籍龍杰 陸勝勇# 杜穎哲 陳 彤 李曉東 嚴建華黃俊卿 Masafumi Nakamura Hiroshi Murata

(1.浙江大學能源清潔利用國家重點實驗室，熱能工程研究所，浙江 杭州 310027；2.株式會社日吉，日本 近江八幡市523-0806)

二噁英是一類具有相似化學結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及生物效應的多氯代三環(huán)芳香族有毒化合物[1-2]。根據(jù)分子中氯原子的取代位置和數(shù)目不同，該類化合物包括75種多氯代二苯并-對二噁英(PCDDs)、135種多氯代二苯并呋喃(PCDFs)[3]。另據(jù)世界衛(wèi)生組織規(guī)定，209種多氯聯(lián)苯(PCBs)滿足以下條件可連同二噁英統(tǒng)稱為二噁英類：(1)結(jié)構(gòu)上與PCDDs/PCDFs(簡寫PCDD/Fs)類似；(2)可以與芳香烴受體連接；(3)產(chǎn)生生物化學毒性；(4)在食物鏈中富集不易降解[4]。近年來，二噁英類化合物引起的毒性效應得到人們的普遍關(guān)注，包括免疫毒性、發(fā)育和生殖毒性、神經(jīng)毒性和致癌性以及持續(xù)的生物累積行為和能力[5-6]。其中，PCDD/Fs在環(huán)境中含量少但是毒性大，PCBs在一些被污染的地方含量大，但是毒性較小。另外，多環(huán)芳烴(PAHs)由于較易分解，雖然不滿足二噁英類物質(zhì)的定義，但是相關(guān)研究表明，PAHs可以結(jié)合到芳香烴受體(AhR)上，具有潛在的致毒性[7]。

然而，二噁英并不是目標產(chǎn)物，它們是由含碳、氧、氫和氯的物質(zhì)通過加熱反應過程產(chǎn)生的副產(chǎn)物。這些化合物的最主要產(chǎn)生源頭為廢棄物焚燒，尤其在煙氣冷卻階段會產(chǎn)生大量的二噁英[8-10]。例如，ALCOCK等[11]研究表明，英國全國PCDD/Fs年排放量大約為560～1 100 g I-TEQ，而生活垃圾焚燒貢獻了總PCDD/Fs毒性當量排放濃度(排放到大氣環(huán)境)的30%～50%。值得注意的是，焚燒爐空氣凈化裝置中收集的飛灰可以認為是環(huán)境中PCDD/Fs的主要排放源。ABAD等[12]提出西班牙一座生活垃圾焚燒爐在1998—1999年期間8次分析檢測中，煙氣、飛灰和底灰中二噁英的平衡質(zhì)量分數(shù)分別為0.095%～0.315%、69.89%～97.47%、8.31%～29.79%。此外，根據(jù)我國PCDD/Fs排放清單，2004年廢棄物焚燒通過灰渣形式排放的PCDD/Fs為1 147 g I-TEQ，而通過煙氣排放為610.5 g I-TEQ。另外，根據(jù)《生活垃圾填埋場污染控制標準》(GB 16889—2008)的要求，生活垃圾焚燒飛灰經(jīng)處理后二噁英低于3 μg TEQ/kg之后方可進入生活垃圾填埋場處置，否則，以危險廢棄物對待。因此，評估廢棄物焚燒爐產(chǎn)生的飛灰中二噁英類化合物的含量和分布狀況有助于選擇合理的處置方式，掌握相應的污染情況。

