牛中喜,蘇立偉　綜述　陳龍奇　審校

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Raf激酶抑制蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展

牛中喜1,蘇立偉1綜述陳龍奇2審校

Raf激酶抑制蛋白；磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白；食管鱗狀細(xì)胞癌

Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitory protein，RKIP)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP)的家族成員之一，具有膜的生物合成、精子形成、神經(jīng)發(fā)育等功能，并能抑制促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核因子kappa-B(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而維持細(xì)胞正常增殖、分化以及凋亡。RKIP基因的下調(diào)或缺失可能導(dǎo)致這些通路的過(guò)度活躍以致細(xì)胞發(fā)生過(guò)度增殖及抗凋亡等現(xiàn)象[1-3]。繼Fu等[4]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的RKIP表達(dá)水平顯著低于非轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者以來(lái)，陸續(xù)有大量研究證實(shí)在乳腺癌[ 5,6 ]、胃癌[7,8]、肝癌[9]、結(jié)直腸癌[10]、前列腺癌[11]、腎癌[12]、神經(jīng)膠質(zhì)瘤[13]、肺癌[14,15]、食管癌等[16]腫瘤患者中，RKIP基因表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)或缺失，表明RKIP可能對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移起到一定的抑制作用。顯然，RKIP已成為腫瘤學(xué)領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)。

有研究表明，RKIP表達(dá)的缺失可能是消化系統(tǒng)惡性腫瘤不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，而食管癌作為一種消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)有著較高的發(fā)病率和死亡率[17]。食管癌的組織類(lèi)型主要分為鱗癌和腺癌，在發(fā)展中國(guó)家超過(guò)80%的食管癌為鱗癌[18]。因食管癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，明確診斷時(shí)大多已發(fā)生局部浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其5年生存率往往較低。因此，早期診斷是降低食管癌的發(fā)病率和死亡率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。雖然食管鱗狀細(xì)胞癌的多基因改變和表觀遺傳學(xué)機(jī)制已被初步闡述，但其發(fā)生發(fā)展的確切分子學(xué)機(jī)制尚不清楚，RKIP或許在一定程度上參與了食管癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程。筆者將對(duì)RKIP在食管鱗狀細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展作綜述，以期為食管鱗狀細(xì)胞癌的早期生物學(xué)診斷以及預(yù)后判斷提供一定的理論依據(jù)。

1　RKIP的發(fā)現(xiàn)

1984年，Bernier等[1]第一次在牛腦中提取出一種高度保守的小分子蛋白，并將其命名為PEBP-1蛋白。繼之，Banfield等[19]從老鼠的精子中也分離出了這種蛋白。1999年，Yeung等[20]用酵母雙雜交篩選法純化出PEBP-1，并發(fā)現(xiàn)人PEBP能與Raf-1蛋白激酶結(jié)合，從而阻止絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MKK)磷酸化，進(jìn)而抑制Raf-1/MEK/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinases，ERK)信號(hào)通路，因此將其重新命名為RKIP。

