孫仙玲，秦建平，王憲平，石 偉，錢 俊，吳 云，王振中，蕭 偉

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南京 210000；2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；3. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001）

HPLC測定FKⅣ號(hào)顆粒中芍藥苷、綠原酸、虎杖苷及丹酚酸B的含量＊

孫仙玲1,3，秦建平2,3，王憲平2,3，石 偉1,3，錢 俊2,3，吳 云2,3，王振中2,3，蕭 偉1, 2, 3＊＊

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南京 210000；2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司 連云港 222001；3. 中藥制藥過程新技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 連云港 222001）

目的：建立同時(shí)檢測FKⅣ號(hào)顆粒中芍藥苷、綠原酸、虎杖苷及丹酚酸B的HPLC含量測定方法。方法：采用HPLC含量測定法，色譜柱為Kromasil C18 (4.6 mm ×250 mm, 5 μm)；以乙腈-0.1% 磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，芍藥苷檢測波長為230 nm，綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B檢測波長為306 nm；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果：芍藥在7.539-482.470 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=1.000），平均回收率為101.10 %；綠原酸在2.003-128.166 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=1.000），平均回收率為100.76%；虎杖苷4.503-288.200 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（r=1.000），平均回收率為100.74 %；丹酚酸B在4.621-295.752 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，平均回收率為99.91 %（r=0.999 8）。結(jié)論：該方法簡便可靠，重復(fù)性好，可作為FKⅣ號(hào)顆粒中芍藥苷、綠原酸、虎杖苷及丹酚酸B的含量測定方法。

FKⅣ號(hào)顆粒 HPLC 芍藥苷 綠原酸 虎杖苷 丹酚酸B

FKⅣ號(hào)顆粒是一種治療盆腔炎性后遺癥的中藥制劑，具有活血化瘀、清利濕熱的作用，用于治療腹痛、腹墜脹、腰酸痛、白帶增多、月經(jīng)不調(diào)、盆腔腫塊等癥狀，其處方由大血藤、赤芍、丹參等10味中藥組成。其中，大血藤等益氣清熱為君藥，虎杖利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛為臣藥，赤芍、丹參理氣活血為佐藥。通過查閱文獻(xiàn)結(jié)合藥效篩選可知，處方中蒲公英、大血藤、菝葜中均含綠原酸，該成分具有較強(qiáng)的抗菌消炎作用，同時(shí)虎杖苷、芍藥苷、丹酚酸B也是本方的主要藥效成分[1-10]。本課題以FKⅣ號(hào)顆粒為研究對(duì)象，采用HPLC法測定這4種指標(biāo)性成分的含量，為評(píng)價(jià)和控制該制劑的質(zhì)量提供一定的依據(jù)。

1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BP211D型電子分析天平（Metter Toledo公司）；Centrifuge 5415D高速離心機(jī)（德國eppendorf公司）；DAD紫外檢測器（美國Agilent公司）；Mettler AE240電子分析天平（德國梅特勒公司）；芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：1110736-201337；質(zhì)量分?jǐn)?shù)以96.4%計(jì)）；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110735-201314；質(zhì)量分?jǐn)?shù)以96.6%計(jì)）；虎杖苷對(duì)照品（批號(hào)：111575-200502）；丹酚酸B（批號(hào) :111562-201110）；以上對(duì)照品均由中國食品藥品檢定院提供。FKⅣ號(hào)顆粒（自制，批號(hào)分別為：140801、141112、141113）。乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；自制純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

采用Kromasil C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0-35 min，10%-40%A）；體積流量1.0 mL·min-1；檢測波長：230 nm（芍藥苷），306 nm（綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B）；進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃，理論塔板數(shù)均大于3 000，色譜圖見圖1和2。

圖1 混合對(duì)照品溶液（A）和FKⅣ號(hào)顆粒（B）的HPLC圖（230 nm）

圖2 混合對(duì)照品溶液（C）和FKⅣ號(hào)顆粒（D）的HPLC圖（306 nm）

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別取芍藥苷、綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加70%甲醇配成濃度為芍藥苷53.35 μg·mL-1、綠原酸15.63 μg·mL-1、虎杖苷44.92 μg·mL-1、丹酚酸B 36.97 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取本品0.5 g，置于100 mL錐形瓶中，精密加入50 mL 70%甲醇，稱定重量，超聲提?。?50 W，40 kHz）30 min，冷卻至室溫，稱重，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，離心，過0.45 μm有機(jī)濾膜，即得。

2.4 陰性供試品制備

處方中芍藥苷來自于赤芍，虎杖苷來自于虎杖，綠原酸來自于大血藤、蒲公英、菝葜等3味藥材，丹酚酸B來自于丹參，按FKⅣ號(hào)顆粒的生產(chǎn)工藝分別制備缺赤芍、虎杖、丹參、大血藤、蒲公英、菝葜以及同時(shí)缺大血藤、蒲公英、菝葜3味藥材的陰性制劑，并按“2.3”項(xiàng)下方法制備各陰性供試品溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察

