學(xué)孔德領(lǐng)教授惠贈。BALB/c小鼠，SPF級，雌性，平均體質(zhì)量（20.0±0.5）g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院[許可證號：SCXK- (軍) 2007-004]。所有動物實驗均遵循《實驗動物保護(hù)條例》。

1.1.2主要儀器動態(tài)光散射粒度儀（Zetasizer Nano ZS90，Malvern Instruments,英國）；1H核磁共振波譜儀（VARIAN Unity Plus 400mHz，Varian Instruments，美國）；透射電子顯微鏡（TEM；Tecani G2 F20系統(tǒng)，F(xiàn)EI，美國）；全波長酶標(biāo)儀（VARIOSKAN FLASH，Thermo scientific，美國）；活細(xì)胞工作站（DMI6000B，Leica，德國）；小動物活體成像系統(tǒng)（IS In Vi?vo FX，Care-streamhealth公司，美國）。

1.2方法

1.2.1前藥納米粒單體的合成及表征稱取200mg分子質(zhì)量為2 000 u的mPEG-CHO和50mg經(jīng)質(zhì)子化的阿霉素（DOX）[4]，將其共溶于2.0mL二甲基亞砜（DMSO）內(nèi)，加入20 μL三乙胺（Et3N）作為催化劑，40℃水浴條件下震蕩反應(yīng)24h，得到聚乙二醇-阿霉素（Polyethylene glycol-DOX, PEGDOX）。將反應(yīng)液置于截留分子質(zhì)量為1 ku的透析袋內(nèi)，DMSO作為透析液，透析48h以除去未反應(yīng)的DOX；再將透析液更換為pH 7.4的PBS溶液，透析48h以除去DMSO。將得到的酸敏感的前藥納米粒單體水分散液凍干，得到可再分散的凍干粉。通過1H核磁共振對PEG-DOX單體結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

1.2.2PEG-DOX NPs的自組裝及形貌觀察稱取PEGDOX凍干粉30mg溶于2mL DMSO內(nèi)，將溶液緩慢逐滴加入盛有10mL PBS（pH 7.4）的燒杯內(nèi)，不斷震蕩。最后將混合溶液置于截留分子質(zhì)量為3.5 ku的透析袋內(nèi)，PBS（pH 7.4）作為透析液，透析48h以除去未組裝的PEG-DOX和有機溶劑DMSO，得到前藥納米粒PEG-DOX NPs。通過TEM觀察PEG-DOX NPs在pH 5.0醋酸溶液中48h后的形貌特征。

1.2.3藥物釋放分別取2mL濃度為5.0 g/L的DOX和PEG-DOX NPs裝入截留分子質(zhì)量為3.5 ku的透析袋中，并分別置于裝有50mL PBS（pH 7.4）與pH 5.0醋酸溶液的燒杯內(nèi)。在恒溫37℃磁力攪拌條件下透析，于不同時間取出定量釋放液測定DOX的釋放率，同時向燒杯中補充相應(yīng)體積液體。利用全波長酶標(biāo)儀，紫外吸收在488 nm條件下，繪制DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定PEG-DOX NPs中DOX的濃度。利用動態(tài)光散射（DLS）測定其粒徑和表面電位，TEM觀察形貌特征。

1.2.4細(xì)胞攝取實驗取大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100mg/L鏈霉素的RM?PI1640培養(yǎng)細(xì)胞，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液。取對數(shù)生長期細(xì)胞以每孔5×105個鋪于12孔板內(nèi)，細(xì)胞生長1 d后，向孔內(nèi)加入1mL含相同DOX濃度（20mg/L）的DOX和PEG-DOX NPs，分別于孵育1.5h、4h后將孔內(nèi)液體吸出，用PBS洗3次，用配制新鮮的4%多聚甲醛固定細(xì)胞10min。吸去液體并洗2次后，用5mg/L的DAPI染細(xì)胞10min，吸去液體并更新PBS，置于熒光顯微鏡下觀察DOX和PEG-DOX NPs被細(xì)胞攝取及PEG-DOX NPs中DOX的釋放行為。

1.2.5細(xì)胞增殖抑制實驗取神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，培養(yǎng)方法參考1.2.4，取對數(shù)生長期細(xì)胞以每孔5×103個鋪于96孔板內(nèi)，細(xì)胞生長24h后，向孔內(nèi)分別加入濃度為0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5、10、20mg/L DOX和PEG-DOX NPs。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h后，每孔加入20 μL的MTT溶液（5.0 g/L）繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸棄上清后每孔加入150 μL DMSO溶液，充分震蕩后用酶標(biāo)儀測定各孔570 nm處的吸光度（A）值。每個濃度6個平行孔，計算C6細(xì)胞的增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1-樣品組A平均值/對照組A平均值）×100%。

