王志科，魯 放，熊 超，孫 偉＊＊，薛建平

（1.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 淮北 235000；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

Bar-HRM技術(shù)在人參和西洋參藥材鑒定中的應(yīng)用研究＊

王志科1，2，魯 放1，2，熊 超2，孫 偉2＊＊，薛建平1＊＊

（1.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 淮北 235000；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京 100700）

目的：采用 高分辨率熔解曲線技術(shù)（HRM），應(yīng)用ITS2序列對(duì)人參和西洋參藥材進(jìn)行快速鑒別，為規(guī)范市場(chǎng)藥材管理提供一 個(gè)新的分子檢測(cè)手段。方法：收集人參、西洋參以及購(gòu)買人參商品粉末藥材，提取DNA，選擇ITS2作 為鑒別序列。在HRM-PCR條件下，建立人參和西洋參的標(biāo)準(zhǔn)高分辨熔解曲 線、熔解曲線 模型并確定Tm值；應(yīng)用該方法檢測(cè)市場(chǎng)隨機(jī)收集的10份人參商品。結(jié)果：通過(guò)比較分析，人參和西洋參能夠很好的區(qū)分開(kāi)， 10份人參商品粉末的高分辨熔解曲線、 熔解曲線的峰形和T m值均與人參相吻合，初步說(shuō)明這10份人參商品都含有人參。 進(jìn)而將其PCR產(chǎn)物測(cè)序，以驗(yàn)證該結(jié)果。結(jié)論：Bar-HRM方法可簡(jiǎn)單、快速、 高通量化和可視化的實(shí)現(xiàn)人參商品粉末藥材的快速檢測(cè)。

高分辨熔解曲線 ITS2 人參 西洋參 分子鑒定 快速檢測(cè)

人參（Panax ginseng C. A. Meyer）和西洋參（P. quinquefolium Linn）均為五加科人參屬植物的干燥根[1,2]，皆系名貴藥材，因補(bǔ)虛療效顯著，臨床應(yīng)用日趨廣泛。人參大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津、安神；西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)精、清熱生津[3]。二者的性狀非常相似，市售粉末商品存在混偽[4]；并且在粉末狀 態(tài)下，用傳統(tǒng)的形態(tài)、分類 學(xué)鑒定方 法，很難將其性狀區(qū)分開(kāi)[5]。DNA條形碼（DNA Barcoding）鑒定是分子鑒定的最新發(fā)展，即通過(guò)比較物種中的一段標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段，對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確地識(shí)別和鑒定[6]。DNA條形碼技術(shù)具 有微量、快速、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠、對(duì)樣本要求較低等特點(diǎn)[7]，已廣泛用于中藥材鑒定領(lǐng)域。陳士林等[8]基于大樣本量實(shí)驗(yàn) ，提出ITS2是藥用植物鑒定的通用條形碼，并且有較高的鑒定能力。本研究的一個(gè)顯著特點(diǎn)是將DNA條形碼與高分辨率熔解曲線技術(shù)（High- Resolution Melting，HRM）結(jié)合，通過(guò)建立人參和西洋參標(biāo) 準(zhǔn)的熔 解曲線模型，并依據(jù)熔解曲線的峰形和Tm值差異，實(shí)現(xiàn)市售人參商品粉末藥材快速、可視化的真?zhèn)舞b別。到目前為止，尚無(wú)將Bar-HRM方法用于人參和西洋參藥材的鑒定的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

人參、西洋參各10份，分別采自東北長(zhǎng)白山地區(qū)，由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所孫偉助理研究員鑒定，并保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所生物中心實(shí)驗(yàn)室；市售人參商品 粉末樣品共10份，見(jiàn)表1。

1.2 儀器

Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析儀（Qiagen公司），微型離心機(jī)（Labogene公司），寧波新芝高通量組織研磨儀（寧波新芝生物科技公司），Epoch酶標(biāo)儀（BioTek公司），DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠），培清JS-680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司），微量移液器（Eppendorf公司），Invitrogen Qubit?3.0熒光計(jì)（life technologies公司）。

