汪江林

摘 要：采用實(shí)驗(yàn)的方法探析了高產(chǎn)丁醇菌種的選育及其代謝副產(chǎn)物對(duì)丁醇發(fā)酵的影響，以供相關(guān)單位參考。

關(guān)鍵詞：高產(chǎn)丁醇菌種；代謝副產(chǎn)物；汽油；能量密度

中圖分類號(hào)：TQ923 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.15913/j.cnki.kjycx.2016.03.124

丁醇是重要的有機(jī)溶劑，在化工、醫(yī)藥、材料和印染等行業(yè)有非常廣泛的應(yīng)用。由于石油、煤炭等資源引發(fā)的環(huán)境問(wèn)題、能源問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，全世界都在尋求一種能代替化石燃料，并能降低CO2排放的新型能源。而生物丁醇作為典型的生物質(zhì)能源，可以與汽油混合使用，具有與汽油配伍性良好、能量密度高等眾多優(yōu)點(diǎn)，受到了社會(huì)各界的高度重視。高產(chǎn)丁醇菌種能利用非糧食類原料生產(chǎn)丁醇，這樣能有效降低生產(chǎn)成本，因此，高產(chǎn)丁醇菌種的選育已成為國(guó)內(nèi)外研究人員探索和研究的重點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌種來(lái)源

實(shí)驗(yàn)采用的丁醇菌種為某地郊區(qū)樹(shù)下的深層土壤。

1.2 主要儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)采用的儀器設(shè)備包括7683B氣相色譜儀、電子秤、光學(xué)顯微鏡、試管、滴定管、離心管、冷凝管、恒溫水浴鍋、電子恒偉電熱套、可見(jiàn)光分光光度計(jì)、電磁爐、培養(yǎng)箱、干燥箱、酸度計(jì)、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、恒溫振蕩器和高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.3 配置培養(yǎng)基

高產(chǎn)丁醇菌種的培養(yǎng)基包括以下3種：①富集培養(yǎng)基。采用電子秤稱量65 g的玉米粉，加入1 500 mL的燒杯中煮沸呈糊狀，糊狀物剩1 000 mL時(shí)通入氮?dú)?，并分別裝入100 mL的厭氧瓶中。②分離培養(yǎng)基。在固體滾管中加入質(zhì)量濃度為15 g/L的瓊脂、質(zhì)量濃度為2.0 g/L的蛋白胨、質(zhì)量濃度為0.5 g/L的磷酸氫二鉀、質(zhì)量濃度為1.0 g/L的氯化鈉、質(zhì)量濃度為0.2 g/L的七水合硫酸鎂、20 g的葡萄糖。③發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分為體積分?jǐn)?shù)為1.0 mL/L的維生素溶液、質(zhì)量濃度為3.0 g/L的酵母提取物、質(zhì)量濃度為0.4 g/L的七水合硫酸鎂、質(zhì)量濃度為1.5 g/L的氯化銨、2.7 g的磷酸二氫鉀、質(zhì)量濃度為65 g/L的葡萄糖、質(zhì)量濃度為0.5 g/L的半胱氨酸。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 高產(chǎn)丁醇菌種的富集和篩選

在持續(xù)通氮的條件下，將土壤放入?yún)捬跖囵B(yǎng)瓶中并振蕩，直至土壤中的芽孢全部釋放；取上清液煮沸，將活體細(xì)胞全部殺死，用注射器吸取10 mL的上清液，移入富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，靜置5 d左右；將靜置后的上清液加入新的富集培養(yǎng)基中，反復(fù)3次；當(dāng)菌群覆蓋培養(yǎng)瓶時(shí)，表明菌群生長(zhǎng)良好，選取1 mL上清液加入分離培養(yǎng)基中，靜置2 d；緩慢地沿一個(gè)方向轉(zhuǎn)動(dòng)試管，使菌液均勻的鋪在培養(yǎng)基上，靜置2 d；用氮?dú)忉樚羧∩L(zhǎng)良好的單菌落加入液體培養(yǎng)基中，并通過(guò)顯微鏡觀察菌體的形態(tài)。

