?葉英林?

（1.湖南省蔬菜研究所，湖南　長沙　410125；2.湖南大學(xué)隆平分院，湖南　長沙　410125）

植物轉(zhuǎn)基因抗性策略研究進(jìn)展

葉英林1,2

（1.湖南省蔬菜研究所，湖南長沙410125；2.湖南大學(xué)隆平分院，湖南長沙410125）

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)使植物獲得抗病性是控制植物病毒感染的一種重要技術(shù)途徑。RNA干擾技術(shù)的出現(xiàn)為植物轉(zhuǎn)基因抗性策略的研究提供了新思路。植物轉(zhuǎn)基因抗性產(chǎn)生方法主要是通過表達(dá)不同的病毒蛋白（外殼蛋白、復(fù)制蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白及其他病毒蛋白）、RNAs(反義RNA、衛(wèi)星RNA、缺陷干擾RNA、發(fā)夾RNA及人工微小RNA)、非病毒基因（核酸酶、抗病毒蛋白抑制子及植物體）、宿主來源的抗性基因（顯性抗性基因和隱性抗性基因）及各種宿主防御反應(yīng)因子等。介紹了以上幾種抗性策略并分析了目前尚存在的問題，以期為植物轉(zhuǎn)基因抗性策略研究的學(xué)者提供參考。

轉(zhuǎn)基因抗病性；衛(wèi)星RNA；發(fā)夾RNA；人工微小RNA

自首次報(bào)道轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)植物病毒序列并表現(xiàn)抗病性以來，人們嘗試了各種不同類型的抗性產(chǎn)生方法。這些方法主要包括表達(dá)不同的病毒序列、非病毒序列、宿主來源的抗性基因及各種宿主防御反應(yīng)因子等。筆者主要圍繞以上各種成分或序列介導(dǎo)產(chǎn)生的抗性展開綜述。

1　病毒蛋白介導(dǎo)的抗性策略

1.1外殼蛋白介導(dǎo)的抗性

外殼蛋白（Coat protein，CP）介導(dǎo)的抗性方法主要通過在轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)病毒的外殼蛋白基因從而獲得抗此種病毒或相關(guān)病毒的能力。1986年Abel等[1]將煙草花葉病毒（TMV）的外殼蛋白編碼序列導(dǎo)入到煙草中，獲得了具有TMV抗性的抗病毒植株。隨后，科學(xué)家們先后將黃瓜花葉病毒（CMV）、馬鈴薯Y屬病毒（PVY）、辣椒重癥花葉病毒（PepSMV）等的外殼蛋白基因?qū)霟煵葜仓旰螅玫搅丝共《局仓辍?/p>

外殼蛋白介導(dǎo)的抗性可能是蛋白質(zhì)水平介導(dǎo)的干擾或RNA水平的沉默的結(jié)果，也可能同時(shí)存在蛋白質(zhì)和RNA兩種作用機(jī)制。此外，當(dāng)接種高病毒劑量或接種病毒RNA時(shí)，外殼蛋白介導(dǎo)的抗性普遍存在容易被打破的共性[2-4]。

1.2復(fù)制酶基因介導(dǎo)的抗性

復(fù)制酶（Replicase）介導(dǎo)的抗性方法主要通過表達(dá)病毒復(fù)制酶通讀序列、全長序列、突變序列及缺失序列獲得具有抗病毒能力的植株。1990年Golemboski等[5]將TMV的54KD復(fù)制酶基因轉(zhuǎn)入煙草植株，獲得了高抗TMV的轉(zhuǎn)基因抗病毒植株。研究表明，復(fù)制酶基因介導(dǎo)的抗性策略產(chǎn)生的抗性不具廣譜性，接種非常高劑量的病毒時(shí)表現(xiàn)出強(qiáng)抗性，接種病毒RNA時(shí)也表現(xiàn)出高水平的抗性[6]，但是表達(dá)缺失型復(fù)制酶蛋白編碼序列表現(xiàn)出廣譜抗性[7]。

關(guān)于復(fù)制酶基因介導(dǎo)的抗性機(jī)制尚無定論。多數(shù)早期的研究認(rèn)為復(fù)制酶基因介導(dǎo)的抗性是由蛋白介導(dǎo)的，稍后的研究卻發(fā)現(xiàn)存在RNA介導(dǎo)的過程，也許復(fù)制酶基因介導(dǎo)的抗性在蛋白質(zhì)水平和RNA水平存在互補(bǔ)或替換的過程[6]。

