馬雙姣，周建國，金 鉞，趙菊潤，姚 輝＊＊

（1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所 北京 100193；2. 云南龍陵縣石斛研究所 保山 678300）

王不留行種子的ITS2序列分子鑒定研究＊

馬雙姣1，周建國1，金 鉞1，趙菊潤2，姚 輝1＊＊

（1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所 北京 100193；2. 云南龍陵縣石斛研究所 保山 678300）

目的：基于ITS2 序列對中藥材王不留行種子及其混偽品進行鑒定研究，為王不留行種子及其混偽品的鑒定提供新方法。方法：對王不留行種子及其混偽品樣品提取基因組DNA、PCR擴增、雙向測序獲得ITS2序列。應用MEGA 6.0軟件計算種內(nèi)、種間遺傳距離，構建鄰接樹，基于自行編寫的代碼和開源代碼 PHP QR Code 的編碼方式，將王不留行及其混偽品 ITS2序列轉換為條形碼圖片，獲得各物種二維DNA 條形碼圖片，并在中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（www.tcmbarcode.cn）對所獲得ITS2序列進行分析鑒定。結果：王不留行藥材ITS2序列長度為219-221 bp，種內(nèi)最大 K2P 遺傳距離為0.009，小于其與混偽品的種間K2P遺傳距離，王不留行及其混偽品ITS2序列間存在的變異位點較多。NJ樹結果表明王不留行與其混偽品分別聚為一支，可明顯區(qū)分。結論：ITS2序列可以準確鑒別王不留行種子，為其種質資源鑒定和中藥材種子質量標準的建立提供了新方法，將獲得的ITS2序列轉換為二維DNA條形碼可為王不留行藥材流通管理提供便利，為保障王不留行臨床用藥安全提供了新的技術手段。

王不留行 種子 ITS2鑒定 DNA 條形碼 混偽品

王不留行為石竹科植物麥藍菜Vaccaria segetalis （Neck.） Garcke的干燥成熟種子，又名不留行、禁宮花、剪金花和麥藍子等[1]。王不留行具有活血通經(jīng)、下乳消腫、利尿通淋的功效，用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、乳汁不下、乳癰腫痛、淋證澀痛 等癥[2]。夏季果實成熟、果皮尚未開裂時采割植株、曬干、打下種子、除去雜質，再曬干。除華南外，全國各地區(qū)都有分布。王不留行種子含多種環(huán)苷、環(huán)肽和黃酮苷類成分，現(xiàn)代藥理研究表明：王不留行不僅具有促進泌乳、抑制新生血管生成、舒張血管平滑肌和抗氧化等作用，其水煎液也具有較好的抗炎、鎮(zhèn)痛效果，臨床用于孕婦產(chǎn)后護理，防治近視、失眠、便秘、皰疹、小兒厭食等[3-5]。

王不留行以種子入藥，其種子為球形，直徑約2 mm，表面黑色，少數(shù)紅棕色，略有光澤，有細密顆粒狀突起，一側有一凹陷的縱溝[2]。與王不留行形態(tài)相似的物種種子有很多，在中藥材流通過程中易混淆，如 十字花科植物蕓苔Brassica campestris L.、豆科植物野豌豆Vicia sepium L.、救荒野豌豆Vicia sativa L.、四籽野豌豆Vicia tetrasperma （L.）Schreber和小巢菜Vicia hirsuta （L.） S. F. Gray[6-8]。目前，對王不留行種子及其混偽品的鑒別主要集中在性狀、顯微、理化等傳統(tǒng)鑒定方面[3,7,8]。近年來，隨著分子生物技術的發(fā)展和安全性評價的需要，DNA條形碼技術成為生物分類和物種鑒定的研究熱點，它是傳統(tǒng)形態(tài)鑒別方法的有效補充，是中藥鑒定領域中的革命性突破[9-15]。目前，以ITS2序列為主體的中藥材DNA條形碼分子鑒定方法體系已納入《中國藥典》2010年版第三增補本[16]。本研究應用DNA條形碼序列ITS2對王不留行及其混偽品種子進行鑒定，從種源上保障中藥材王不留行的品質，為王不留行藥材的臨床用藥完全和療效有效性提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究涉及王不留行及其混偽品共6個物種85個研究對象，其中包括王不留行基原植物樣本、藥材樣本、復核樣本、對照藥材樣本，王不留行混偽品序列下載自GenBank，相關信息詳見表1。樣品均經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，復核樣本由中國中醫(yī)科學院中藥研究所進行復核，對照藥材（編號：FDC364）來自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取、PCR擴增和測序