1.2.6納米粒透過BBB實驗首先制備PS80修飾PEGDOX NPs（PS80-PEG-DOX NPs），將1%（v/v）的PS-80溶液滴加至PEG-DOX NPs溶液中，渦旋震蕩30min，現(xiàn)用現(xiàn)配。采用抽簽法將9只BALB/c小鼠隨機分為Free DOX組、PEG-DOX NPs組和PS80-PEG-DOX NPs組，各3只。每組靜脈注射劑量保持其中的DOX濃度一致，均為5.0mg/kg，于注射后8h處死并解剖小鼠，取出主要臟器，包括心、肝、脾、肺、腎和腦，利用小動物活體成像系統(tǒng)進(jìn)行組織熒光成像及熒光定量分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PEG-DOX單體的合成及納米粒組裝和表征PEG-DOX單體的合成見圖1。DOX的氨基（-NH2）與PEG的醛基（-CHO）在Et3N催化條件下反應(yīng)得到具有席夫堿鍵的聚合物PEG-DOX單體。mPEG-CHO與PEG-DOX的核磁圖譜見圖2，其中圖2A中9.6位置的CHO峰在圖2B中消失，證明醛基被反應(yīng)掉，PEG-DOX單體成功合成。通過DLS 和TEM表征PEG-DOX NPs的粒徑約為100 nm，見圖3A，分布指數(shù)（PDI）為0.188，表面電位-5.81mV。TEM下其形貌為均一的球形，見圖3B。

Fig.1　The synthesis of PEG-DOX copolymer圖1　PEG-DOX單體的合成

Fig.2　1H NMR spectra ofmPEG-CHO (A) and PEG-DOX (B)圖2　mPEG-CHO（A）和PEG-DOX單體（B）的1H核磁圖譜

Fig.3　Hydrodynamic size distributions (A) and TEM images (B,×7 200) of PEG-DOX NPs圖3　PEG-DOX NPs的粒徑分布（A）和形貌（B;TEM,×7 200）

2.2藥物釋放PEG-DOX NPs在pH 5.0的酸性條件下48h的累積釋放率約為70%，而在pH 7.4的條件下48h的累積釋放率低于20%，見圖4A。PEGDOX NPs在pH 5.0醋酸溶液中48h后，TEM下其形貌呈不規(guī)則形態(tài)，說明其解體后發(fā)生聚集，見圖4B。

Fig.4　Drug release profiles of PEG-DOX-Cur NPs (A) andmorphology of PEG-DOX NPs after incubation at pH 5.0 for 48h (B,×7 200)圖4　PEG-DOX NPs和DOX的釋放曲線（A）和PEG-DOX NPs在pH 5.0醋酸溶液中48h的形貌（B; TEM,×7 200）

2.3細(xì)胞攝取實驗孵育1.5h后，F(xiàn)ree DOX大量被細(xì)胞所攝取并直接進(jìn)入核內(nèi)，而PEG-DOX NPs主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，核內(nèi)基本沒有DOX的熒光。在與C6細(xì)胞作用4h后，F(xiàn)ree DOX在胞內(nèi)的信號相對1.5h時明顯減弱，而PEG-DOX NPs組在細(xì)胞核內(nèi)的熒光信號顯著增強，大量的DOX進(jìn)入了細(xì)胞核，熒光強度明顯強于Free DOX組，表現(xiàn)出較強的細(xì)胞攝取性能，同時證明PEG-DOX NPs已經(jīng)在細(xì)胞內(nèi)降解并釋放出了DOX，見圖5。

2.4細(xì)胞增殖抑制實驗PEG-DOX NPs和Free DOX對C6細(xì)胞的增殖抑制均呈現(xiàn)濃度依賴性，即DOX濃度越高，其增殖抑制率越高，見圖6。PEGDOX NPs組細(xì)胞增殖抑制率在各個濃度下均低于Free DOX組（t值分別為12.70、5.14、10.20、14.04、7.31、8.85、4.29和7.38，均P < 0.05）。

