王果平，樊叢照，羅紅梅，季愛(ài)加，宋 駿，李曉瑾＊＊

（1.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所 烏魯木齊 830002；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 藥用植物研究所 北京 100193)

瀕危藥用植物新疆阿魏cDNA文庫(kù)構(gòu)建與微衛(wèi)星標(biāo)記＊

王果平1，樊叢照1，羅紅梅2，季愛(ài)加2，宋 駿1，李曉瑾1＊＊

（1.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所 烏魯木齊 830002；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué) 藥用植物研究所 北京 100193)

目的：測(cè)試和分析新疆阿魏轉(zhuǎn)錄組，挖掘基因表達(dá)譜多態(tài)性標(biāo)記（EST-SSRs），為新疆阿魏屬植物遺傳多樣性、生物學(xué)特性、功能基因鑒定和瀕危機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。方法：提取新疆阿魏莖葉總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用454 GS FLX Titanium進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)其序列進(jìn)行拼接，獲得一致性序列（Unique Sequences）；使用Simple Sequence Repeat Identification Tool（Perl Script）對(duì)一致性序列進(jìn)行分析，檢索SSRs模體，采用Primer 5及SSR Hunter軟件設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果：高通量測(cè)序獲得新疆阿魏ESTs序列550 200條，經(jīng)拼接得到60 248條Unique Sequences，從中發(fā)現(xiàn)1 916個(gè)EST-SSRs，平均每100 kb出現(xiàn)3.18個(gè)SSR，其中二核苷酸最多，GA重復(fù)最常見，隨機(jī)挑選5條序列擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果表明，80%的SSR位點(diǎn)與Sanger測(cè)序結(jié)果一致。結(jié)論：通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序首次獲得新疆阿魏EST-SSRs，為新疆阿魏生物學(xué)特性及瀕危機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

新疆阿魏 EST-SSRs 高通量測(cè)序 分子標(biāo)記

藥材阿魏為傘形科阿魏屬植物花莖中具有特殊氣味的油膠樹脂，歐亞多國(guó)皆有阿魏的藥用歷史。在中國(guó)，阿魏最早收載于《唐本草》（公元659年），其后歷代本草均有記載，具有解痙、祛風(fēng)、止瀉、除腸蟲、治療哮喘、癲癇及抗流感等功效[1-12]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》收載新疆阿魏Ferula sinkiangensis為阿魏藥材基原植物之一，僅分布于中國(guó)新疆伊犁地區(qū)。因其為多年生一次結(jié)果早春草本植物，阿魏藥材產(chǎn)自其花莖，過(guò)度采收將嚴(yán)重影響植物的繁衍，加之當(dāng)?shù)剡^(guò)度墾荒及氣候變化等原因，阿魏的野生植物資源極度萎縮，現(xiàn)已被列為國(guó)家三級(jí)瀕危保護(hù)植物[13]。因此，探索研究其瀕危機(jī)制對(duì)新疆阿魏的資源保護(hù)及可持續(xù)利用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

微衛(wèi)星序列（Simple Sequence Repeat，SSR）標(biāo)記是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。SSR是一類由幾個(gè)核苷酸（一般為1-6個(gè)）為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，存在于真核生物的基因組中，因其數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性等特點(diǎn)常被作為遺傳標(biāo)記廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳和育種研究實(shí)踐中[14]。EST-SSRs是基于表達(dá)序列標(biāo)簽建立的分子標(biāo)記，它在遺傳作圖、資源多樣性、功能基因的發(fā)現(xiàn)與定位、物種起源與進(jìn)化和比較基因組學(xué)研究等方面有著重要的利用價(jià)值。近年來(lái)EST-SSRs作為分子標(biāo)記在農(nóng)作物大麥、甜瓜及馬鈴薯等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，亦有用于紅豆杉、金銀花等藥用植物[15-19]。本研究擬采用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)試其轉(zhuǎn)錄組，挖掘基因表達(dá)譜多態(tài)性標(biāo)記（EST-SSRs），為新疆阿魏屬植物遺傳多樣性、生物學(xué)特性、功能基因鑒定和瀕危機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

新疆阿魏F. sinkiangensis植物樣本采自新疆伊寧縣拜石墩新疆中藥民族藥研究所新疆阿魏野生撫育基地，隨機(jī)選取植株幼嫩莖葉，采集后即刻用清水清洗5-8次，吸水紙吸干葉表面水分，迅速保存于液氮中備用。

1.2 RNA 提取與cDNA合成

隨機(jī)選取3份樣本，合并后采用總RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：RP 2801）提取新疆阿魏莖葉總RNA，Oligotex?mRNA kit（德國(guó)Qiagen公司，批號(hào)：70022）分離純化mRNA。以2 μg mRNA為模板，利用SMARTTMPCR cDNA Synthesis kit（美國(guó)Clontech公司，批號(hào)：634902）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用PCR Advantage II polymerase（美國(guó)Clontech公司，批號(hào)：639201）對(duì)cDNA 進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃，1 min；94℃，15 s；65℃，30 s；68℃，6 min，13個(gè)循環(huán)。采用PureLink TM PCR Purification kit（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：K310001）去除體系中小于300 bp的片段。