2　RKIP的結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)特征

PEBP蛋白家族是一類(lèi)高度保守的小分子蛋白，與現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的其他蛋白沒(méi)有同源性。人RKIP基因定位于12號(hào)染色體12 q 24.23，長(zhǎng)約10 Kbp，RKIP mRNA由4個(gè)外顯子轉(zhuǎn)錄而來(lái)，長(zhǎng)度為1434 bp，約95%序列與牛RKIP mRNA相同，85.5%與鼠RKIP mRNA相同。RKIP基因翻譯出的RKIP蛋白大小約23 ku，由187個(gè)氨基酸組成，其中186個(gè)氨基酸與21 ku的牛RKIP重疊，187個(gè)氨基酸與23 ku的鼠RKIP重疊[21]。RKIP蛋白分子呈球形結(jié)構(gòu)，使得其與其他蛋白相互作用時(shí)具有較大的結(jié)合表面。蛋白晶體結(jié)構(gòu)分析顯示，RKIP由9個(gè)β折疊和4個(gè)α螺旋組成，其三維空間結(jié)構(gòu)中有一由1個(gè)大β折疊兩側(cè)分別連著1個(gè)小β折疊和2個(gè)α螺旋構(gòu)成的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)存在一個(gè)高度保守配體結(jié)合域，由PEBP家族高度保守的兩段氨基酸序列組成，對(duì)RKIP結(jié)合磷酸蛋白的功能起決定性的作用[22]。RKIP不同于其他PEBP蛋白的一個(gè)顯著特征是在其氨基酸序列中存在一個(gè)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的磷酸化位點(diǎn)Ser153，Ser153被PKC磷酸化后，RKIP與Raf-1的親和力降低而與G蛋白偶聯(lián)受體激酶2(G protein-coupled receptor kinase，GRK2)的親和性增高，從而增強(qiáng)G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptor，GPCR)的作用。RKIP主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，主要通過(guò)靜電作用與帶負(fù)電荷的膜結(jié)合。人RKIP在多種組織和細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)，如睪丸精原細(xì)胞、大腦膠質(zhì)細(xì)胞、心臟蒲肯野纖維細(xì)胞等[23]。

3　RKIP相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

3.1MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等細(xì)胞活動(dòng)[24]。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路又可分為c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路、P38和ERK三條通路，其中Raf/MEK/ERK通路是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最為活躍的一條。Yeung等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，RKIP與Raf-1結(jié)合后，可抑制Raf-1的活化和磷酸化，進(jìn)而抑制MEK-1的激活和磷酸化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Raf/MEK/ERK通路的抑制。在進(jìn)一步的研究中，Yeung等[25]發(fā)現(xiàn),MEK和Raf-1在RKIP上有重疊結(jié)合位點(diǎn)，而MEK上具有不同的RKIP和Raf-1結(jié)合位點(diǎn)，RKIP和MEK在Raf-1上也有不同的結(jié)合位點(diǎn)，即RKIP可以分別與MEK和Raf-1結(jié)合從而抑制下游ERK途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。另有研究發(fā)現(xiàn)，RKIP與富集在細(xì)胞膜的Raf-1結(jié)合后，阻止Raf-1與p21活化激酶(p21-activated kinase，PAK)結(jié)合，從而阻斷PKA和絲氨酸蛋白酶對(duì)Raf-1的磷酸化，進(jìn)而抑制MEK的活化，實(shí)現(xiàn)Raf/MEK/ERK通路信號(hào)的下調(diào)。

3.2NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路RKIP能與NF-κB激活途徑的4個(gè)激酶NF-κB誘導(dǎo)激酶(NF-κB inducing kinase，NIK)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β活化激酶(TGF-β activated kinase 1，TAK1)、IκB激酶α(IκB kinase α，IKKα)和IκB激酶β(IκB kinaseβ，IKKβ)相互作用，主要通過(guò)抑制并減弱腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)誘導(dǎo)的NF-κB抑制物激酶活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)NF-κB激活的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)RKIP基因敲除的細(xì)胞中NF-κB信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子IκB、A20和Cyld表達(dá)會(huì)相應(yīng)下調(diào)，表明RKIP通過(guò)增加負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子的表達(dá)來(lái)抑制NF-κB信號(hào)通路。此外，Sisto等[26]的研究發(fā)現(xiàn),利妥昔單抗可降低NF-κB的活性，并能通過(guò)上調(diào)RKIP的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的抑制。

3.3GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路GPCR被GRK-2磷酸化后，與G蛋白脫離而導(dǎo)致G蛋白信號(hào)失活。RKIP對(duì)GPCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路具有正向調(diào)節(jié)作用。一方面，RKIP是GRK-2的生理性抑制因子，通過(guò)結(jié)合GRK-2的N端結(jié)構(gòu)域，從而減弱GRK-2對(duì)GPCR的磷酸化；另一方面，RKIP Ser153位點(diǎn)被PKC磷酸化后，使其與Raf-1脫離而與GRK-2結(jié)合，從而增強(qiáng)GPCR。有研究顯示RKIP的二聚化在其從Raf-1結(jié)合轉(zhuǎn)換到RKIP結(jié)合的過(guò)程中起著重要作用，Ser153磷酸化的RKIP極易變成二聚體，且RKIP的二聚體形式與GRK-2親和力高而與Raf-1親和力低[27]。在Raf-1和GRK-2之間的這種作用揭示了一種新的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，RKIP作為中間調(diào)節(jié)因子對(duì)維持Raf-1的促生長(zhǎng)信號(hào)和GRK-2的抑生長(zhǎng)信號(hào)的平衡起著重要作用。

