戴蕓蕓，鐘衛(wèi)鴻

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310032)

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細(xì)菌降解木質(zhì)纖維素的研究進(jìn)展

戴蕓蕓，鐘衛(wèi)鴻

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310032)

摘要：木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性導(dǎo)致其生物降解需要多種微生物協(xié)同完成。細(xì)菌具有生長(zhǎng)快、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、適宜酸堿性條件生長(zhǎng)等特點(diǎn)，在降解木質(zhì)纖維素方面具有潛在應(yīng)用前景。介紹了近年來(lái)報(bào)道的降解木質(zhì)纖維素的細(xì)菌種類(lèi)，綜述了細(xì)菌對(duì)木質(zhì)纖維素的降解機(jī)理及木質(zhì)纖維素含量的測(cè)定方法。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌；木質(zhì)素；纖維素；生物降解

生物質(zhì)作為一種可再生資源，其開(kāi)發(fā)利用是解決目前人類(lèi)能源危機(jī)的重要途徑之一，但是其主要成分天然纖維質(zhì)原料的結(jié)晶性和木質(zhì)化限制了其可利用性[1]。木質(zhì)纖維素包括三大類(lèi)聚合物：木質(zhì)素、半纖維素與纖維素。纖維素的纖絲在高等植物細(xì)胞壁維管組織中與木質(zhì)素和半纖維素通過(guò)共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵緊密纏繞相互嵌合，形成木質(zhì)纖維素。木質(zhì)纖維素在不同種、不同年齡及同一植物的不同部位的數(shù)量和種類(lèi)都會(huì)有所不同。一般來(lái)說(shuō)，木質(zhì)纖維素含纖維素39%、半纖維素30%、木質(zhì)素25%[2]。

纖維素是以纖維二糖(葡萄糖-β-1，4-葡萄糖)為基本重復(fù)單元，由成千上萬(wàn)個(gè)葡萄糖分子組成的線狀多聚物。纖維素鏈中β-1，4連接的葡萄糖殘基相對(duì)鄰近單位旋轉(zhuǎn)180°，鏈內(nèi)以氫鍵維持穩(wěn)定。在一般植物纖維中，微晶纖維素約占70%，另30%為無(wú)定形纖維素[3]。纖維素在種屬間結(jié)構(gòu)變化很小。半纖維素高度分枝且一般是非結(jié)晶狀多糖，較纖維素和木質(zhì)素更易降解。木質(zhì)素存在于較高等植物(裸子植物和被子植物)、蕨類(lèi)植物與石松的細(xì)胞壁中，主要在維管組織中負(fù)責(zé)液體的運(yùn)輸，而在無(wú)管胞的苔蘚、地衣、藻類(lèi)中無(wú)木質(zhì)素[4]。木材組織的木質(zhì)化作用主要是指生長(zhǎng)中的木質(zhì)素分子填滿細(xì)胞壁中還未完全形成的纖維素纖絲及半纖維素鏈之間空間的過(guò)程，可提高木材組織的機(jī)械強(qiáng)度。木質(zhì)素是地球上數(shù)量最多的芳香族聚合物[5]，是一種分子量很大的由苯丙烷單位隨機(jī)構(gòu)成的不規(guī)則的多聚物(圖1)[6]，由對(duì)位取代的苯丙烯羧醇——香豆醇、松伯醇和芥子醇的連續(xù)苯氧基反應(yīng)形成，其生物降解要依靠一系列自由基介導(dǎo)的反應(yīng)完成，因而，木質(zhì)素較纖維素和半纖維素更難降解。在植物組織中，木質(zhì)纖維素的各聚合物之間通過(guò)共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵結(jié)合，形成堅(jiān)固的天然屏障將纖維素分子包埋其中，使一般微生物很難進(jìn)入其中分解纖維素。所以，木質(zhì)素降解的順利與否也是能否有效利用纖維素的關(guān)鍵。

