高 婷，朱珣之，2＊＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266109；2.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院 鎮(zhèn)江 212018）

基于ITS2 序列的中藥材藤梨根DNA分子鑒定＊

高 婷1，朱珣之1，2＊＊

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266109；2.江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院 鎮(zhèn)江 212018）

目的：通過(guò)DNA條形碼鑒定技術(shù)區(qū)分中藥材藤梨根及其常見(jiàn)混偽品。方法：對(duì)采集的中藥材藤梨根樣品及其常見(jiàn)混偽品進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增和測(cè)序，運(yùn)用CodonCode Aligner 3.5.7對(duì)所獲ITS2序列進(jìn)行拼接。應(yīng)用MEGA 5.0軟件計(jì)算藤梨根及其常見(jiàn)混偽品的Kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離，并構(gòu)建NJ（鄰接）系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)，最后分析種間ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果：中藥材藤梨根兩種基原植物的平均種內(nèi)K2P遺傳距離分別為0.001和0.002，遠(yuǎn)小于藤梨根與其常見(jiàn)混偽品之間的平均K2P遺傳距離0.120；藤梨根與其常見(jiàn)混偽品的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)也存在明顯差異；NJ樹(shù)顯示藤梨根的基原植物聚在一起，與混偽品可明顯區(qū)分，但無(wú)法區(qū)別所有獼猴桃屬植物。結(jié)論：ITS2序列可高效區(qū)分藤梨根及其常見(jiàn)混偽品，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)鑒定方法的不足，提高了鑒定效率及準(zhǔn)確性。

中華獼猴桃 DNA條形碼 ITS2序列 分子鑒定

藤梨根Radix Actinidiae別名圓棗子、藤梨、洋桃藤，為獼猴桃科獼猴桃屬植物中華獼猴桃Actinidia chinensis Planch.或軟棗獼猴桃Actinidia arguta Planch.的干燥根[1]。藤梨根味甘、咸寒、微澀，具有清濕熱、降血脂、治黃疸、促進(jìn)食欲、暢通乳絡(luò)的功效，在中國(guó)分布廣泛，應(yīng)用歷史悠久[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，藤梨根具有明顯的抗腫瘤活性和調(diào)節(jié)免疫功能，尤其對(duì)腸道癌療效甚佳[3,4]。

許多中藥材經(jīng)深度加工后，形態(tài)外觀上極其相似。此外，各類(lèi)藥典醫(yī)書(shū)對(duì)中藥材的來(lái)源、地方習(xí)用名等記載有所差別。目前，中藥材大多存在同名異物和同物異名，藤梨根亦存在混偽品擾亂市場(chǎng)的現(xiàn)象。因藥材飲片外形相似，近年來(lái)，獼猴桃科植物鑷合獼猴桃Actinidia valvata或大籽獼猴桃Actinidia macrosperma的干燥根貓人參在臨床上常被混同為藤梨根使用, 二者性能不同,前者性涼,后者性溫臨床效用亦異,故應(yīng)區(qū)別使用[6]。在調(diào)查中曾發(fā)現(xiàn)葛棗獼猴桃Actinidia polygama做為貓人參混偽品現(xiàn)象。此外，50余種獼猴桃屬植物主產(chǎn)于中國(guó)，形態(tài)類(lèi)似，也存在一定混淆現(xiàn)象?；靷纹肺：α酥兴幉奶倮娓挠盟幇踩?，擾亂了中藥材市場(chǎng)的秩序。尋找一種高效、可靠的方法來(lái)區(qū)分正偽品已成為發(fā)展現(xiàn)代化中醫(yī)藥亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題[5]。然而，目前對(duì)藤梨根及其混偽品貓人參等的鑒定研究大多停留在傳統(tǒng)的鑒定方法上，如飲片性狀鑒別、顯微鑒別、簡(jiǎn)單理化鑒別等，但準(zhǔn)確性和可靠性欠佳[7-10]。

以DNA條形碼（DNA Barcoding）技術(shù)為代表的分子生物學(xué)鑒定方法被越來(lái)越多的應(yīng)用于物種的區(qū)分鑒定。DNA條形碼鑒定技術(shù)是通過(guò)比較一段通用的DNA序列對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地識(shí)別和鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)[11]。DNA條形碼鑒定技術(shù)可用于動(dòng)物、植物、真菌的鑒定，該技術(shù)鑒定速度快,重復(fù)性和穩(wěn)定性高；非專(zhuān)業(yè)分類(lèi)鑒定人員亦可操作；可利用互聯(lián)網(wǎng)和信息平臺(tái)實(shí)現(xiàn)統(tǒng)一管理和共享[12]。在中藥材鑒定領(lǐng)域，ITS2條形碼序列表現(xiàn)出良好的潛力。紅景天、金銀花、羌活、板藍(lán)根等中藥材均進(jìn)行了ITS2條形碼驗(yàn)證，并取得令人滿(mǎn)意的結(jié)果[13-15]。已建立的中藥材ITS2+psbA-trnH 的DNA條形碼鑒定系統(tǒng)有利于推進(jìn)中藥鑒定標(biāo)準(zhǔn)化和國(guó)際化[16，17]。《中國(guó)藥典》（2010年版第三增補(bǔ)本）現(xiàn)已收載中藥材 DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則作為中藥材質(zhì)量控制的新方法[18]。