2010年，九部委聯(lián)合發(fā)文《關(guān)于加強二噁英污染防治的指導意見》指出，所在地環(huán)保部門應對廢棄物焚燒裝置排放情況每兩個月開展1次監(jiān)督性監(jiān)測，對二噁英的監(jiān)督性監(jiān)測應至少每年開展1次，這個指導意見將進一步導致需要進行二噁英檢測分析樣品的大量激增。目前，二噁英分析的常用方法是高分辨氣相色譜/質(zhì)譜(HRGC/HRMS)分析技術(shù)，它是國際上通用的標準方法[13]。但是，儀器分析時間較長，花費較高，而且操作較為復雜。所以，發(fā)展一種快速、便宜和可靠的分析篩選樣品中二噁英含量的方法是十分必要的。化學活化熒光素酶報告基因法(CALUX)，即CALUX生物檢測法，作為一種更加快速和便宜的檢測方法可以為所有AhR活性提供綜合檢測，并且可以進行風險評估，所以該方法可以作為儀器分析方法的替代選擇，目前也已被某些發(fā)達國家作為標準方法并進行相關(guān)介質(zhì)的二噁英篩查。然而，不同國家的垃圾特性不一，尤其是我國垃圾分類機制尚未健全，垃圾含水量大且組分復雜，燃燒飛灰中的二噁英分布特性與其他國家存在一定差異。目前，我國也正在組織國內(nèi)的生物檢測實驗室對該方法進行對比驗證，力圖在2016年出臺《固體廢物 二噁英類的篩查報告基因法》等相關(guān)國家標準。此標準的建立可以滿足飛灰等固體廢物中二噁英的篩查測定，有效利用成本較低的檢測方法，實現(xiàn)快速地為環(huán)境管理提供服務(wù)和技術(shù)支持，為推動CALUX生物檢測法在我國的發(fā)展以及為確立國家標準法提供相應的實驗技術(shù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

研究二噁英類生物檢測法的主要目的是簡化二噁英類分析流程，并找出快速檢測的結(jié)果與HRGC/HRMS結(jié)果之間的換算系數(shù)，從而可以利用快速檢測的結(jié)果和換算系數(shù)來推算 HRGC/HRMS 的結(jié)果。通過對來自垃圾焚燒廠的飛灰樣品(樣本數(shù)n=42)同時進行HRGC/HRMS與CALUX檢測，測定兩種方法的相關(guān)性和轉(zhuǎn)換系數(shù)。結(jié)果顯示，兩種方法檢測的實驗結(jié)果之間相關(guān)性很強，CALUX生物檢測法可以作為HRGC/HRMS的替代方法并予以推廣。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 二噁英分析前處理試劑

丙酮、甲苯、正己烷和二氯甲烷購自日本J.T.Baker公司；Celite助濾劑硅藻土和硅膠購自西格瑪奧迪里奇公司；鹽酸、無水乙醇、次氯酸鈉和無水硫酸鈉為國產(chǎn)；1%(質(zhì)量分數(shù)) XCARB/celite購自美國XDS公司；用于HRGC/HRMS分析的分散硅膠活性炭購自日本關(guān)東化學株式會社；二噁英標準樣品購自劍橋同位素實驗室。

2,3,7,8-四氯代二苯并二噁英(2,3,7,8-TCDD)標準樣品，購自美國Cerilliant公司；99.5%(質(zhì)量分數(shù))二甲基亞砜制劑(DMSO)，購自日本和光純藥公司；熒光素酶分析系統(tǒng)(熒光素酶試劑)和細胞培養(yǎng)細胞溶解溶劑，購自美國普洛麥格公司；胰蛋白酶溶液、磷酸緩沖溶液(PBS)和細胞培養(yǎng)液(包括RPMI 1640培養(yǎng)液，8%(質(zhì)量分數(shù))胎牛血清和1%(質(zhì)量分數(shù))青霉素-鏈霉素雙抗溶劑)，購自美國生命技術(shù)公司；H1L6.1c2細胞系(小鼠肝癌細胞重組細胞)，購自美國XDS公司；細胞培養(yǎng)、測定、分析用96孔板(Costar 3610)，購自美國康寧公司。