在降解木質(zhì)纖維素的微生物中，霉菌的降解能力較細(xì)菌強(qiáng)，但因霉菌生長(zhǎng)緩慢、相關(guān)酶類(lèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜且熱穩(wěn)定性較差、不耐堿性條件，使得以霉菌為主要模式菌株的木質(zhì)纖維素生物降解途徑未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。因此，急需尋找其它種類(lèi)的模式菌株或降解途徑[7]。真菌中有小部分酵母也具有降解木質(zhì)纖維素的能力，但國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道較少，主要是因?yàn)槠浣到饽芰^弱。放線菌在一定程度上能改變木質(zhì)素的分子結(jié)構(gòu)，繼而分解溶解了的木質(zhì)素，但它很少利用纖維素，而且放線菌與真菌相似，繁殖均要較長(zhǎng)時(shí)間。細(xì)菌具有來(lái)源更廣、種類(lèi)更多、生長(zhǎng)更快等優(yōu)點(diǎn)，且生長(zhǎng)溫度和適應(yīng)pH值很寬，能在各種極端環(huán)境生存，在木質(zhì)纖維素降解方面顯現(xiàn)了潛在的應(yīng)用前景，降解效果較好[8-9]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)細(xì)菌降解木質(zhì)纖維素的研究報(bào)道較少，且由于木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，至今未能直接檢測(cè)，尤其是木質(zhì)素的檢測(cè)，所建立的相關(guān)檢測(cè)模型也僅針對(duì)某一種植物。鑒于此，作者對(duì)近年來(lái)報(bào)道的降解木質(zhì)纖維素的細(xì)菌種類(lèi)、細(xì)菌降解機(jī)理及木質(zhì)纖維素含量的測(cè)定方法進(jìn)行綜述，擬為細(xì)菌降解木質(zhì)纖維素的深入研究提供幫助。

1降解木質(zhì)纖維素的細(xì)菌種類(lèi)

1.1降解木質(zhì)素的細(xì)菌

木質(zhì)素是自然界中含量?jī)H次于纖維素的有機(jī)物。因其致密的結(jié)構(gòu)可抵御一般水解酶的作用而成為目前微生物界公認(rèn)的難降解芳香族化合物之一。利用微生物降解木質(zhì)素不僅具有環(huán)保、后續(xù)污染少等優(yōu)點(diǎn)，還能實(shí)現(xiàn)資源的再利用。能降解木質(zhì)素的細(xì)菌主要包括不動(dòng)桿菌屬、新鞘氨醇桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞桿菌屬、芽孢桿菌屬和叢毛單胞菌屬等，如表1所示。

表1降解木質(zhì)素的細(xì)菌

1.2降解纖維素的細(xì)菌(表2)

表2降解纖維素的細(xì)菌

從生理學(xué)角度可將纖維素降解細(xì)菌分為可發(fā)酵的厭氧菌(代表屬有高溫厭氧桿菌屬、芽孢梭菌屬、熱解纖維素菌屬等)和好氧菌(代表屬有好氧革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和好氧滑動(dòng)細(xì)菌)。

1.3降解木質(zhì)纖維素的細(xì)菌

Ventorino等[23]在研究蔬菜生物質(zhì)降解動(dòng)力學(xué)及木質(zhì)纖維素降解細(xì)菌的工業(yè)應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)，BacillusamyloliquefaciensCA81及LysobacterenzymogenesCE71不僅具有纖維素酶活性，也具有漆酶活性。Thompson等[24]報(bào)道了一株嗜熱嗜酸細(xì)菌Alicyclobacillusacidocaldarius，當(dāng)pH值小于7和溫度高于50 ℃時(shí)均能高效降解木質(zhì)纖維素。Aston等[25]還特別研究了Alicyclobacillusacidocaldarius在降解酚類(lèi)物質(zhì)時(shí)所展現(xiàn)出的高木質(zhì)素降解相關(guān)酶活性。其它報(bào)道的能降解木質(zhì)纖維素的細(xì)菌如表3所示。

表3降解木質(zhì)纖維素的細(xì)菌

2細(xì)菌對(duì)木質(zhì)纖維素的降解機(jī)理

2.1纖維素的降解機(jī)理

目前較為大家熟知的是通過(guò)胞外游離纖維素酶起作用的以瑞氏木霉為部分好氧真菌代表的降解模式，以及通過(guò)復(fù)合纖維小體(cellulosome)起作用的以熱線梭菌為部分厭氧細(xì)菌代表的降解模式。楊騰騰等[28]發(fā)現(xiàn)了第三種降解模式——細(xì)胞結(jié)合型非復(fù)合體纖維素降解模式，即通過(guò)細(xì)胞表面的非游離纖維素酶來(lái)實(shí)現(xiàn)纖維素的降解。這是以哈氏噬纖維細(xì)菌(Cytophagahutchinsonii)為代表的部分好氧菌和以產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobactersuccinogenes)為代表的部分厭氧菌可能具有的獨(dú)特纖維素降解方式。