1.3運(yùn)動(dòng)蛋白介導(dǎo)的抗性

運(yùn)動(dòng)蛋白（Movement protein，MP）介導(dǎo)的抗性方法主要通過表達(dá)失去功能的缺失形式運(yùn)動(dòng)蛋白編碼序列而獲得具有廣譜抗性的轉(zhuǎn)基因植株。Lapidot等[8]將TMV缺失突變的30KD運(yùn)動(dòng)蛋白導(dǎo)入煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草不僅可以抑制TMV的侵染，同時(shí)也能抑制其他科屬病毒的侵染。Kaplan等[9]將具有功能的TMV和PVX運(yùn)動(dòng)蛋白導(dǎo)入到煙草中發(fā)現(xiàn)會(huì)促進(jìn)病毒運(yùn)動(dòng)或者對(duì)病毒運(yùn)動(dòng)無影響。許多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，只有表達(dá)缺失或異源形式的MP才能獲得抗性植株[8-10]。

1.4其他病毒蛋白介導(dǎo)的抗性

Harshmi等[11]將棉花曲葉病毒（CLCuV）的復(fù)制起始蛋白（Replication initiator protein，Rep）導(dǎo)入棉花中獲得了轉(zhuǎn)基因抗性植株。Maiti等[12]在表達(dá)煙草脈斑病毒（TVMV）的NIa蛋白的轉(zhuǎn)基因植株中觀察到了TVMV抗性。Germundesson等[13]將馬鈴薯A屬病毒（PVA）的P1蛋白編碼序列導(dǎo)入本氏煙中，獲得了完全抗PVA的轉(zhuǎn)基因植株。Savenkov等[14]將PVA的HC-Pro導(dǎo)入到本氏煙中，轉(zhuǎn)基因本氏煙沒有表現(xiàn)出初始抗性，但是上層沒有病毒的葉片表現(xiàn)出了恢復(fù)表型，同時(shí)對(duì)PVA的超級(jí)感染具有抗性。HC-Pro介導(dǎo)的抗性程度及有效范圍在不同的實(shí)驗(yàn)中存在較大的差異。HC-Pro介導(dǎo)的抗性取決于 HC-Pro蛋白和HCPro基因RNA沉默過程中合成的抑制子的表達(dá)，也可能受入侵病毒產(chǎn)生的HC-Pro和siRNA水平影響[6]。此外，HC-Pro的轉(zhuǎn)基因表達(dá)也具有加強(qiáng)宿主防御反應(yīng)的作用，可以增加宿主對(duì)不相關(guān)病毒的的抗性[6]。

2　病毒RNA介導(dǎo)的抗性策略

2.1非編碼單鏈RNA介導(dǎo)的抗性

非編碼單鏈RNA介導(dǎo)的抗性應(yīng)用的RNA片段主要有三類：一是病毒基因組的非編碼區(qū)域，如3'和5'非翻譯區(qū)域或基因間區(qū)域；二是不翻譯的正反義開放閱讀框；三是非編碼反義RNA或與包含病毒開放閱讀框序列互補(bǔ)的DNA序列。通常3'和5'非翻譯區(qū)域與相應(yīng)的病毒基因序列同是反義或正義方向表達(dá)，所以每個(gè)部分的抗性貢獻(xiàn)很難區(qū)分開。Zaccomer等[15]將融合有CAT基因的蕪菁黃花葉病毒（TYMV）的3'非翻譯區(qū)域100 bp序列導(dǎo)入到油菜中，轉(zhuǎn)基因油菜表現(xiàn)出延遲感病，并且這種延遲存在劑量效應(yīng)。Bendahmane等[16]將番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）Rep基因的反義RNA導(dǎo)入煙草，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)TYLCV表現(xiàn)出良好的抗性。Park等[17]構(gòu)建水稻條斑病毒（RSV）CP基因的反義RNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻，63%的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了RSV抗性。

2.2衛(wèi)星RNA介導(dǎo)的抗性

衛(wèi)星RNA介導(dǎo)的抗性主要是利用具有減毒作用的衛(wèi)星RNA變異株實(shí)現(xiàn)，即利用衛(wèi)星RNA抑制病毒的感染、復(fù)制及癥狀表達(dá)。衛(wèi)星RNA抗性策略生物安全性較高，但含有衛(wèi)星RNA的病毒種類少，且只在農(nóng)作物生長的晚期表現(xiàn)抗性。目前，局限應(yīng)用于煙草、牽?；ā⒗苯?、番茄等茄科類轉(zhuǎn)基因植物抗病性研究中。