取陰性供試品溶液適量，進(jìn)樣測定，結(jié)果表明：虎杖、赤芍、丹參陰性制劑對(duì)所測組分無干擾，而大血藤、菝葜、蒲公英中均含有綠原酸。

2.5.2 線性關(guān)系考察

分別取芍藥苷、綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇配制成混合對(duì)照品母液（芍藥苷482.47 μg·mL-1、綠原酸124.60 μg·mL-1、虎杖苷288.22 μg·mL-1、丹酚酸B 295.75 μg·mL-1），將其用70%甲醇逐級(jí)稀釋得系列混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，測定峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，見表1。

圖3 供試品溶液（E）和赤芍陰性（F）的HPLC圖(230 nm)

圖4 供試品溶液（G）和各陰性制劑（H，I，J，K，L，M）的HPLC圖(306 nm)

2.5.3 精密度試驗(yàn)

取芍藥苷、綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果芍藥苷、綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B 峰面積的RSD值分別為1.28%、0.35%、1.17%、1.05%，這表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取FKⅣ號(hào)顆粒（批號(hào)：140801）0.5 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，分別于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 進(jìn)樣測定，分別計(jì)算峰面積的RSD值，結(jié)果：芍藥苷0.32%、綠原酸0.70%、虎杖苷0.20%、丹酚酸B 0.89%。這表明在24 h 內(nèi)樣品溶液在室溫條件下基本穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取FKⅣ號(hào)顆粒（批號(hào)：140801）0.5 g，按“2.3”供試品溶液制備方法平行制備6 份樣品溶液，依照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，進(jìn)樣測定各成分峰面積，結(jié)果：測得芍藥苷、綠原酸、虎杖苷、丹酚酸B的平均含量分別為5.37 mg·g-1、1.61 mg·g-1、3.91 mg·g-1、4.10 mg·g-1；RSD值 分 別 為 0.79%、0.59%、0.64%、1.05% 。

2.4.6 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取FKⅣ號(hào)顆粒（批號(hào)：140801）0.25 g，置于50 mL容量瓶中，分別加入含芍藥苷1.472 mg·mL-1、綠 原 酸 0.404 mg·mL-1、虎 杖 苷 0.991 mg·mL-1、丹酚酸B 1.113 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，各平行制備供試品溶液3份。進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各成分平均回收率與RSD

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=2）

2.4.7 樣品的測定

取3批FKⅣ號(hào)顆粒，按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備樣品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果見表3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用二極管陣列檢測器（Diode Array Detector，DAD）對(duì)樣品進(jìn)行全波段掃描，根據(jù)芍藥苷、綠原酸、虎杖苷和丹酚酸B的最大吸收波長及吸收曲線，選擇230 nm測定芍藥苷的含量，306 nm測定綠原酸、虎杖苷和丹酚酸B的含量，并且對(duì)4個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行了峰純度的驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在本實(shí)驗(yàn)所確定的檢測條件下樣品中所測定的4個(gè)成分不含其他干擾成分。

本研究考察了不同濃度乙醇、甲醇兩種溶劑系統(tǒng)對(duì)各指標(biāo)成分提取率的影響；對(duì)比了回流、超聲兩種不同的提取方式；對(duì)提取溶劑用量和提取時(shí)間進(jìn)行了比較，最終優(yōu)選出本實(shí)驗(yàn)所采用的供試品制備方法，即50 mL 70%甲醇，超聲提取30 min。

在流動(dòng)相選擇方面，本研究比較了乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.4%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.026%磷酸水溶液4種不同比例流動(dòng)相體系及等度、梯度條件下對(duì)色譜行為的影響，結(jié)果顯示：乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫分離效果較好[11-15]。并且，本文考察了25、30、35℃3種不同柱溫和0.8、1.0、1.2 mL·min-13種不同流速對(duì)各指標(biāo)成分分離結(jié)果的影響，研究表明，在柱溫30℃、流速1.0 mL·min-1的條件下分離效果最佳。

中藥藥效的發(fā)揮往往是多種活性成分共同作用的結(jié)果[16]。本文采用多指標(biāo)含量測定的方法同時(shí)測定該制劑中的4種有效成分，該思路符合中藥多組分、多靶點(diǎn)的特性。本研究結(jié)合所測定成分的最大吸收情況，采用雙波長法進(jìn)行測定，方法學(xué)考察結(jié)果表明：本文所建立的方法簡便可行、重復(fù)性好、靈敏度高，為FKⅣ號(hào)顆粒的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

1 國家藥典委員會(huì),中國人民共和國藥典(一部). 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010： 134.