將實驗樣品用 75% 酒精棉擦拭干凈后，種子取單粒，葉片樣品取變色硅膠干燥葉片約20 mg，用研磨儀（Retsch MM400，德國）研磨2 min（30 次/秒），加入700 μL核分離液7 500 rpm 離心5 min后棄上清，用植物 DNA 提取試劑盒（Tiangen Biotech Co., China）提取總 DNA，65℃水浴3 h，其余步驟按照試劑盒說明書進行[17]。ITS2 通用引物S2F：5'-ATG CGATACTTGGTGTGAAT-3'和S3R：5'-GACGCTT CTCCAGACTACAAT-3'。反應條件為94℃（5 min）；94℃（30 s），56℃（30 s），72℃（45 s），40個循環(huán)；72℃（10 min）。PCR反應體系為2×Taq Mix Master 12.5 μL、正反向引物各1.0 μL（2.5 μM）、總DNA 2 μL（約30 ng），其余用ddH2O補至25 μL[18]。電泳查看PCR擴增情況，對擴增產(chǎn)物進行雙向測序。

表1 實驗樣品信息表

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

去除測序峰圖低質量區(qū)域、去除引物序列，對雙向測序結果進行拼接，去除5.8S rRNA和28S rRNA區(qū)段獲得ITS2序列[19]。利用軟件MEGA 6.0[20]（Molecular Evolutionary Genetics Analysis）進行序列比對、變異位點分析，并基于Kimura 2-parameter （K2P）模型進行遺傳距離等分析。利用鄰接（NJ）法構建系統(tǒng)聚類樹，利用Bootstrap（1 000 次重復）檢驗各分支的支持率?；诒菊n題組自行編寫的代碼，將ITS2序列轉換為彩色條形碼圖片，然后基于開源代碼 PHP QR Code 的編碼方式將基原物種拉丁名和ITS2 序列進行編碼，獲得各物種二維 DNA條形碼圖片[17,21]。將掃描識讀出的二維碼信息通過移動終端上的網(wǎng)頁瀏覽器提交至中藥材 DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫（www.tcmbarcode.cn）進行物種鑒定。

2 結果與分析

2.1 王不留行種子及其混偽品 ITS2 序列特征

本研究比較了59條王不留行ITS2序列，序列長度為219-221 bp，GC含量56.6%，有2個變異位點。有2種單倍型，其中單倍型A1以YC0191MT02序列為主導單倍型，有57條，均為王不留行實驗樣品，單倍型A2（包括X83847、X86896），在199位點為T-C 變異，201位點為C-T 變異，另有2處插入或缺失，分別在38、203-205位點。

王不留行與各混偽品種間序列進行比對后長度為251 bp，混偽品中GC含量最高的是蕓苔，為52.6%，GC含量最低的是野豌豆，為46.1%。應用MEGA 6.0進行分析，以K2P計算遺傳距離，王不留行的種內(nèi)K2P距離為 0-0.009，平均K2P距離為0.000 3。王不留行與其混偽品ITS2序列間存在的變異位點較多，為75-101個，種間最小K2P距離為0.505，遠大于種內(nèi)最大K2P距離（0.009），變異位點數(shù)及種間K2P遺傳距離見表2。盡管王不留行種子與其混偽品種子在形態(tài)上相似，但由于它們來自不同的科屬，DNA序列差異大。因此應用 ITS2 序列可以很容易將王不留行種子及其混偽品的種子進行區(qū)分。

2.2 王不留行及其混偽品系統(tǒng)發(fā)育樹分析

通過基于 ITS2 序列（單倍型）構建的王不留行實驗樣本及其混偽品ITS2序列的NJ系統(tǒng)聚類樹可以看出（如圖1），王不留行與其混偽品蕓苔、救荒野豌豆、四籽野豌豆、小巢菜以及野豌豆各自聚為一支，能夠明顯區(qū)分開。因此，ITS2序列作為條形碼可準確鑒別王不留行基原和其混偽品蕓苔、救荒野豌豆、四籽野豌豆、小巢菜以及野豌豆。