關(guān)于衛(wèi)星RNA介導(dǎo)的抗性機(jī)制，仍然存在不少爭議。程英豪等[18]認(rèn)為衛(wèi)星RNA與病毒基因組在復(fù)制過程中爭奪RNA復(fù)制酶，病毒的復(fù)制受到抑制。Cillo等[19]認(rèn)為病毒復(fù)制水平的下調(diào)和轉(zhuǎn)基因指導(dǎo)下的衛(wèi)星RNA沉默是衛(wèi)星RNA抗性策略的分子基礎(chǔ)。Lin等[20]認(rèn)為衛(wèi)星RNA介導(dǎo)的抗性可能與轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)。

2.3缺陷干擾RNA/DNA介導(dǎo)的抗性

缺陷型核酸具有病毒復(fù)制不可或缺的序列，但在某些特定區(qū)域存在一定缺失，在某些病毒復(fù)制時(shí)會(huì)大量產(chǎn)生，可以大大地減少病毒全長基因組的積累，干擾了病毒的正常復(fù)制，進(jìn)而表現(xiàn)出抗病毒特性[6]。Rubio等[21]將番茄叢矮病毒（TBSV）缺陷干擾RNA轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出較為廣譜的番茄叢矮病毒類病毒抗性，這些病毒具有高度的序列同源性。

2.4核酶介導(dǎo)的抗性

包被在病毒RNA互補(bǔ)序列中的核酶分子以序列特異性方式切割病毒RNA并抑制病毒在宿主組織中積累，從而使植株表現(xiàn)抗病性。

Kwon等[22]將靶向CMV RNA1和RNA2保守前導(dǎo)序列的核酶結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了抗病毒特性。隨后，Huttner等[23]設(shè)計(jì)出了能同時(shí)靶向WMV和ZYMV多核酶序列。

2.5雙鏈RNA或發(fā)夾RNA介導(dǎo)的抗性

雙鏈RNA（Double-strand RNA， dsRNA）中同時(shí)具有正義或反義序列，這些序列被內(nèi)含子或其他間隔序列隔開。Waterhouse等[24]認(rèn)為在轉(zhuǎn)基因植物中同時(shí)表達(dá)正義和反義轉(zhuǎn)錄物可以提高轉(zhuǎn)化和再生株系中抗性株系的比例。具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的dsRNA在類Dicer原位核酸酶的作用下形成siRNA，siRNA進(jìn)入RNA沉默機(jī)制使轉(zhuǎn)基因植株獲得抗性[25]。dsRNA的初始產(chǎn)物是hpRNA，所以這種策略又叫做hpRNA抗性策略。

Smith等[26]首次運(yùn)用構(gòu)建PVY NIa蛋白酶編碼序列的hpRNA轉(zhuǎn)化煙草，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出抗病毒特性。近年來，hpRNA抗性策略作為轉(zhuǎn)基因植物抗性策略研究熱點(diǎn)，已在多個(gè)科屬的植物證實(shí)可以產(chǎn)生全抗的轉(zhuǎn)基因植株，特別適用于轉(zhuǎn)化和再生率低的作物，同時(shí)還可減少抗性株系的創(chuàng)制和篩選。通過構(gòu)建嵌合、融合hpRNA在同一個(gè)轉(zhuǎn)化載體中表達(dá)多種病毒序列，可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)抗多種病毒。

2.6人工微小RNA介導(dǎo)的抗性

人工微小RNA（amiRNA）抗性策略通過植物內(nèi)源miRNA與靶mRNA以完全互補(bǔ)匹配的方式相結(jié)合，高度特異性地指導(dǎo)靶mRNA的沉默而使植物獲得抗性。

amiRNA抗性策略中宿主植株的抗性水平的決定因素主要有3種：一是pre-miRNA骨架序列的選擇，主要影響amiRNA的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄后的剪接；二是amiRNA與靶向序列的互補(bǔ)水平，它決定了是否存在對(duì)相關(guān)病毒的交互保護(hù)作用；三是靶向的病毒基因組序列，直接影響病毒的抑制。研究表明，靶向病毒的RNA沉默抑制子的編碼序列比直接靶向衣殼蛋白序列或其他基因有效。

aimRNA抗性策略介導(dǎo)的抗性水平高、穩(wěn)定性強(qiáng)、安全性高，而且可以有效避免脫靶效應(yīng)及重組病毒的產(chǎn)生，但是可以被打破。Lafforgue等[27-28]認(rèn)為在aimRNA表達(dá)次佳時(shí)，TuMV可以產(chǎn)生抗性突破變異種。Martinez等[29]認(rèn)為先被其他病毒感染后，TuMV可以克服aimRNA介導(dǎo)的抗性。