表1 藥材信息

1.3 試劑

新型快速植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京百泰克公司；無(wú)水乙醇購(gòu)自北京化工廠，為國(guó)產(chǎn)分析純；2×Taq PCR Mix 購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；Type-it HRM PCR Kit（400）購(gòu)自QIAGEN公 司。

1.4 試驗(yàn)方法1.4.1 DNA提取

取人參、西洋參以及市售商品人參粉末樣品各100-150 mg，利用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（中國(guó)Bio TeKe公司）提取總DN A，具體操作步 驟參 照試劑盒說(shuō) 明書。通過(guò)Qubit檢測(cè)DNA濃度，調(diào)整DNA終濃度約為50 ng·μL-1， 作為模板用于熔解曲線分析。

1.4.2 實(shí)時(shí)定量熒光PCR擴(kuò)增

以所提DNA為模板，在Rotor-Ge ne Q實(shí)時(shí) 熒光定量PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μL：2×HRMPCR Master Mix（Type-it HRM PCR Kit（400））12.5 μL、正向引物ITS2F（2.5 μmol·L-1）1 μL、反向引物ITS3R（2.5 μmol·L-1）1 μL、模板DNA 1 μL、加RNase-Free Water（ddH2O）補(bǔ)齊到25 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃45 s，40個(gè)循環(huán)；添加熔解曲線：94℃ 2 s。引物序列 為ITS2F：5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'；ITS3R：5'-GACGCTTCTCCAGACTA CAAT-3'。

1.4.3 PCR擴(kuò)增

對(duì)人參、西洋參以及市售人參樣品，用ITS2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 7.5 μL，引物（2.5 μmol·L-1）各1 μL，模板DNA 2 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)[9]。

1.4.4 電泳

取2 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，用DYY-6C型電泳儀進(jìn)行電泳。電泳條件為：1×TAE電泳緩沖液，濃度1%瓊脂糖凝膠，恒壓130 V，電泳時(shí)間15 min，用培清JS-680B全自動(dòng)凝膠成像分析儀拍照記錄，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。經(jīng)電泳鑒定后，條帶明亮、單 一，大小為500 bp，并送到生物公司測(cè)序。PC R擴(kuò)增 產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后，使用A BI 3730XL測(cè)序儀（Applied Biosystems Co，USA）雙向測(cè)序。

1.4.5 測(cè)序

測(cè)序峰圖用CodonCode Align（Codon Code Co，USA）軟件進(jìn)行校對(duì)拼接，去除引物區(qū)，使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S以獲得ITS2間隔區(qū)序列[10]，在NBCI上比對(duì)信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)DNA質(zhì)量分析

使用Epoch酶標(biāo)儀（中國(guó)Bio TeKe公司）對(duì)提取的DNA進(jìn)行分析。測(cè)得所提取樣品DNA A260/ A280均為1.8左右，質(zhì)量濃度為50-100 ng·μL-1，表明所提取的DNA質(zhì)量較好，基本沒(méi)有降解，酚類、蛋白質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)含量少，該DNA可用于下一步熔解曲線的分析。

2.2 人參和西洋參的熔解曲線分析

利 用Rotor-Gene Q Software version：2.3.1軟件，對(duì)人參和西洋參熔解曲線進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明人參和西洋參能夠很好的區(qū)分開(kāi)。盡管二者的高分辨熔解曲線的峰形很相似，Tm值很相近，但是又都不相同（見(jiàn)圖1）。Chen XC等[4]通過(guò)對(duì)人參和西洋參ITS2序列比較分析，發(fā)現(xiàn)人參與西洋參只存在兩個(gè)穩(wěn)定的SNP變異位點(diǎn)，分別為第32、43位點(diǎn)。所有人參樣品的ITS2序列的第32位為C，第43位為T，而所有西洋參樣品的ITS2序列的第32位為T，第43位為C。這表明這兩個(gè)SNP位點(diǎn)可特異性的用于鑒定人參和西洋參，也揭示二者ITS2序列非常高的同源性。這與熔解曲線的峰形相似、Tm值很相近是一致的。