42個飛灰樣品分別取自中國不同地區(qū)的生活垃圾焚燒爐、工業(yè)垃圾焚燒爐和醫(yī)療垃圾焚燒爐。

1.2 實驗過程

1.2.1 HRGC/HRMS檢測法

分析過程嚴格按照《固體廢物 二噁英類的測定 同位素稀釋高分辨氣相色譜—高分辨質(zhì)譜法》(HJ 77.3—2008)標準進行，利用日本JEOL公司的JMS-800D型HRGC/HRMS進行檢測。利用HRGC/HRMS測定的PCDD/Fs濃度定義為“I-TEQ”。

1.2.2 CALUX生物檢測法

首先，飛灰樣品經(jīng)酸泡、過濾后分別進行液液萃取和索氏提取，將萃取后溶液和索提溶液混合后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1～2 mL。利用33%(質(zhì)量分數(shù))硫酸硅膠柱和活性炭柱組成的二連柱進行精制。淋洗液經(jīng)真空離心濃縮儀濃縮后用正己烷定容至4 mL以備熒光測定。進行熒光檢測時，首先確定稀釋倍數(shù)。然后向13 mL試管中加入4 μL DMSO并取相應量的樣品加入試管中，濃縮至正己烷完全揮發(fā)，加入400 μL RPMI 1640培養(yǎng)液混合均勻。取出已經(jīng)播種H1L6.1c2細胞的96孔板，移除培養(yǎng)液后，每孔加入190 μL混合液。再次培養(yǎng)20～24 h后，利用化學發(fā)光酶標儀(Berthold Centro LB 960,德國)，結(jié)合熒光基質(zhì)溶液，測定熒光發(fā)光量，通過發(fā)光度計算 PCDD/Fs濃度。利用CALUX生物檢測法測定的PCDD/Fs濃度定義為“CALUX-TEQ”。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線的制作

用標準溶液制作標準曲線后，根據(jù)此標準曲線計算樣品的濃度。將DMSO配制的11個梯度濃度的2,3,7,8-TCDD標準溶液(STD 0至STD 11)，按照CALUX方法操作，得出相對發(fā)光單位(RLU)，RLU定義為樣品中的二噁英與基質(zhì)反應后發(fā)光，發(fā)光強度經(jīng)化學發(fā)光酶標儀檢測后所呈現(xiàn)出的數(shù)值。帶入表1中一系列理論式，得到的標準曲線見圖1。

圖1 2,3,7,8-TCDD濃度—應答曲線Fig.1 Dose-response curve of 2,3,7,8-TCDD standard solution

2.2 標準曲線的核實

標準曲線的靈敏度變化管理是十分重要的，必須進行確認，并記錄。CALUX生物檢測方法利用在每個96孔盤的標準溶液區(qū)域加入DMSO、不同濃度的標準溶液和質(zhì)量控制(QC)標準溶液控制檢測結(jié)果的準確性和可靠性。因為STD 5為STD 0至STD 11中間濃度的標準物質(zhì)，其發(fā)光量大約位于每次試驗標準曲線的中部定量區(qū)域，而QC標準溶液也為已知濃度的標準溶液。為核實定量操作是否被準確進行，使用管理限界μ±2σ(μ為算術(shù)平均值，σ為測定量的標準偏差)，對標準曲線進行核實。由STD 5(2,3,7,8-TCDD質(zhì)量濃度7.81 pg/mL)以及QC標準溶液的測定值，求出測定量(毒性當量)，記錄并保存在休哈特控制圖(見圖2)上，兩個控制圖都利用西部電氣公司編制的統(tǒng)計質(zhì)量控制手冊推薦的判定規(guī)則來檢測控制圖的非隨機性模式[14]。