以上3種降解機(jī)制中，細(xì)菌對(duì)纖維素的降解主要是通過(guò)細(xì)菌分泌的纖維素酶以復(fù)合纖維小體上的纖維素結(jié)合域(CBD)附著在細(xì)胞壁的表面，被細(xì)菌吸附的纖維素因受到細(xì)菌直接的物理或化學(xué)作用而易于膨脹、被破壞，進(jìn)而分解整個(gè)纖維素結(jié)構(gòu)[29]。

2.2木質(zhì)素的降解機(jī)理

木質(zhì)素分子一般結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分子量大，所以，微生物主要通過(guò)產(chǎn)生胞外酶對(duì)其進(jìn)行非特異氧化降解。部分細(xì)菌中存在完整的木質(zhì)素降解酶體系，主要包括木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiP)、錳過(guò)氧化物酶(MnP)與漆酶(Lac)。LiP在H2O2的驅(qū)動(dòng)下從木質(zhì)素的酚型或非酚型苯環(huán)上奪取電子將其氧化成苯氧自由基，再通過(guò)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)生的不同自由基來(lái)促使木質(zhì)素分子結(jié)構(gòu)中主要鍵的斷裂。MnP在H2O2的驅(qū)動(dòng)下將Mn2+氧化成Mn3+，Mn3+再通過(guò)與有機(jī)酸的螯合作用形成一種穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，在該結(jié)構(gòu)的作用下，木質(zhì)素中的酚型苯環(huán)被氧化成苯氧自由基，從而使芳香環(huán)和Cα之間化學(xué)鍵發(fā)生斷裂而降解木質(zhì)素。Lac不需要H2O2的驅(qū)動(dòng)，有O2存在時(shí)即可催化木質(zhì)素中酚類(lèi)化合物的連續(xù)單電子氧化，并在氧化過(guò)程中將分子氧還原成水[15，30]。

細(xì)菌通過(guò)分泌與真菌類(lèi)似的木質(zhì)素降解酶系來(lái)降解木質(zhì)素，同時(shí)，細(xì)菌具有簡(jiǎn)單的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、較小的細(xì)胞尺寸，易穿透木質(zhì)素與其結(jié)合起作用，從而將木質(zhì)素降解為低分子量的聚合木質(zhì)素片斷，增強(qiáng)木質(zhì)素的溶解性等功能[31]。

3木質(zhì)纖維素含量的測(cè)定方法

3.1纖維素含量的測(cè)定方法

纖維素含量的測(cè)定方法主要包括凡氏法及由其延伸的酸堿醇處理法[32]、重鉻酸鉀法[33]、差重法[34]等。

國(guó)內(nèi)外對(duì)纖維素含量的測(cè)定方法進(jìn)行了大量研究。早在1970年，Goering 等[35]就提出動(dòng)植物材料分為中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維及酸不溶木質(zhì)素，這是較早的關(guān)于纖維素分類(lèi)的報(bào)道。中性及酸性洗滌纖維是去除樣品中的淀粉、脂肪、糖類(lèi)和蛋白質(zhì)等成分后所殘留的不溶物質(zhì)的總稱，包括絕大部分的纖維素、部分木質(zhì)素和少量的硅酸鹽等[36]。它們的主要區(qū)別在于所用洗滌劑種類(lèi)及纖維素成分的不同。之后，越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者在此基礎(chǔ)上對(duì)纖維素含量測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)。崔宗均在1989年提出用醋酸-硝酸試劑處理固體纖維素底物(經(jīng)微生物處理過(guò)的)，然后用清水去除非纖維素物質(zhì)，再采用重量法綜合測(cè)定纖維素含量[37-38]。酸堿醇處理法、重鉻酸鉀法、差重法的測(cè)定前提均是要求將生物質(zhì)原料經(jīng)過(guò)不同酸堿醇處理后再進(jìn)行后續(xù)操作。如重鉻酸鉀法是將生物質(zhì)粉末在加熱的情況下用醋酸、硝酸和重鉻酸鉀等處理，將纖維素分解成單個(gè)纖維，再除去木質(zhì)素、半纖維素和其它物質(zhì)；差重法是用酸堿等處理后，再依據(jù)相互之間的差值進(jìn)行含量測(cè)定。