本研究擬采用DNA條形碼鑒別物種原則[19]區(qū)分中藥材藤梨根及其混偽品貓人參等，檢驗(yàn)DNA條形碼技術(shù)的有效性。

表1 藤梨根及常見(jiàn)混偽品樣本來(lái)源

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所取藤梨根的19個(gè)樣品，其中4個(gè)購(gòu)自市場(chǎng)（含1個(gè)偽品），2個(gè)來(lái)源于野外采集的新鮮葉片，13個(gè)下載于GenBank（下載時(shí)間為2015年6月）；常見(jiàn)混偽品貓人參等樣品12個(gè)，其中3個(gè)購(gòu)自市場(chǎng)（含1個(gè)偽品），8個(gè)下載于GenBank（下載時(shí)間為2015年6月）；1個(gè)來(lái)源于野外采集的新鮮葉片，詳見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)材料由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)辛華教授進(jìn)行經(jīng)典鑒定，憑證樣本保存于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物組標(biāo)本室。此外，從GenBank中下載獼猴桃屬其他24個(gè)近緣物種的72份ITS2序列（表4）納入分析。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

PCR引物、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照前人研究方法[20]。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化后由上海桑尼生物科技有限公司采用ABI 3730正反雙向測(cè)序完成。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用CodonCode Aligner 3.5.7軟件對(duì)測(cè)序所獲得的ITS2序列進(jìn)行拼接與校對(duì)，利用MEGA5.0軟件計(jì)算各個(gè)樣品的Kimura 2-parameter（K2P）遺傳距離，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建ITS2序列的NJ樹(shù)，NJ樹(shù)各分支置信度自舉檢測(cè)（bootstrap）為l 000次，依據(jù)GenBank在線BLAST比對(duì)獲得序列相似度值；依據(jù)ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)及信息平臺(tái)預(yù)測(cè)ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤梨根基原植物種內(nèi)變異

13個(gè)中華獼猴桃樣品的ITS2序列長(zhǎng)度均為219 bp，GC含量分別為51.6%，52.1%。種內(nèi)樣本共有2個(gè)單倍型，1-2號(hào)，4-8號(hào)，11-14號(hào)樣本均屬于一個(gè)單倍型；9、10號(hào)樣本序列屬于另一個(gè)單倍型，與第一單倍型有2個(gè)位點(diǎn)存在變異，其他各個(gè)位點(diǎn)堿基均無(wú)差異（表2）。種內(nèi)K2P距離為0.000-0.005，種內(nèi)平均K2P距離為0.001。

表2 藤梨根ITS2序列的種內(nèi)變異位點(diǎn)

表3 藤梨根與常見(jiàn)混偽品種間K2P距離

5個(gè)軟棗獼猴桃種內(nèi)樣品的ITS2序列長(zhǎng)度均為220 bp，GC含量分別為62.3%，62.7%。種內(nèi)樣本共有2個(gè)單倍型，15-17，27號(hào)樣本序列均屬于1個(gè)單倍型；26號(hào)樣本序列屬于1個(gè)單倍型，僅與第一單倍型有1個(gè)位點(diǎn)存在變異（表2）。種內(nèi)K2P距離為0.000-0.005，種內(nèi)平均K2P距離為0.002。

概言之，人工智能法律人格之有無(wú)，并非是人所賦予的，而是在人制造人工智能的取向和路徑中被決定的。如果人工智能的未來(lái)發(fā)展仍是按現(xiàn)有的“以人為模板”的思維框架進(jìn)行的話，那似乎對(duì)人工智能法律人格的承認(rèn)，便是一件遲早會(huì)發(fā)生的事情。