1.3 454文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序[21，22]

將5 μg雙鏈cDNA 打斷為300-800 bp的片段，兩端添加特異性銜接子A和B，變性為單鏈連接到磁珠上，經(jīng)emPCR富集，置于PicoTiter Plate板，應(yīng)用高通量測(cè)序平臺(tái)454 GS FLX Titanium測(cè)序。

表1 阿魏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與組裝結(jié)果

1.4 序列拼接

采用GS-FLX Software去除銜接子區(qū)域和低質(zhì)量序列，屏蔽SMART PCR 引物。將測(cè)序序列利用GS De Novo Assembler軟件進(jìn)行拼接，所有分析使用默認(rèn)參數(shù)。

1.5 微衛(wèi)星標(biāo)記檢索

采用Simple Sequence Repeat Identification Tool檢索SSR位點(diǎn)，設(shè)置參數(shù)如下：序列長(zhǎng)度最短為14 bp；二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸最少重復(fù)次數(shù)分別為7、5、4、3、3次。

1.6 SSR位點(diǎn)驗(yàn)證1.6.1 引物設(shè)計(jì)

隨機(jī)選取5條含有SSR位點(diǎn)的Unique Sequences，采用SSRHunter軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，采用Primer5軟件在SSRs側(cè)翼序列設(shè)計(jì)PCR引物，引物設(shè)計(jì)參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。

1.6.2 PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件

SSRs引物擴(kuò)增體系為25 μL，包括12.5 μL 2×Taq PCR Mastermix（天根生化科技有限公司，批號(hào)：KT201），基因組DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，H2O 8.5 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

1.6.3 擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)

PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后由美吉生物測(cè)序公司雙向測(cè)序，測(cè)序峰圖利用CodonCode Aligner V 4.0.4（美國(guó)CodonCode公司）校對(duì)拼接，去除引物區(qū)，并采用SSRHunter軟件檢驗(yàn)SSR位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序和序列拼接

以新疆阿魏莖葉為材料，總RNA的提取結(jié)果較好，條帶清晰。構(gòu)建的新疆阿魏cDNA文庫(kù)中，1/2測(cè)序反應(yīng)獲得數(shù)據(jù)總量為167.39 Mb，EST序列550 200條，所有ESTs通過(guò)GS FLX ASSEMBLER軟件拼接，去除200 bp以下的序列，獲得60 248 條Unique Sequences，包括10 446個(gè)序列重疊群（isotig）和49 802條單一序列（singleton），堿基總數(shù)為26 578 204 bp，最長(zhǎng)序列為3 744 bp，最短200 bp，平均長(zhǎng)度為441.26 bp。

2.2 新疆阿魏EST-SSRs的特征

在新疆阿魏莖葉60 248個(gè)unigene中搜索到1 916個(gè)SSR 位點(diǎn)，占unigene序列的3.18%, 平均每100 kb出現(xiàn)3.18個(gè)SSR。SSR種類豐富，二至六核苷酸重復(fù)類型均存在，重復(fù)次數(shù)也存有差異（表2）。在不同核苷酸重復(fù)類型中，最常見的是二核苷酸，占總ESR-SSRs的31.99%，其次是三核苷酸和六核苷酸（22.7%），出現(xiàn)頻率最低的為五核苷酸（6.41%）。

在檢出SSR中，共發(fā)現(xiàn)445種基序（motif）類型（圖1），出現(xiàn)頻率最高的10類基序?yàn)椋篏A（135個(gè)，7.17%）、AG（108個(gè)，5.73%）、TC（103個(gè)，5.46%）、TACG（92個(gè)，4.88%）、CT/TA（61個(gè)，3.24%）、ACGT（54個(gè)，2.87%）、GTAC（48個(gè)2.55%）、AC（42個(gè)，2.23%）、AT（38個(gè)，2.02%）、TG（35個(gè)，1.86%）。10類基序占所有SSRs出現(xiàn)頻率的38.01%，其中六核苷酸基序類型有291種，其總量最豐富，占總類型的58.75%。

2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記的驗(yàn)證

采用SSRHunter及Primer5軟件，在SSRs序列附近設(shè)計(jì)引物，其中有1 028條EST-SSRs可成功設(shè)計(jì)正反向引物，包括625條singletons和403條contigs。為了驗(yàn)證EST-SSRs位點(diǎn)的真實(shí)性和可靠性，本實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取5條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，5條引物均獲得了測(cè)序結(jié)果，其中編號(hào)為isotig00998、isotig03124、isotig09447、isotig04206的 4條 序列測(cè)序結(jié)果中SSR位點(diǎn)與contigs中一致，編號(hào)為isotig06720的序列Sanger測(cè)序結(jié)果重復(fù)序列為（TG）5，而在454測(cè)序中的重復(fù)序列為（AT）10。其余4條序列Sanger測(cè)序結(jié)果中的重復(fù)序列與SSRs基序序列一致。