2.3 人參商品粉末樣品的熔解曲線分析

同樣利用Rotor-Gene Q Software version：2.3.1軟件，對(duì)人參商品粉末樣品的熔解曲線進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們均與西洋參能夠很好的區(qū)分開(kāi)，且10份市售人參商品粉末樣品的高分辨熔解曲線、熔解曲線的峰形和Tm值均與人參相吻合（見(jiàn)圖2）。本研究說(shuō)明了10份市售人參商品粉末樣品中含有人參。為了進(jìn)一步說(shuō)明問(wèn)題，又將這10份市售人參商品粉末樣品的PCR產(chǎn)物送去測(cè)序。

2.4 測(cè)序結(jié)果分析

Blast結(jié)果顯示：10份市售人參商品粉末樣品都是人參，與HRM檢測(cè)結(jié)果完全一致。

圖1 人參和西洋參熔解曲線模型

圖2 市售人參商品粉末樣品的溶解曲線

3 討論

HRM是一種新型分子診斷技術(shù)，可結(jié)合飽和熒光染料、未標(biāo)記探針和實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行基因突變檢測(cè)與基因分型，具有高通量、低成本、簡(jiǎn)單快捷、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度和特異性高以及真正閉管操作等優(yōu)點(diǎn)[11]，在中藥真?zhèn)舞b定中有著廣泛應(yīng)用前景。本研究將Bar-HRM方法 成功的用于人參商品粉末藥材的快速檢測(cè)，為規(guī)范市場(chǎng)藥材管理提供一個(gè)新的分子檢測(cè)手段。DNA條形碼技術(shù)具有微量、準(zhǔn)確可靠、定性的優(yōu)點(diǎn)，而HRM技術(shù)具有形象、直觀、可視化特點(diǎn)。Sahachat S等[12]利用Bar-HRM技術(shù)快速、可靠地檢測(cè)出在桂葉山牽牛草藥產(chǎn)品中有毒的大托葉豬屎豆，Aliki X等[13]用該方法鑒定草藥茶葉，都已證明它是一種可行的鑒定方法。

關(guān)于人參和西洋 參鑒定的方法有很多，現(xiàn)有理化鑒定是一種常用的檢測(cè)方法，如薄層色譜法、HPL C法和光譜法，其基于樣品中化合物的種類及含量分析，但都相對(duì)比較繁雜，且易受環(huán)境條件的影響而最終影響鑒定結(jié)果[14,15]。Lo YT等[16]研究發(fā)現(xiàn)人參湯中的DNA也可以進(jìn)行分子鑒定。詹鑫婕等[17]用PCR-SSCP方法鑒定人參和西洋參，但實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程相對(duì)復(fù)雜。獲得高質(zhì)量的DNA是本試驗(yàn)的關(guān)鍵，對(duì)DNA提取試劑盒操作方法進(jìn)行了優(yōu)化。每管樣品量取100-150 mg，56℃水浴過(guò)夜（10-12 h）。

總之，在人參和西洋參藥材研究中，Bar-HRM已經(jīng)被證明是一種低成本、可信的物種鑒定方法。DNA條形碼和HRM技術(shù)的結(jié)合是一種可靠的、快速的和高靈敏的方法區(qū)分開(kāi)兩個(gè)物種，也可以用于其他物種的鑒定。

1 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2000年版一部).北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2000∶ 6.

2 全國(guó)中草藥委員會(huì).全國(guó)中草藥匯編(上冊(cè)).北京:人民衛(wèi)生出版社, 1976∶ 12.

3 李永國(guó),王崢濤.人參、西洋參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn), 2005, 6(5)∶ 10.

4 Chen X C, Liao B S, Song J Y, et al. A fast SNP identification and analysis of intraspecifi c variation in the medicinal Panax species based on DNA barcoding. Gene, 2013, 530∶ 39-43.

5 馬海琴,王志清,楊微.人參和西洋參的鑒別方法概述.特產(chǎn)研究, 2005, 3∶ 58.