2.2 藤梨根與常見(jiàn)混偽品種間變異

藤梨根各常見(jiàn)混淆品樣品的ITS2序列長(zhǎng)度均為223 bp。藤梨根與各混淆品種間序列存在較多的變異位點(diǎn)。種間K2P距離為0.028-0.195，種間平均K2P距離為0.120（表3）。其中，中華獼猴桃（1，9，10）與葛棗獼猴桃（28-31）遺傳距離較近，與鑷合獼猴桃（18，21-24）和大籽獼猴桃（19，25）距離較遠(yuǎn)；軟棗獼猴桃（15，26）則反之，與鑷合獼猴桃和大籽獼猴桃遺傳距離較近，而與葛棗獼猴桃距離較遠(yuǎn)。

2.3 藤梨根及其常見(jiàn)混偽品ITS2序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)

本研究選取藤梨根與其常見(jiàn)混偽品種進(jìn)行ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，如圖1。藤梨根與其常見(jiàn)混偽品的4個(gè)螺旋區(qū)在莖環(huán)數(shù)目、大小、位置及螺旋發(fā)出角度均有較大差異。例如，中華獼猴桃在螺旋區(qū)Ⅰ有5個(gè)莖環(huán)，2大3??；葛棗獼猴桃在螺旋區(qū)Ⅰ有4個(gè)莖環(huán)，1大3小。由二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖可知，中華獼猴桃與其混偽品的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)有明顯差異。

2.4 獼猴桃屬NJ樹(shù)聚類(lèi)分析及偽品鑒定

從GenBank中下載獼猴桃屬其他24個(gè)近緣物種的72份ITS2序列信息（表4），結(jié)合本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)共103份樣本共同構(gòu)建NJ樹(shù)，見(jiàn)圖2。從NJ樹(shù)中可以看出藤梨根基原植物中華獼猴桃不同來(lái)源的樣品聚在一支；藤梨根另一基原植物軟棗獼猴桃聚在另一支；同時(shí)藤梨根的混偽品葛棗獼猴桃、鑷合獼猴桃和大籽獼猴桃也各聚為一支。葛棗獼猴桃與軟棗獼猴桃、鑷合或大籽獼猴桃聚的較近，而與中華獼猴桃聚的較遠(yuǎn)。藤梨根與其混偽品很容易加以區(qū)分。

其他大多數(shù)同種獼猴桃屬物種能夠聚在一支上，這表明ITS2條形碼序列鑒定能力較強(qiáng)；但也存在部分樣品未能很好的聚在一支上，例如安息香獼猴桃的3個(gè)樣品。這種現(xiàn)象的存在說(shuō)明基于ITS2條形碼序列構(gòu)建NJ樹(shù)對(duì)大量樣品的物種鑒定存在一定局限。結(jié)合NJ樹(shù)聚類(lèi)及BLAST在線比對(duì)結(jié)果（ITS2序列相似度均為100%）預(yù)測(cè)：20號(hào)混偽品應(yīng)為葛棗獼猴桃；3號(hào)混偽品可能為河南獼猴桃Actinidia henanensis或毛葉硬齒獼猴桃Actinidia callosa var. strigillosa。

3 討論

中藥材相關(guān)出口貿(mào)易近年來(lái)迅速增加，這就要求一種高效、便捷的方法能在短時(shí)間內(nèi)鑒定大量中藥材的真?zhèn)?，傳統(tǒng)的鑒定方法無(wú)法很好的滿(mǎn)足要求。DNA條形碼鑒定技術(shù)為中藥材快速、準(zhǔn)確鑒定提供了一個(gè)強(qiáng)大的工具，加快了中藥材鑒定標(biāo)準(zhǔn)化流程建設(shè)[12]。ITS2序列條形碼鑒定技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中藥材的混偽品鑒定中[22-24]。Chen等以ITS2為主體序列，psbA-trnH為輔助序列創(chuàng)建了中藥材DNA 條形碼鑒定體系對(duì)植物類(lèi)中藥材進(jìn)行鑒定。在2010版《中國(guó)藥典》增補(bǔ)本中列入的“中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則”將ITS2序列列為植物類(lèi)藥材核心條形碼序列。

圖1 藤梨根及其常見(jiàn)混偽品種的ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

本實(shí)驗(yàn)利用ITS2序列對(duì)藤梨根及其常見(jiàn)混偽品貓人參等進(jìn)行鑒別，研究發(fā)現(xiàn)依據(jù)ITS2序列的種內(nèi)種間距離、NJ樹(shù)及二級(jí)結(jié)構(gòu)均可把藤梨根與其常見(jiàn)混偽品區(qū)分開(kāi)。ITS2條形碼分子鑒定與經(jīng)典形態(tài)分類(lèi)結(jié)果可以很好的吻合:在藥店或藥材市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的藤梨根和貓人參樣品均存在一定混偽品現(xiàn)象，依據(jù)分子手段可以進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)混偽品的準(zhǔn)確鑒定。ITS2序列仍存在一定的局限性，推廣應(yīng)用到獼猴桃屬大量物種鑒定時(shí)存在部分分類(lèi)混亂。