4　RKIP在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制

RKIP通過(guò)抑制MAPK以及NF-κB信號(hào)通路，從而可抑制細(xì)胞增殖和遷移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)RKIP下調(diào)或缺失時(shí)，MAPK和NF-κB信號(hào)通路激活，細(xì)胞增殖侵襲能力增加，游離的Raf-1蛋白激酶向線粒體內(nèi)異位遷移，抑制細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。RKIP抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制目前尚不清楚，可能與負(fù)向調(diào)節(jié)的信號(hào)通路有關(guān)。ERK可激活下游轉(zhuǎn)錄因子c-myc，使LIN28表達(dá)增加，LIN28結(jié)合let-7前體物質(zhì)而使成熟小RNA let-7生成減少，而let-7可通過(guò)減少轉(zhuǎn)錄因子BACH1的合成來(lái)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄，RKIP則能抑制MAPK信號(hào)通路進(jìn)而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[28]。文獻(xiàn)[29]發(fā)現(xiàn)，RKIP能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路從而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的表達(dá)，基因敲除RKIP的腫瘤細(xì)胞MMPs明顯升高，侵襲性增強(qiáng)，但同時(shí)敲除RKIP和MMPs，腫瘤細(xì)胞的侵襲性則回歸正常。還有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑可通過(guò)誘導(dǎo)RKIP下調(diào)E-鈣黏蛋白等上皮表型標(biāo)志物的表達(dá)，提示RKIP的缺失可以誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。同時(shí)，RKIP下調(diào)或缺失的具體機(jī)制目前尚不明確，可能與堿基突變、缺失、甲基化等有關(guān)。但RKIP在人類(lèi)腫瘤中的突變率很低，目前，尚無(wú)RKIP基因突變導(dǎo)致基因表達(dá)缺失的報(bào)道。因此，RKIP基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化，以表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的理論受到比較大的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子異常甲基化是導(dǎo)致胃癌RKIP轉(zhuǎn)錄沉默的主要原因[30]。

5　RKIP在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用

5.1RKIP在食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)為了研究RKIP的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移可能性、臨床病理特征，以及患者結(jié)局的關(guān)系，Kim等[31]對(duì)138例胸部食管癌患者的腫瘤組織應(yīng)用免疫組化法來(lái)探尋RKIP在原位癌、原發(fā)癌以及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，91例食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，RKIP表達(dá)缺失者達(dá)65例(71.4%)，表達(dá)缺失率顯著高于原發(fā)癌(50.0%，69/138)和原位癌(28.9%，13/45)。腫瘤病理T分期、淋巴浸潤(rùn)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及分期與RKIP表達(dá)成反比，且RKIP表達(dá)下調(diào)是發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立影響因素。同時(shí)，RKIP表達(dá)下調(diào)的患者術(shù)后生存時(shí)間顯著短于RKIP表達(dá)正常的患者。這項(xiàng)研究表明RKIP表達(dá)水平隨食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移呈下調(diào)趨勢(shì)，RKIP的表達(dá)或許可作為一種新的食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床生物學(xué)標(biāo)志物。同時(shí)，也表明RKIP在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織，表明RKIP表達(dá)的降低促進(jìn)了食管鱗狀細(xì)胞癌的淋巴轉(zhuǎn)移。