(2)化探異常特標志：區(qū)內(nèi)金礦化均在化探異常范圍，化探分散流及次生暈Ag、Au、Pb、Zn、Sb等元素綜合異常區(qū)是找礦的有利部位。

表1 2,3,7,8-TCDD標準溶液測定值及變換值

注：1)指96孔板上每個孔里含有的2,3,7,8-TCDD的質(zhì)量；2)B=A/190×1 000；3)C=ln(B×100)。

注：平均值用μ表示，警告值用μ+σ表示。圖2 STD 5和QC標準溶液的質(zhì)量控制圖Fig.2 Quality control chart of STD 5 and QC standard solution

標準溶液B/(pg·mL-1)μ/(pg·mL-1)σ/(pg·mL-1)C.V./%偏離度/%備注STD0250.00257.00173.0067.502.80STD1125.00189.00106.0056.0051.20STD262.5062.2011.6018.600.48定量上限STD331.3031.005.5417.900.96STD415.6015.501.006.430.64STD57.817.820.344.330.13STD63.914.170.276.396.65STD71.952.300.3013.1017.95定量下限STD89.77×10-10.970.2626.800.72檢出下限STD94.88×10-1STD102.44×10-1

通過控制圖的處置基準，根據(jù)管理限界μ±2σ的脫離狀況做如下規(guī)定：即僅有1點超出管理限界，也要在究明原因并進行改善的同時，進行再測定，對進行改善所采取的措施以及再測定的結(jié)果進行記錄；而且，即使在管理限界內(nèi)，與基準值相比，如果有一定的離脫傾向或者連續(xù)有偏離的測定值的情況下，也要究明原因，根據(jù)情況，在進行改善的同時進行再測定。

圖2中共有50個96孔盤的STD 5和QC標準溶液的數(shù)據(jù)，50個96孔盤數(shù)值基本都控制在警告值以內(nèi)，其中STD 5和QC標準的平均值分別為7.76、2.89 pg/mL，它們的警告限值分別為7.23～8.31、2.12～3.66 pg/mL，符合西部電氣公司編制的統(tǒng)計質(zhì)量控制手冊中的判定準則。

2.3 檢出下限以及定量范圍

利用2.1節(jié)中DMSO配制的11個濃度梯度的2,3,7,8-TCDD標準溶液進一步確定CALUX方法的檢出下限以及定量范圍。對于所配制的用來計算檢出下限的標準溶液，每個濃度的標準溶液都要進行n≥5的測定，并定量計算測定值(毒性等價量)的μ、σ以及變異系數(shù)(C.V.)，制作精度管理圖，從表2得出檢出下限以及定量范圍。

針對由標準物質(zhì)濃度的定量值所獲得的變異系數(shù)(n=5)，規(guī)定30%以下的最小濃度值為檢出下限(0.977 pg/mL)，20%以下為定量范圍，其范圍內(nèi)的最小濃度值為定量下限值(1.95 pg/mL)，定量范圍為1.95～62.50 pg/mL(STD 7至STD 2)。對于標準物質(zhì)的檢出下限以及定量范圍，至少要每隔6個月進行1次確認，查看其是否發(fā)生變化。還有，當測定條件發(fā)生大幅度改變時(機器、試劑或者設(shè)施等發(fā)生變化以及測定負責人發(fā)生變化等)也要進行確認。