2 陳智仙,高文遠(yuǎn),劉岱琳,等.大血藤的化學(xué)成分研究(Ⅱ).中草藥, 2010, 41(6)： 867-870.

3 苗抗立,張建中,王飛音,等.紅藤化學(xué)成分的研究.中草藥, 1995, 26(4)： 171-173, 223.

4 毛水春,顧謙群,崔承彬,等.中藥大血藤中酚類化學(xué)成分及其抗腫瘤活性.中國藥物化學(xué)雜志, 2004, 14(6)： 326-330.

5 吳曉春,杜勝利,陳海生.蒲公英的研究與應(yīng)用.藥學(xué)實(shí)踐雜志, 2002, 20(4)： 246-248.

6 吳衛(wèi)華,康楨,歐陽冬生,等.綠原酸的藥理學(xué)研究進(jìn)展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2006, 18： 691-694.

7 汪天明,王曉梅.虎杖苷藥理作用研究的新進(jìn)展.宿州學(xué)院學(xué)報(bào), 2007, 22(2)： 114-116.

8 阮金蘭,趙鐘祥,曾慶忠,等.赤芍化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展.中國藥理學(xué)通報(bào), 2003, 19(9)： 965-970.

9 王文萍,王垂杰,谷松,等.芍藥甘草湯配伍意義的藥動(dòng)學(xué)研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2009, 11(3)： 382-387.

10 徐麗君,黃光英.丹參的化學(xué)成分及其藥理作用研究概述.中西醫(yī)結(jié)合研究, 2009, 1(1)： 45-48.

11 錢俊,林夏,王星星,等.雙波長HPLC法同時(shí)測定FKⅣ顆粒劑中芍藥苷和虎杖苷的含量. 藥學(xué)與臨床研究, 2014, 22(3)： 219-221.

12 覃珊,溫學(xué)森. HPLC同時(shí)測定菊花中6種活性成分含量.中國中藥雜志, 2011, 36(11)： 1474-1477.

13 王瑞,展曉日,劉厚世.小建中湯及其拆方對(duì)芍藥苷提取率的影響研究.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2013, 15(6)： 1338-1342.

14 廖國平,賀帥,張忠義.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化超高壓提取虎杖中虎杖苷和白藜蘆醇.中國中藥雜志, 2010, 35(24)： 3282-3286.

15 何昱,成金樂,徐吉銀,等. HPLC-DAD同時(shí)測定丹參中原兒茶醛、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮IIA四種成分的含量.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2011, 13(4)： 688-692.

16 胡彬.果德安:中藥有效成分的探秘者.中國中醫(yī)藥報(bào), 2014-02-26(003).

Content Determination of Paeoniflorin, Chlorogenic Acid, Polydatin and Salvianolic Acid B in FKⅣ Granules by HPLC

Sun Xianling1,3, Qin Jianping2,3, Wang Xianping2,3, Shi Wei1,3, Qian Jun2,3, Wu Yun2,3, Wang Zhenzhong2,3, Xiao Wei1,2,3
(1. College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, China; 2. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China; 3. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China)

This study was aimed to establish the simultaneous content determination of paeoniflorin, chlorogenic acid, polydatin and salvianolic acid B in FKⅣ granules by HPLC. The Kromasil C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) was used as chromatographic column. The acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution was used as mobile phase with gradient elution. The detection wavelength of paeoniflorin was 230 nm. And the detection wavelength of chlorogenic acid, polydatin and salvianolic acid B was 306 nm. The column temperature was 30℃. The sample injection volume was 10 μL. The results showed that paeoniflorin had a good linear relationship in the range of 7.539-482.470 μg·mL-1(r = 1.000) with the average recovery rate of 101.10%. Chlorogenic acid showed a good linear relationship in the range of 2.003-128.166 μg·mL-1(r = 1.000) with the average recovery rate of 100.76%. Polydatin showed a good linear relationship in the range of 4.503-288.200 μg·mL-1(r = 1.000) with the average recovery rate of 100.74%. Salvianolic acid B showed a good linear relationship in the range of 4.621-295.752 μg·mL-1(r = 0.999 8) with the average recovery rate of 99.91%. It was concluded that the method was simple and reliable with good reproducibility. It can be used as a method for the content determination of paeoniflorin, chlorogenic acid, polydatin and salvianolic acid B in FKⅣ granules.

FKⅣ granules, HPLC, paeoniflorin, chlorogenic acid, polydatin, salvianolic acid B

10.11842/wst.2016.01.021

R284

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：王 晶）

2014-12-24

修回日期：2015-03-02

＊ 科學(xué)技術(shù)部國家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)（2013ZX09402203）：FKⅣ號(hào)顆粒的藥學(xué)研究，負(fù)責(zé)人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士生導(dǎo)師，研究員，主要研究方向：中藥新劑型的研究與開發(fā)。