6 陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定.北京:人民衛(wèi)生出版社, 2012∶ 4-37.

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9 鄔蘭,陳科力,孫偉,等.基于ITS2條形碼序列鑒定中藥材佩蘭及其混偽品.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2013, 15(3)∶ 410-411.

10 Keller A, Schleicher T, Schuhz J, et al. 5.8S-28S rRNA interaction and HMM-based ITS2 annotation. Gene, 2009, 430(1-2)∶ 50-57.

11 劉麗琴,張海燕,王捷.高分辨率熔解曲線分析技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)展.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2011, 11(24)∶ 5187-5189.

12 Singtonat S, Osathanunkul M. Fast and reliable detection of toxic Crotalaria spectabilis Roth. in Thunbergia laurifolia Lindl. herbal products using DNA barcoding coupled with HRM analysis. BMC Complement Altern Med, 2015(162)∶ 2-8.

13 Aliki X, Ioannis G, Apostolos K, et al. Multiplex HRM analysis as a tool for rapid molecular authentication of nine herbal teas. Food Control, 2016, 60∶ 113-116.

14 叢登立.人參、西洋參鑒別研究進(jìn)展.人參研究, 2015, 1∶ 6-7.

15 陳士林,郭寶林,張貴君,等.中藥鑒定學(xué)新技術(shù)新方法研究進(jìn)展.中國(guó)中藥雜志, 2012, 37(8)∶ 1050-1051.

16 Lo Y T, Li M, Shaw P C. Identification of constituent herbs in ginseng decoctions by DNA markers. Chin Med, 2015, 10(1)∶ 2-8.

17 詹鑫婕,田程,張媛,等.基于ITS2條形碼SNPs的人參和西洋參PCR-SSCP分子鑒別研究.中國(guó)中藥雜志, 2012,37(24)∶ 3748-3749.

Application of Bar-HRM Technology in Identification of Medicinal Material of Panax Ginseng and Panax Quinquefolium

Wang Zhike1, 2, Lu Fang1, 2, Xiong Chao2, Sun Wei2, Xue Jianping1
(1. School of Life Sciences, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, China; 2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China)

The investigation aimed to identify medicinal materials Panax ginseng and Panax quinquefolium quickly. High-resolution melting (HRM) technology was adopted and ITS2 was used as authentication sequences, in order to provide a new molecular detection method for regulating the management of medicinal herbs. Employed Panax ginseng, Panax quinquefolium and purchased commercial powder products of Panax ginseng were collected for DNA extraction, and ITS2 was chosen as the authentication sequences. In HRM-PCR condition, high resolution melting curves and dissolved curve model of Panax ginseng and Panax quinquefolium wereestablished and Tm value was confirmed. Ten shares of commercial Panax ginseng powder samples that randomly collected were detected and identified by this method. As a result, Panax ginseng and Panax quinquefolium were easily distinguished, and ten shares of commercial powder samples of Panax ginseng were identified based on characteristics of high resolution melting curves, dissolved curve and Tm value, which coincided with Panax ginseng. This study initially showed that the ten shares of commercial products contained Panax ginseng. Then the PCR products were sequenced and the result was verified. It was concluded that Bar-HRM method can realize quickly identification of commercial powdered Panax ginseng materials simply, rapidly, with high-throughput quantitatively and visibly.

High resolution melting curve, ITS2, Panax ginseng, Panax quinquefolium, molecular identification, rapid detection

10.11842/wst.2016.02.008

R282.5

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜 張志華，責(zé)任譯審：朱黎婷 王 晶）

2015-11-29

修回日期：2015-12-07

＊ 科學(xué)技術(shù)部國(guó)家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（2013ZX09301307）：基于中醫(yī)臨床轉(zhuǎn)化的中藥創(chuàng)新品種研發(fā)，負(fù)責(zé)人：陳士林。

＊＊ 通訊作者：孫偉，博士，助理研究員，主要研究方向：中藥資源與中藥分子鑒定；薛建平，博士，教授，主要研究方向：藥用植物生物技術(shù)。