3　非病毒介導(dǎo)的抗性策略

3.1核酸酶介導(dǎo)的抗性

Cao等[30]將大腸桿菌dsRNase轉(zhuǎn)入玉米植株中，轉(zhuǎn)基因玉米植株產(chǎn)生部分斐濟(jì)病毒屬水稻黑條矮縮病毒抗性（RBSDV）的抗性。Lee等[31-32]將具有催化特性的序列非特異性核酸酶導(dǎo)入到煙草植株中，轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出了較為廣譜的抗性，并且植株的生長沒有受到明顯影響。然而，Zhao等[33]將同樣的核酸酶導(dǎo)入到大白菜中卻發(fā)現(xiàn)只有少部分植株獲得了抗性，而且抗性很不穩(wěn)定。

3.2抗病毒抑制劑蛋白介導(dǎo)的抗性

植物來源的抗病毒蛋白有很多，但是僅有少部分進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因抗病毒研究并且表現(xiàn)出了抗病毒感染的特性。這些抗病毒蛋白主要包括核糖體失活蛋白（RIP）、病毒復(fù)制抑制劑蛋白（IVR-pro）、人工鋅指蛋白（AZP）、肽適配體、陽離子肽等。

Lodge等[34]將美洲商陸抗病毒蛋白轉(zhuǎn)入煙草和馬鈴薯中，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出優(yōu)良的抗性。后續(xù)的研究結(jié)果表明，RIP不具介導(dǎo)高水平及廣譜抗性的前景。RIP介導(dǎo)的抗性機(jī)制尚不明確，Wang等[35]認(rèn)為可能是RIP直接作用于病毒RNA，同時(shí)誘導(dǎo)宿主防御反應(yīng)而產(chǎn)生抗性。病毒復(fù)制抑制劑蛋白（IVR-pro）轉(zhuǎn)入煙草中可不同程度地抑制TMV、CMV、PVX復(fù)制，而產(chǎn)生抗性，但是這種抗性很不穩(wěn)定。Rudolph等[36]將融合有GUS基因的肽適配體轉(zhuǎn)入本氏煙中，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出了較為廣譜的抗性。Reyes等[37]認(rèn)為肽適配體與傳統(tǒng)抗性策略結(jié)合使用可以產(chǎn)生更強(qiáng)、更廣抗性。Bhagava等[38]將經(jīng)過修飾改造的抗菌肽及自然抗TMV的N基因一起轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)化植株葉片壞死斑少且病毒積累劑量低。由于已經(jīng)存在一個(gè)自然抗性基因，所以這種抗性策略無法推測不具自然抗性植株的整體抗性。

3.3植物抗體介導(dǎo)的抗性

Boonrod等[39]將靶向TBSV復(fù)制酶的scFv轉(zhuǎn)入本氏煙中，轉(zhuǎn)化株不僅表現(xiàn)出了TBSV抗性，而且也具有CNV和TCV等病毒的抗性。植物抗體抗性策略研究使用的抗體主要有：全長抗體、重鏈可變區(qū)域和scFv抗體。

早期的植物抗體介導(dǎo)的抗性水平并不高。在后續(xù)的研究中逐漸使用靶向復(fù)制相關(guān)蛋白和病毒復(fù)制酶等非結(jié)構(gòu)病毒蛋白的植物抗體，其靶向性和穩(wěn)定性得到了改善，介導(dǎo)的抗性水平有所提高。但總體上，植物抗體介導(dǎo)的抗性水平比以往使用的抗性策略都要低。

4　宿主來源的抗性策略

4.1顯性抗性基因

R基因以特異性的基因?qū)虻姆绞骄幋a識(shí)別特異性病原物效應(yīng)因子的蛋白，也稱無毒蛋白，是植物內(nèi)源的抗病毒基因。通常按域組織結(jié)構(gòu)分為核苷酸結(jié)合的富亮氨酸重復(fù)抗性蛋白和細(xì)胞外富亮氨酸重復(fù)抗性蛋白兩類，其中核苷酸結(jié)合的富亮氨酸重復(fù)抗性蛋白類是最豐富的。已知的顯性抗性基因有N基因、Tm22、Sw5、Rx、HRT、RRT、CMR1等。此外，非病毒R基因Prf也可介導(dǎo)出TMV抗性。