表2 種內(nèi)種間K2P距離計算結果

圖1 基于ITS2序列構建的王不留行與其混偽品的NJ樹（拉丁名后為單倍型編號）

圖2 王不留行ITS2序列利用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)進行BLAST分析的結果

2.3 利用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)和NCBI進行BLAST分析

在中藥材 DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫（www.tcmbarcode. cn），點擊物種鑒定項下植物類藥材鑒定（ITS2），將單倍型序列粘貼到鑒定框中，點擊提交，查詢。結果顯示：與單倍型A1與A2序列相似度最高的物種均為王不留行V. segetalis，在NCBI中BLAST結果顯示，與單倍型A1與A2序列相似度最高的物種均為王不留行V. hispanica（NCBI taxonomy中V. segetalis為該拉丁名的異名），這表明單倍型A1、A2均為2010版《中國藥典》王不留行正品基原。

2.4 王不留行及其混偽品ITS2序列二維DNA條形碼

基于本課題組自行編寫的代碼，將王不留行及其混偽品ITS2序列轉換為彩色條形碼圖片，然后基于開源代碼PHP QR Code的編碼方式將王不留行及其混偽品基原物種拉丁名和ITS2 序列進行編碼，獲得各藥材二維 DNA 條形碼圖片。圖2所示為由王不留行及其混偽品 ITS2序列轉成的彩色條形碼圖片，包含王不留行及其混偽品 DNA條形碼序列信息，以不同顏色分別表示不同核苷酸，右側部分為物種拉丁名和DNA序列轉成的二維碼圖片。利用移動終端（如Android 手機、iPhone 等）的多種二維碼掃描軟件可以識讀獲得各物種拉丁名及ITS2序列[17,21]。

圖3 王不留行DNA 條形碼及二維碼 DNA 條形碼圖片（■A■T■C■G）

3 討論

3.1 王不留行及其混偽品樣品DNA提取方法的改良

獲得高質量的DNA是中藥材DNA條形碼鑒定的關鍵。王不留行及其混偽品的種子含有大量的油脂類、酚類和多糖類物質，為了獲得高質量的DNA，本研究中在經(jīng)典試劑盒法的基礎上進行改良，一是為了消除多糖、多酚類物質對DNA的干擾，本研究試驗中，在樣品粉碎前加入相當于藥材量5%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），粉碎后加入核分離液 700 μL漂洗2到3次，它們可以與多酚結合形成不溶的絡合物，有效去除多酚，同時還可以和多糖結合，去除多糖，減少DNA提取過程中多糖類物質的污染；二是適當延長水浴裂解時間，試驗中65℃水浴了3 h，使細胞充分裂解，提高DNA提取效率[18,21]。

3.2 DNA條形碼鑒定技術可準確鑒定王不留行基原植物、藥材、種子及其混偽品

本研究對王不留行基原植物、藥材及種子樣品進行DNA條形碼鑒定，并由中國中醫(yī)科學院中藥研究所進行復核，利用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)對獲得的ITS2序列進行BLAST鑒定，本研究所得實驗序列與中藥材DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫中王不留行序列相似度均為100%。因此，DNA條形碼能準確鑒定物種基原。王不留行與其混偽品蕓苔、救荒野豌豆、四籽野豌豆、小巢菜以及野豌豆來源于不同科屬，植物形態(tài)差別較大，但它們的種子形態(tài)相似，形態(tài)鑒定難度較大。應用 DNA 條形碼技術對王不留行及其混偽品的 ITS2序列進行分析，發(fā)現(xiàn)王不留行與其混偽品的 ITS2序列之間的差異大，K2P距離和NJ樹均可以區(qū)分王不留行與其混偽品。因此，ITS2序列作為條形碼可準確鑒別王不留行藥材及其混偽品。

3.3 為中藥材種質資源鑒定提供了新方法，對中藥材種子質量標準的建立提供依據(jù)