1.4.2 高產(chǎn)丁醇菌種的鑒定

高產(chǎn)丁醇菌種的鑒定可采取以下2種方法：①形態(tài)學(xué)觀察和鑒定。在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，呈梭狀為合格。②分子生物學(xué)鑒定。取對(duì)數(shù)期的菌液3 mL，離心5 min，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA，以16S rDNA為引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，并回收和純化細(xì)菌16S rDNA；以pMD18-T為轉(zhuǎn)化載體，在室溫條件下反應(yīng)2 h，然后加入100 μL的感受態(tài)細(xì)胞T1中，并在42 ℃的水浴中加熱50 s后迅速放入冰水浴中冷卻；添加250 μL的培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 h；添加Amp，培養(yǎng)30 min；當(dāng)X-gal和IPTG吸收完畢后，取150 μL的菌液培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間必須<12 h；通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)選，取呈陽(yáng)性的菌液，并在具有相應(yīng)資質(zhì)的實(shí)驗(yàn)室測(cè)序。

2 代謝副產(chǎn)物對(duì)丁醇發(fā)酵的影響分析

代謝副產(chǎn)物對(duì)丁醇發(fā)酵的影響分析分為以下3步：①當(dāng)實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)編號(hào)為S12的菌株的丁醇生產(chǎn)能力最優(yōu)秀時(shí)，利用分子鑒定手段對(duì)菌株S12進(jìn)行了鑒定，并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)相應(yīng)的序列比對(duì)確定了S12的菌類。②實(shí)驗(yàn)人員在確定最佳時(shí)間的過(guò)程中，合理結(jié)合形態(tài)學(xué)的觀察方法發(fā)現(xiàn)，丁醇的質(zhì)量濃度為5.212 g/L，相比于優(yōu)化前的 5.017 g/L，這一產(chǎn)量提升在第16小時(shí)最明顯；在培養(yǎng)基成分中，七水合硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖對(duì)菌株S12的產(chǎn)丁醇發(fā)酵有明顯的影響。通過(guò)菌株S12的生長(zhǎng)曲線測(cè)定可得到相應(yīng)的理想時(shí)間點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，七水合硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖的最適添加質(zhì)量濃度分別為0.39 g/L、2.7 g/L和64.69 g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，丁醇的產(chǎn)量達(dá)到了4.21 g/L，比原產(chǎn)量提高了3.5%.③實(shí)驗(yàn)人員通過(guò)在不同細(xì)菌生長(zhǎng)期添加有機(jī)酸，確定了菌株S12接受代謝副產(chǎn)物調(diào)控的最佳時(shí)間為對(duì)數(shù)期末期，且在這一過(guò)程中，可利用響應(yīng)面來(lái)分析不同因素對(duì)丁醇生產(chǎn)的影響。丁酸對(duì)丁醇的促進(jìn)能力比乙酸高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，丁醇的最終產(chǎn)量為5.808 g/L，比以往提升了38.24%.

3 結(jié)論

綜上所述，丁醇作為一種重要的化學(xué)工業(yè)原料，得到了廣泛應(yīng)用。丁醇發(fā)酵的相關(guān)研究對(duì)丁醇的進(jìn)一步應(yīng)用有著極為重要的意義。因此，技術(shù)人員應(yīng)對(duì)丁醇菌種的選育及其代謝副產(chǎn)物對(duì)丁醇發(fā)酵的影響有清晰的了解，從而使丁醇在未來(lái)得到更加合理的應(yīng)用。

本文以某地區(qū)樹(shù)下深層土壤的丁醇菌種為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，編號(hào)為S12的菌株生產(chǎn)丁醇的能力最強(qiáng)，并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定的方法，將S12作為一種菌種，用于丁醇的高效發(fā)酵和生產(chǎn)。在培養(yǎng)基中添加七水合硫酸鎂、磷酸二氫鉀、葡萄糖對(duì)丁醇發(fā)酵的影響比較明顯，可提高丁醇的產(chǎn)量。此外，復(fù)合有機(jī)酸對(duì)丁醇的發(fā)酵有一定的影響，且乙酸的促進(jìn)能力低于丁酸，添加合適濃度的丁酸能提高丁醇的產(chǎn)量。

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〔編輯：張思楠〕