3 討論

近年轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等高通量測(cè)序技術(shù)在眾多植物中得到廣泛應(yīng)用，EST-SSR亦隨之得到開發(fā)與利用。454 GS FLX Titanium高通量測(cè)序技術(shù)是一種基于焦磷酸測(cè)序原理而建立起來(lái)的第二代系統(tǒng)，其測(cè)序效率遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的sanger測(cè)序法，但對(duì)cDNA文庫(kù)的質(zhì)量有較高的要求，本研究應(yīng)用了SMART技術(shù)制備GS FLX cDNA文庫(kù)的方法流程[20，21]，構(gòu)建了新疆阿魏cDNA文庫(kù)，為新疆阿魏物遺傳多樣性、生物學(xué)特性、功能基因鑒定和瀕危機(jī)制的研究提供新的切入點(diǎn)。

表2 新疆阿魏Unique Sequences的SSR位點(diǎn)預(yù)測(cè)

圖1 基于模體類型的新疆阿魏EST-SSRs頻率分布

新疆阿魏的ESTs中，四核苷酸為分布最少的模體，可能與四核苷酸SSRs主要位于非編碼區(qū)有關(guān)，而雙子葉中最具有代表性的重復(fù)序列AG在新疆阿魏中占比例較大[22]。在植物中，一般二核苷酸和三核苷酸為最豐富表達(dá)模體類型[23]，但在新疆阿魏中最豐富表達(dá)模體類型為六核苷酸，與東北紅豆杉研究結(jié)果一致[18]。SSR位點(diǎn)中存在較高的六核苷酸比例，即使六核苷酸位點(diǎn)發(fā)生變異，但由于突變壓力和某些特定氨基酸的延伸，六核苷酸在基因編碼的移碼突變區(qū)存在很強(qiáng)的陽(yáng)性選擇，使遺傳性狀相對(duì)穩(wěn)定，有利于物種生存[24]。新疆阿魏是否也與東北紅豆杉一樣是古老的物種，還有待于進(jìn)一步深入研究?；谵D(zhuǎn)錄組測(cè)序的EST-SSRs標(biāo)記對(duì)新疆阿魏及同屬植物的生物學(xué)特性、遺傳多樣性、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及良種培育等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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cDNA Library Construction and Microsatellite Marker Analysis of the Endangered Medicinal Plant Ferula sinkiangensis

Wang Guoping1，F(xiàn)an Congzhao1，Luo Hongmei2，Ji Aijia2，Song Jun1，Li Xiaojin
（1.Xinjiang Institute of Chinese Materia Medica and Ethnical Materia, Urumqi 830002, China; 2.Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China）

This study aimed to detect and analyze of the transcriptome data of F. sinkiangensis, as well as identify its genetic polymorphism of simple sequence repeats (SSRs) of expressed sequence tags (EST-SSRs), which laid foundations for studies on genus genetic diversity, biological characteristics, identification of functional gene and the endangered mechanism of F. sinkiangensis. Total RNA from the leaves of F. sinkiangensiswas extracted and reversed to cDNA, in order to construct the 454-EST library. Then 454-EST library was sequenced using 454 GS FLX Titanium. After sequences assembly, the unique sequences of F. sinkiangensis were obtained. The SSR identification tool that named Sequence Repeat Identification Tool Simple (Script Perl) was applied to analyze the SSR motif from the obtained unique sequences. Primers were designed by Primer 5 and SSR Hunter software and amplified by PCR. As a result, 550 200 EST sequences of F. sinkiangensis were obtained by high-throughput sequencing, which were assembled into 60 248 unique sequences. Among these unique sequences, 1 916 EST-SSRs sites were discovered with the average of 3.18 EST-SSRs sites in every 100 kb sequences. Among the EST-SSRs sites, dinucleotide SSRs was the richest with G and A nucleotide repeats mostly. In conclusion, EST-SSRs data of F. sinkiangensis was established firstly in this study, which provided the basis for further researches for biological characteristics and endangered mechanisms of F. sinkiangensis through transcriptome sequencing.

Ferula sinkiangensis, EST-SSRs, high-throughput sequencing, molecular marker

10.11842/wst.2016.02.011

R282.2

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-07

＊ 新疆維吾爾自治區(qū)科技廳優(yōu)秀青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)項(xiàng)目（2013721042）：基于高通量測(cè)序技術(shù)的瀕危藥用植物新疆阿魏開花調(diào)控基因的挖掘，負(fù)責(zé)人：王果平。

＊＊ 通訊作者：李曉瑾，研究員，主要研究方向：中藥資源。