在這些測(cè)定方法中，凡氏法是根據(jù)纖維素的不同性質(zhì)分別測(cè)定樣品中各種纖維素類(lèi)物質(zhì)的含量；而酸堿醇處理法、重鉻酸鉀法、差重法等測(cè)定的是以纖維素為主、含有少量半纖維素和木質(zhì)素的一個(gè)不確切的化學(xué)實(shí)體，主要用于比較同一測(cè)量體系中各種纖維素類(lèi)物質(zhì)的含量。因此，凡氏法測(cè)定的纖維素含量更接近生物質(zhì)中纖維素的真實(shí)含量。

3.2木質(zhì)素含量的測(cè)定方法

木質(zhì)素是含量?jī)H次于纖維素的可再生資源。木質(zhì)素含量的測(cè)定一般分為直接測(cè)定法(硫酸木質(zhì)素法，主要針對(duì)酸不溶木質(zhì)素)和間接測(cè)定法(紫外分光光度法、反相高效液相色譜法、紅外光譜定量分析法等)。下面主要介紹間接測(cè)定法。

3.2.1紫外分光光度法

木質(zhì)素是以苯丙烷為基本結(jié)構(gòu)單元組成的生物有機(jī)大分子，全波長(zhǎng)掃描顯示它在200～300 nm之間有強(qiáng)的紫外特征吸收峰，所以可用紫外分光光度法測(cè)定木質(zhì)素含量。首先，木質(zhì)素在280 nm附近有很強(qiáng)的吸收，其次是210 nm，同時(shí)在230 nm和320 nm附近有弱吸收。其中，210 nm處是共軛烯鍵的吸收帶，280 nm處是芳香環(huán)中不可取代的m-位置引起的吸收帶。此吸收值基本遵從朗伯-比耳定律，所以可選擇280 nm作為木質(zhì)素的定量測(cè)定波長(zhǎng)[18，39]。

3.2.2反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜法的基本原理是木質(zhì)素與硫酸亞鐵銨水合物和堿性氧化銅在高溫條件下使待測(cè)樣品生成酚類(lèi)化合物，然后經(jīng)堿、酸、醚、醇等處理后進(jìn)樣檢測(cè)。Pecina等[40]采用反相高效液相色譜法清晰地檢測(cè)出木質(zhì)素的9種降解產(chǎn)物，色譜條件為：Nucleosil 5 RP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.01 mol·L-1KH2PO4(pH=2)緩沖溶液，流速0.8 mL·min-1，柱溫50 ℃，進(jìn)樣量25 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，梯度洗脫：0～45 min，甲醇5%～50%；45～50 min，甲醇50%～70%。Chandra等[41]采用HPLC法檢測(cè)3種細(xì)菌處理造紙廢液木質(zhì)素的降解產(chǎn)物。用濃H2SO4酸化樣品至pH值為1～2，再用乙酸乙酯萃取3次，進(jìn)樣測(cè)定，HPLC條件為：反相C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(70∶30，體積比)，流速0.8 mL·min-1，柱溫27 ℃。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)6 d的降解，樣品的峰強(qiáng)度較對(duì)照組明顯減弱，而且未產(chǎn)生其它新峰，表明該細(xì)菌確實(shí)能降解木質(zhì)素，且不會(huì)形成其它的降解產(chǎn)物。

3.2.3紅外光譜定量分析法

紅外光譜在20世紀(jì)50年代就已被廣泛應(yīng)用于木質(zhì)素含量的測(cè)定，到80年代許多研究人員開(kāi)始利用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)分析木質(zhì)素及其模型化合物[42-43]。如Robinson等[44]利用紅外光譜技術(shù)預(yù)測(cè)白楊木質(zhì)素單體的組成，取得了較好的效果。Sun等[45]通過(guò)紅外光譜技術(shù)對(duì)硬木、軟木、禾本科和豆科植物建立了木質(zhì)素的S/G單體比例多變量化學(xué)預(yù)測(cè)模型，能夠快速準(zhǔn)確地測(cè)定木質(zhì)素中S/G單體比例。