表4 獼猴桃屬植物樣品表

本實(shí)驗(yàn)中購(gòu)自市場(chǎng)的藤梨根飲片來(lái)自獼猴桃屬植物的根，將其洗凈，曬干而成，切碎而后進(jìn)行入藥使用。因飲片僅僅簡(jiǎn)單切制、低溫干燥，未進(jìn)行深度炮制，因此藥材的DNA未嚴(yán)重降解，因此在本實(shí)驗(yàn)中可以成功進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增、測(cè)序。而對(duì)于一些經(jīng)過(guò)深度炮制加工的飲片，或儲(chǔ)存時(shí)間較久、貯藏養(yǎng)護(hù)方式不當(dāng)?shù)闹兴幉摹嬈?，DNA條形碼分子鑒定法則可能具有局限性[17,25]。此外，本研究的不足之處在于部分物種的基原植物樣本采集量較少或未采集到樣本，部分物種的分析數(shù)據(jù)僅來(lái)自于GenBank,后續(xù)有待進(jìn)一步采集樣本，補(bǔ)充驗(yàn)證。

本研究將DNA條形碼鑒定技術(shù)應(yīng)用于藤梨根及其混偽品的鑒定區(qū)分中，為藤梨根真?zhèn)舞b定提供了一種可靠、穩(wěn)定、有效的手段，是傳統(tǒng)鑒定技術(shù)的有效補(bǔ)充。該技術(shù)為中藥材基原物種鑒定提供了有力的科技支撐，將在中藥材及中成藥流通監(jiān)管、道地藥材鑒別、保健食品和食品質(zhì)量安全控制等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用[17]。同時(shí)，隨著DNA 條形碼技術(shù)與計(jì)算機(jī)信息系統(tǒng)的結(jié)合，二維DNA條形碼的出現(xiàn)將會(huì)大大推進(jìn)中藥鑒定數(shù)字化和標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程[26,27]。

致謝：感謝中國(guó)海洋大學(xué)侯俊碩士為本研究提供的實(shí)驗(yàn)幫助。

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的獼猴桃屬植物NJ樹(shù)

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DNA Molecular Identification of Radix Actinidiae Based on ITS2 Sequence

Gao Ting1，Zhu Xunzhi1, 2
(1. Key Laboratory of Plant Biotechnology in Universities of Shandong Province, College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 2. School of Biology and Chemical Engineering, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang 212018, China)

The goal of the investigation was to identify Radix Actinidiae (tengligen) from its common adulterants using DNA barcode (ITS2). DNAs from Radix Actinidiae and its common adulterants samples were abstracted then purified by PCR. ITS2 regions of the samples were sequenced and obtained from the purified PCR products. CodoCode Aligner 3.5.7 was performed to assemble the ITS2 sequences. Inter- and intra-specific Kimura 2-Parameter (K2P) distances were calculated by MEGA 5.0 software. Then the Neighbor-Joining (NJ) tree was built. At last, ITS2 secondary structures were predicted, while differences among the structures were found. It was found that Radix Actinidiae derived from two different original plants. The average intra-specific K2P distances of the two original plants were 0.001 and 0.002, respectively, which were far lower than the average inter-specific K2P distance, 0.120, from Radix Actinidiae and its common adulterants samples. Radix Actinidiae was also distinguished from its adulterants with NJ tree and secondary structure of ITS2. However, ITS2 was failed in identifying all the species in the genus Actinidia through NJ tree. It was concluded that ITS2 can be regarded as a valuable marker for identification of Radix Actinidiae from its adulterants with efficiency and accuracy, which complemented the defects of traditional identification methods.

Radix Actinidiae, DNA barcoding, ITS2, molecular identification

10.11842/wst.2016.02.012

R282.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-07

＊ 山東省教育廳山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J14LE13）：基于DNA條形碼鑒定沙參屬藥用植物的關(guān)鍵技術(shù)研究，負(fù)責(zé)人：高婷；山東省自然基金委山東省自然科學(xué)基金高校聯(lián)合專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目（ZR2013HL021）：基于DNA條形碼的中藥材桔梗分子鑒定研究，負(fù)責(zé)人：高婷；青島市科技局青島市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（14-2-4-89-jch）：北沙參轉(zhuǎn)錄組的高通量測(cè)序及香豆素合成關(guān)鍵酶的克隆研究，負(fù)責(zé)人：高婷。

＊＊ 通訊作者：朱珣之，副教授，主要研究方向：分子生物學(xué)與生物多樣性。