4.2隱性抗性基因

隱性抗性基因是植物編碼病毒侵入所必需蛋白的易感基因發(fā)生等位基因突變，導(dǎo)致易感基因不能幫助病原體入侵反而使宿主形成病毒抗性。目前，已被克隆的隱性抗性基因大部分都與編碼真核翻譯起始復(fù)合體相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，真核翻譯起始因子（elFs）是RNA病毒侵染的決定因子，尤其是eIF4E和eIF4G蛋白家族。Cavatorta等[40]分離出eIF4E cDNA并進(jìn)行抗性相關(guān)位點(diǎn)同源位點(diǎn)突變改造后導(dǎo)入馬鈴薯中，易感馬鈴薯植株產(chǎn)生PVY抗性。Wang等[41]將特異性靶向elF(iso)4E的短hpRNA轉(zhuǎn)化歐洲李植株，轉(zhuǎn)基因植株高抗PPV。

4.3防御反應(yīng)因子

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）是調(diào)控單個(gè)基因與基因簇表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子。它通過與靶標(biāo)反式作用元件上的啟動(dòng)子結(jié)合來完成調(diào)控過程。它在調(diào)節(jié)宿主對(duì)環(huán)境壓力的反應(yīng)的過程中起著重要作用。因而，人們多次嘗試通過在植物中過度表達(dá)TFs來獲得對(duì)病原微生物的抗性。

參與防御反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子主要可以分為乙烯反應(yīng)因子和非乙烯類反應(yīng)因子。過表達(dá)乙烯反應(yīng)因子元件相關(guān)基因可以使植物獲得抗性。Fischer等[42]將編碼N基因介導(dǎo)的超敏反應(yīng)過程中轉(zhuǎn)錄因子的NtERF5基因?qū)氲綗煵葜仓曛羞M(jìn)行組成型表達(dá)，轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)出抗性特征。非乙烯類反應(yīng)因子主要有：MYB、WRKY、NAM、bZIP家族、GTP結(jié)合蛋白、dsRNA依賴的蛋白激酶、萌發(fā)素類蛋白、S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶（SAHH）等。這類因子主要通過過表達(dá)編碼防御反應(yīng)相關(guān)蛋白的基因使植物對(duì)病毒產(chǎn)生一定抗性。Guevara等[43]在煙草中過表達(dá)黃燈籠辣椒萌發(fā)素類蛋白的基因（CchGLP），轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)抗性特征。

5　結(jié)　語

轉(zhuǎn)基因抗性策略研究經(jīng)過30年的積累，取得了不少豐碩的成果。然而，仍然面臨不少亟待解決的問題。一是許多方法并未詳細(xì)拓展，深入探究，特別是抗性機(jī)制，多數(shù)處于推測爭論狀態(tài)，未形成普遍認(rèn)同性；二是很多轉(zhuǎn)基因抗病性方法尚未進(jìn)行大田實(shí)驗(yàn)抗性效果評(píng)估或者田間試驗(yàn)抗性效果不理想；三是大多數(shù)抗性策略介導(dǎo)出的抗性并不穩(wěn)定，也不具廣譜性，實(shí)際運(yùn)用中具有較大的局限性；四是基因漂移、產(chǎn)品食用安全性等問題仍待進(jìn)一步考究。RNA干擾、RNA沉默等技術(shù)的廣泛應(yīng)用或?qū)⑼苿?dòng)amiRNA、hpRNAd等抗性策略的進(jìn)一步深化研究。此外，輿論壓力和政治阻力等外在客觀因素也是轉(zhuǎn)基因科研工作者需要克服和解決的問題。

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（責(zé)任編輯：肖亮）

Research?Advances?on?Transgenic?Resistance?Strategies?in?Plants

YE Ying-lin1,2

（1. Hunan Vegetable Research Institute, Changsha 410125, PCR; 2. Longping Branch of Graduate School, Hunan University, Changsha 410125, PCR）

Transgenic resistance to plant virus was an important technology for control of plant virus infection. The development of RNA interference techniques lead a new way to the research on transgenic resistance strategies in plants. The approaches used to confer resistance in plants were based on the expression of various viral proteins (capsid proteins， replicase proteins， movement proteins andother viral proteins)， RNAs (antisense RNAs， satellite RNAs， defective interfering RNAs， hairpin RNAs， and artificial microRNAs)， nonviral genes (nucleases， antiviral inhibitors， and plantibodies)， host-derived resistance genes (dominant resistance genes and recessive resistance genes) and various factors involved in host defense responses. This paper chiefly introduced the strategies used to confer resistance in plants and analyzed the problem of this area， which in order to provide the reference for the researchers.

transgenic resistance; satellite RNA; hairpin RNA; artificial microRNA

Q943

A

1006-060X（2016）10-0126-05

2016-07-26

葉英林（1989-），女，湖南東安縣人，研究實(shí)習(xí)員，主要從事蔬菜分子育種研究及蔬菜栽培工作。