2.5納米粒透過BBB實驗Free DOX、PEG-DOX NPs和PS80-PEG-DOX NPs靜脈注射8h后主要臟器的熒光成像見圖7A，可見DOX的熒光信號主要分布在肝、腎和腦中；且PS80-PEG-DOX NPs組在腦中的藥物熒光強度明顯高于PEG-DOX NPs和Free DOX組（F=108.25，n=3，P＜0.05），見圖7B，表明經(jīng)PS80修飾后的PEG-DOX NPs能夠更多地透過BBB。

Fig.5　Cellular uptake and localization of Free DOX and PEG-DOX NPs inhepG 2 cancer cells圖5　C6細(xì)胞對Free DOX和PEG-DOX NPs在不同時間的攝取結(jié)果

1～8分別為0.16、0.31、0.625、1.25、2.5、5、10、20mg/LFig.6　The cytotoxicity of Free DOX, and PEG-DOX NPs against C6 cancer cells圖6　PEG-DOX NPs和Free DOX對C6細(xì)胞的增殖抑制實驗

3　討論

前藥納米粒能夠有效提高疏水藥物的水溶性，延長體內(nèi)循環(huán)時間，其獨特的納米結(jié)構(gòu)能夠使其通過增強滲透滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）來提高腫瘤組織中藥物富集量，同時酸敏感的特性能夠顯著降低藥物在正常組織中的釋放，從而在保證提高抗腫瘤作用的同時降低機體不良反應(yīng)[5-6]。本研究中所合成的PEG-DOX單體中的DOX具有疏水性質(zhì)，而PEG具有親水性，因此可以在水溶液中通過自組裝形成前藥納米粒。PEG-DOX NPs在pH 5.0條件下的DOX釋放率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在pH 7.4條件下的釋放率，主要是因為PEG-DOX NPs的酸敏感性能所造成的，席夫堿鍵在酸性條件下會發(fā)生響應(yīng)性的斷裂，從而導(dǎo)致PEG-DOX NPs的解體，進(jìn)而釋放藥物。游離DOX為小分子，因此可以迅速透過分子質(zhì)量為3.5 ku的透析袋，在短時間內(nèi)幾乎完全釋放出來。這類pH響應(yīng)性的化學(xué)鍵能夠保證PEG-DOX NPs在pH 7.4的血液中足夠穩(wěn)定，DOX不能發(fā)揮藥效，從而對正常組織起到保護(hù)作用；而前藥納米粒一旦進(jìn)入腫瘤內(nèi)，由于腫瘤組織內(nèi)是酸性的微環(huán)境，可以迅速將化學(xué)鍵打開，釋放大量DOX，從而可以提高對腫瘤組織的殺傷，提高藥效[7]。

a與Free DOX組比較，b與PEG-DOX NPs組比較，P < 0.05 Fig.7 The ex vivo fluorescence images of Free DOX, PEG-DOX NPs and PS80-PEG-DOX NPs (A), and themean fluorescence intensity of brain (B)圖7　Free DOX、PEG-DOX NPs及PS80-PEG-DOX NPs在小鼠體內(nèi)的組織分布（A）及腦組織內(nèi)單位面積平均熒光信號強度（B）

DOX對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用主要是通過插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，進(jìn)而阻止腫瘤細(xì)胞的復(fù)制，因此DOX必須進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)才能發(fā)揮藥效。MTT結(jié)果顯示Free DOX較PEG-DOX NPs具有更高的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果，與常規(guī)的載藥納米粒對細(xì)胞的增殖抑制的結(jié)果一致，這主要是由于不同的細(xì)胞攝取機制導(dǎo)致的[8]。DOX可以直接通過被動擴散被腫瘤細(xì)胞攝取，因此可以快速進(jìn)入細(xì)胞并分布于細(xì)胞核發(fā)揮藥效。前藥納米粒主要通過比較慢的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞后納米粒崩解，DOX被釋放后才會發(fā)揮藥效，因此體外作用時間較短，導(dǎo)致藥效降低，但體內(nèi)應(yīng)用可以降低不良反應(yīng)，而且納米粒的EPR效應(yīng)能夠使更多的DOX進(jìn)入腫瘤組織，將會產(chǎn)生比DOX更高的藥效。