“國以農(nóng)為本，農(nóng)以種為先”，種子是中藥材產(chǎn)業(yè)鏈的起點，是藥材生產(chǎn)的最基本、最重要的生產(chǎn)資料。中藥材種子種苗質量的穩(wěn)定與否直接影響藥材的質量穩(wěn)定性，而藥材質量又是中藥質量的基礎。目前，中國中藥材種子種苗標準化的基礎較薄弱，中藥材種子、種苗標準化工作滯后，制約了中藥現(xiàn)代化的推進。實施中藥現(xiàn)代化，沒有中藥材種子種苗的標準化是不現(xiàn)實的[23-26]。目前對王不留行的種子的質量標準主要集中在測定其凈度、千粒重、水分、發(fā)芽率及真實性等指標，而對于其真實性檢測主要是觀察種子形態(tài)、大小、色澤以及表面特征等[27-29]。DNA 條形碼鑒定技術對形態(tài)鑒定難以區(qū)分、生物性狀極為相似的近緣種具有方法通用性強、操作簡單、鑒定結果可重復性良好等優(yōu)點。近年來，DNA條形碼技術已廣泛應用中藥鑒定學、系統(tǒng)分類學、發(fā)育進化、生態(tài)學、生物多樣性保護等各個領域中[30，31]。本研究是應用 DNA 條形碼技術對中藥材王不留行種子進行鑒定，為中藥材種子鑒定提供了一種新方法，對推動中藥材種子種苗標準鑒定體系的建立，保障中藥材質量和促進中醫(yī)藥的發(fā)展提供技術支撐。

致謝

本研究中王不留行樣品均經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，復核樣本由中國中醫(yī)科學院中藥研究所進行復核，在此感謝中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所林余霖研究員和中國中醫(yī)科學院中藥研究所的老師！

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Ma Shuangjiao1, Zhou Jianguo1, Jin Yue1, Zhao Jurun2, Yao Hui1

(1. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China; 2. Longling County Research Institute of Dendrobium, Yunnan 678300, China)

Identification of Seeds of Vaccaria segetalis (Neck.) Garcke Based on ITS2 Sequence

This study was aimed to explore a new method to identify the seeds of Vaccaria segetalis (Neck.) Garcke from its adulterants by the internal transcribed spacer 2 (ITS2) regions. In this study, all genomic DNAs of samples of V. segetalis and its adulterants were extracted. And then, the ITS2 sequences were PCR amplified and sequenced bidirectionally. The intraspecific and interspecific genetic distances were calculated by the MEGA 6.0 software for the construction of neighbor-joining (NJ) tree. Based on self written code and open source PHP QR Code coding way, the ITS2 sequences of V. segetalis and its adulterants were transferred into the two-dimensional barcoding images, which can be used in the analysis and identification in the Traditional Chinese Medicine (TCM) DNA barcoding species identification system (www.tcmbarcode.cn). The results showed that the sequence lengths of ITS2 regions of V. segetalis were ranged from 219 to 221 bp. The largest intraspecific K2P genetic distance was 0.009, which was smaller than the interspecific K2P genetic distance compared to its adulterants. There were many variation sites of ITS2 sequences between V. segetalis and its adulterants. The NJ tree showed that V. segetalis and its adulterants can be easily differentiated according to their monophyly. It was concluded that the ITS2 sequences could be used to identify V. segetalis and its adulterants, which not only provided a new method for the identification of germplasm resources of TCM, but also supplied some guidelines for the establishment of the quality standards of Chinese herbal seeds and seedlings. To transfer the two-dimensional DNA barcoding image of the obtained ITS2 sequences of V. segetalis were convenient for its circulation management. It provided new technical means for the clinical medication safety of V. segetalis.

Vaccaria segetalis, seed, ITS2 identification, DNA barcoding, adulterant

10.11842/wst.2016.01.005

R931.5

A

（責任編輯：馬雅靜 張志華，責任譯審：王 晶）

2015-06-16

修回日期：2015-12-01

＊ 科學技術部國家科技支撐計劃（2011BAI07B08）：中藥材質量評價體系建立及其質量標準示范研究子課題——中藥種子種苗 DNA條形碼鑒定及流通管理平臺的建立，負責人：陳士林；科學技術部國家科技基礎性工作專項（2014FY130400）：長白山區(qū)藥用植物資源考察與DNA條形碼數(shù)據(jù)采集，負責人：孫超。

＊＊ 通訊作者：姚輝，副研究員，碩士生導師，主要研究方向：中藥資源與分子鑒定。