2.4 實際飛灰樣品的分析檢測

實驗得到42個飛灰樣品分別進行HRGC/HRMS檢測和CALUX檢測的二噁英濃度，兩者的相關(guān)性見圖3。

由HRGC/HRMS測得的結(jié)果為0.003～12.904 ng TEQ/g(平均值為2.260 ng TEQ/g)，而CALUX測得的數(shù)據(jù)為0.019～25.170 ng TEQ/g(平均值為5.670 ng TEQ/g)，說明CALUX檢測范圍比較寬且滿足日本規(guī)定的CALUX方法對飛灰等固體樣品定量下線為1 ng TEQ/g的要求。同時，CALUX結(jié)果高于HRGC/HRMS所測得的結(jié)果1.5～5.6倍(平均值為3.01倍)，表明所有CALUX值均高于HRGC/HRMS測定值。另外，由圖3看出，兩者線性相關(guān)性很高(R=0.96)，證實CALUX生物檢測方法可以作為測定飛灰樣品中PCDD/Fs濃度的一種可選篩選方法或者半定量檢測方法。CALUX-TEQ較高可以歸因于以下幾個原因：(1)毒性當量因子(I-TEF)與CALUX相對效能(REP)值之間的差異。對比I-TEF和REP值(見表3)的大小，發(fā)現(xiàn)PCDFs的REP值明顯高于I-TEF，若將HRGC/HRMS測得的PCDD/Fs同系物濃度與相對應的REP相乘得到的毒性當量值將明顯高于與I-TEF相乘得到的結(jié)果。這可能是由于CALUX對PCDFs的反應效應更高，使得CALUX-TEQ的結(jié)果高于HRGC/HRMS的計算結(jié)果。(2)CALUX-TEQ中包含的同系物濃度中存在一些無毒同系物，盡管其濃度值沒有包含于I-TEQ，但是也可能活化AhR和熒光素酶，使得RLU增加，導致CALUX的測量結(jié)果進一步升高。(3)CALUX中存在其他AhR配體可以激發(fā)芳香烴受體和熒光素酶活性，但是在HRGC/HRMS分析中沒有定量測定，這些化合物包括其余高持久性污染物，例如溴代二噁英(PBDD/Fs)、多溴聯(lián)苯(PBBs)、多鹵代二噁英和呋喃(PXDD/Fs，X=Cl/Br)和一些多氯化萘(PCNs)同系物；低持久性污染物，例如PAHs；以及一些自然化合物[15]。一些研究也表明，某些PBDD/Fs甚至比對應的PCDD/Fs毒性相似甚至更強。

圖3 兩種方法檢測灰渣中二噁英類物質(zhì)結(jié)果的相關(guān)性Fig.3 Correlation between the values obtained from the CALUX and HRGC/HRMS

根據(jù)我國42個飛灰樣品的結(jié)果，得到的由CALUX-TEQ預測HRGC/HRMS檢測結(jié)果的換算系數(shù)為0.332。該結(jié)果高于日本規(guī)定的飛灰樣品的換算系數(shù)(0.318)，這在一定程度上說明我國飛灰樣品具有區(qū)別于日本的飛灰樣品的特征。另外，周志廣等[16]在利用此方法測定煙氣中二噁英類物質(zhì)時得到的換算系數(shù)為0.379，說明不同介質(zhì)之間，換算系數(shù)也會有所不同。在我國實際應用時，需要具體考慮。

表3 HRGC/HRMS與CALUX檢測方法毒性當量因子的對比

日本規(guī)定生物檢測法測定值換算后只要介于HRGC/HRMS測定值的0.5～2.0倍就被認為有效。所檢測的42個飛灰樣品中，當飛灰中的二噁英濃度較低時，兩者間比值(CALUX/HRGC—HRMS)往往低于0.5,這可能是由于二噁英濃度過低的樣品中其他有機污染物的存在容易對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。因而，在處理低濃度樣品時要格外小心。

3 結(jié) 論

通過對比CALUX生物檢測法和HRGC/HRMS法對我國飛灰樣品的檢測數(shù)據(jù)，得出了兩者的換算系數(shù)。結(jié)果表明，兩者存在很強的相關(guān)性(R=0.96)。證實CALUX生物檢測方法可以作為確定飛灰樣品中PCDD/Fs濃度的可選篩選方法或者半定量檢測方法。不過，由于樣品的差異，操作環(huán)境的區(qū)別，不同的國家換算系數(shù)可能存在差異。而且，在不同介質(zhì)之間，換算系數(shù)也不同。如果增加樣品數(shù)量，適當修正換算系數(shù)，使其具有更普遍的適應性，將會更有利于推廣CALUX生物檢測法在中國檢測PCDD/Fs濃度方面的應用。

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