前藥納米粒系統(tǒng)可以依賴于受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機制透過BBB，并將藥物遞送至腦膠質(zhì)瘤[9]，即通過腦內(nèi)皮原生質(zhì)膜上過表達(dá)的受體，包括轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、胰島素受體、內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體和低密度脂蛋白受體等[10]。基于受體-配體特異性靶向結(jié)合的作用，可以選擇相關(guān)受體的配體或一些表面活性劑修飾前藥納米粒[11]，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機制實現(xiàn)前藥納米粒高效透過BBB，并通過EPR效應(yīng)將藥物靶向遞送至腦膠質(zhì)瘤。本實驗體內(nèi)組織分布結(jié)果證實，經(jīng)過PS80修飾的前藥納米粒能夠有效透過BBB，腦組織的藥物濃度明顯高于未修飾組，主要原因是PS80包裹PEG-DOX NPs后，在血液循環(huán)中能夠高效地募集輔基質(zhì)蛋白（ApoE），模擬低密度脂蛋白（LDL）粒子通過LDL受體介導(dǎo)的跨細(xì)胞作用有效穿透BBB[12]。同時經(jīng)過PS80表面修飾后，能夠有效避免P-糖蛋白（P-gp）的捕捉[13]，避免了進(jìn)入腦內(nèi)的藥物被排出，本實驗的修飾方法比受體修飾的方法更加簡單有效。該系統(tǒng)有望成為臨床治療腦膠質(zhì)瘤有效的前藥納米載體系統(tǒng)。

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（2015-08-14收稿2015-09-11修回）

（本文編輯陳麗潔）

Synthesis of acid-sensitive doxorubicin prodrug nanoparticle and its application in brain glioma treatment

LIU Jinjian#, ZHANG Yumin#, YANG Cuihong, CHU Liping ,hUANG Fan, GAOhonglin, LIU Jianfeng△
Tianjin Key Laboratory of Radiationmedicine andmolecular Nuclearmedicine, Institute of Radiationmedicine, Chinese Academy ofmedical Science and Peking Unionmedical College, Tianjin 300192, China
△Corresponding Author E-mail:lewis78@163.com

Abstract:Objective To synthesize a new kind of acid-sensitive doxorubicin prodrug nanoparticles and to evaluate its anti-brain glioma effect and efficiency through blood-brain barrier (BBB).Methods The prodrug acid-sensitive poly?ethylene glycol (PEG) - doxorubicin (PEG-DOX) copolymer was synthesized by Schiff base reaction, and PEG-DOX pro?drug nanoparticles (PEG-DOX NPs) were prepared by self-assembling.The character of PEG-DOX copolymer was detected by dynamic light scattering (DLS) instrument and1H NMR.Themorphology of PEG-DOX NPs was observed by transmission electronmicroscopy (TEM).The character of drug release was detected by UVmothed.The cellular uptake efficiency of glio?ma cells to PEG-DOX NPs was observed by inverted fluorescencemicroscope.The anti-brain glioma effects of PEG-DOX NPs and Free DOX were studied bymTTmothed.PS80-PEG-DOX NPs were gained by themodification of PEG-DOX NPs with Tween 80.Nine BALB/cmice were separated into Free DOX, PEG-DOX NPs and PS80-PEG-DOX NPs groups by ran?dom drawing lots.Themean fluorescence intensity of brain andmain organs were observed by in vivo imaging system.Re?sults The copolymer of PEG-DOX can self-assemble into nanoparticles with the diameter of 100 nm.PEG-DOX NPs can quickly release DOX in acid environment.Although PEG-DOX NPshad slow cancer cell uptake than Free DOX, ithad lon?book=34,ebook=39ger accumulation.MTT results showed that PEG-DOX NPshad concentration dependent anti-brain glioma effect.Indepen?dent samples t-test indicated that the efficiency through BBB was significantlyhigher in PS80-PEG-DOX NPs group than that of Free DOX group and PEG-DOX NPs group.Conclusion PEG-DOX NPs show well anti-brain glioma effect in vi?tro, and can across BBB withhigh efficiency aftermodification, whichmake it possible for a potential therapeutic prodrug for brain glioma.

Key words:blood-brain barrier; doxorubicin prodrug; nanoparticle; brain glioma; acid-sensitive

通訊作者△E-mail: lewis78@163.com

作者簡介：劉金劍（1981），男，助理研究員，主要從事自組裝納米材料、分子核醫(yī)學(xué)研究

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（51203189，51303213，81171371）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃重點項目（13JCZD?JC28100）；“協(xié)和青年基金資助”和“中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助”（3332015100）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所發(fā)展基金（1550，1428）

中圖分類號：R318.08

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/20150109

作者單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室（郵編300192）