3.2.4其它方法

此外，還可根據(jù)總有機(jī)碳(TC)和化學(xué)需氧量(COD)的變化測(cè)定木質(zhì)素含量。其原理是培養(yǎng)基中可溶性木質(zhì)素是作為唯一的有機(jī)物(碳源)參與反應(yīng)，如果TC或COD降低了，就表明培養(yǎng)基中的木質(zhì)素被降解了。

以上各種木質(zhì)素含量測(cè)定方法中，紫外分光光度法簡(jiǎn)便易行，具有重復(fù)性好、樣品用量少、簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)，但因?yàn)樽贤夥止夤舛扔?jì)檢測(cè)的最低閾值較高，對(duì)于那些活性不高的細(xì)菌沒(méi)有明顯的效果。反相高效液相色譜法具有檢測(cè)精密度高的特點(diǎn)，尤其適合降解活性較低的細(xì)菌的檢測(cè)，但液相色譜儀需要定期維護(hù)，成本較高。紅外光譜定量分析法不僅能夠推測(cè)出木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)模型，還能夠通過(guò)快速測(cè)定木質(zhì)素S/G單體比例來(lái)確定木質(zhì)素含量，但此法的理論還需要不斷完善，應(yīng)用不是很廣泛。基于TC和COD的測(cè)定方法只限于對(duì)水溶性木質(zhì)素的檢測(cè)，而且TC的檢測(cè)不適用于無(wú)礦化能力但有明顯降解木質(zhì)素能力的細(xì)菌。所以，在測(cè)定木質(zhì)素含量時(shí)應(yīng)根據(jù)客觀要求選擇合適的方法。

4結(jié)語(yǔ)

細(xì)菌是自然界中木質(zhì)纖維素降解的主要作用者之一，由于其來(lái)源廣、生長(zhǎng)快、易于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)而成為降解木質(zhì)纖維素的具有潛在應(yīng)用前景的新候選者。目前已發(fā)現(xiàn)多種具有木質(zhì)纖維素降解能力的細(xì)菌，由于各種細(xì)菌都有其最適宜的獨(dú)特生活環(huán)境，所以可根據(jù)各種細(xì)菌降解機(jī)理的差異而適時(shí)選擇不同的細(xì)菌。但關(guān)于細(xì)菌降解木質(zhì)纖維素的機(jī)理研究還不是特別透徹，需要進(jìn)一步深入研究。木質(zhì)纖維素是生物降解抗性最強(qiáng)的物質(zhì)之一，在不同的植物或同一植物不同部位所提取的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)均不相同，而且迄今為止研究者還未能解析出木質(zhì)纖維素的完整結(jié)構(gòu)。木質(zhì)纖維素含量和組成的檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，一般只適用于某一種或一類(lèi)木質(zhì)纖維素含量與組成的檢測(cè)，沒(méi)有一個(gè)系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)直接實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素的各方面測(cè)定，而只能根據(jù)測(cè)定對(duì)象的客觀要求和特點(diǎn)選擇合適的方法。今后應(yīng)努力尋求一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的方法測(cè)定木質(zhì)纖維素的含量與組成，這對(duì)資源利用和環(huán)境保護(hù)的意義重大。

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Research Progress on Degradation of Lignocellulose by Bacteria

DAI Yun-yun,ZHONG Wei-hong

(CollegeofBiologicalEngineering,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310032,China)

Keywords：bacterium;lignin;cellulose;biodegradation

Abstract：Thebiodegradationoflignocelluloseneedstheparticipationofsynergismofmulti-microorganismsduetoitscomplexednaturalstructure.Bacteriahavepotentialapplicationprospectsindegradationoflignocelluloseduetotheircharacteristics,suchasrapidgrowth,simplestructure,suitableforacidandalkalineconditions.Thetypesofbacteriafordegradinglignocelluloseinrecentyearsareintroduced,andthedegradationmechanismanddetectionmethodsforcontentoflignocellulosearesummarized.

收稿日期：2016-03-07

作者簡(jiǎn)介：戴蕓蕓(1990-)，女，浙江溫州人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，E-mail:352071094@qq.com；通訊作者：鐘衛(wèi)鴻，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:whzhong@zjut.edu.cn。

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.06.002

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ 352.78X 172

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)06-0011-06