同時(shí)，為了探討RKIP的表達(dá)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌手術(shù)切除患者預(yù)后的意義，Gao等[32]進(jìn)行了一項(xiàng)更大規(guī)模的研究，他們對(duì)233例食管鱗狀細(xì)胞癌組織和49例癌旁正常組織運(yùn)用免疫組化的方法檢測(cè)RKIP的表達(dá)。研究結(jié)果顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中RKIP的表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，RKIP低表達(dá)的食管鱗狀細(xì)胞癌患者其無(wú)病生存率和總體生存率均更低。COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，RKIP低表達(dá)會(huì)增加食管鱗狀細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。多變量分析結(jié)果顯示，RKIP的表達(dá)水平是影響食管癌患者總體生存率的獨(dú)立影響因素。該研究表明，RKIP表達(dá)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后判斷有積極意義，RKIP或許可成為食管鱗狀細(xì)胞癌一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

5.2RKIP基因下調(diào)與甲基化為了探討食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中RKIP基因低表達(dá)和異常甲基化與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，Guo等[33]對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌TE-13細(xì)胞株進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，RKIP基因啟動(dòng)子甲基化與RKIP低表達(dá)密切相關(guān)，使用5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dC)去甲基處理后可誘導(dǎo)恢復(fù)RKIP的表達(dá)。在正常組織中也發(fā)現(xiàn)了RKIP基因的異常甲基化，這種啟動(dòng)子異常甲基化可能發(fā)生在食管鱗狀細(xì)胞癌的早期，尤其在不典型增生階段，且晚期更加明顯。他們認(rèn)為，這種RKIP啟動(dòng)子基因的甲基化表觀遺傳學(xué)的改變導(dǎo)致了RKIP轉(zhuǎn)錄的沉默，最終促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，而RKIP基因的再活化可能對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌有治療作用，且可作為食管鱗狀細(xì)胞癌患者的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)。同時(shí)，魏紅等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中RKIP啟動(dòng)子的甲基化發(fā)生率(75%)顯著高于癌旁正常組織(27%)，RKIP基因mRNA陽(yáng)性表達(dá)率(36%)顯著低于癌旁正常組織(77%)，且RKIP基因甲基化者mRNA陽(yáng)性表達(dá)率與非甲基化者mRNA陽(yáng)性表達(dá)率比較明顯相關(guān)，RKIP基因甲基化與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度相關(guān)。因此，他們認(rèn)為，食管鱗狀細(xì)胞癌RKIP基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致該基因mRNA表達(dá)缺失可能是食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制之一，RKIP基因的高甲基化率可作為食管鱗狀細(xì)胞癌惡性程度評(píng)估和預(yù)后判斷的指標(biāo)。

5.3RKIP與GPCR通路為了研究RKIP在食管癌細(xì)胞增殖中的作用，Zhao等[16]應(yīng)用免疫組化的方法對(duì)食管癌TE-1細(xì)胞株RKIP的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)食管癌組織中RKIP的表達(dá)顯著低于正常食管上皮組織和癌旁組織，且RKIP低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。RKIP通過(guò)下調(diào)mRNA中LIN28和MMP-14的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)食管癌TE-1細(xì)胞株的侵襲和轉(zhuǎn)移，RKIP不通過(guò)MAPK信號(hào)通路對(duì)食管癌TE-1細(xì)胞株起作用，而通過(guò)GPCR信號(hào)通路起作用。因此，他們認(rèn)為，RKIP通過(guò)下調(diào)GRK-2、LIN28和MMP-14來(lái)抑制食管癌細(xì)胞的侵襲。同時(shí)，魏紅等[35]的研究還發(fā)現(xiàn)，正常食管組織到食管鱗狀細(xì)胞癌組織中NF-κBp65表達(dá)率逐漸升高，而臨床期別越高、分化程度越低的食管鱗狀細(xì)胞癌組織NF-κBp65表達(dá)率越高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗狀細(xì)胞癌組織表達(dá)率較無(wú)轉(zhuǎn)移者高，且RKIP與NF-κBp65表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，表明RKIP表達(dá)下調(diào)或缺失與食管鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，RKIP表達(dá)下調(diào)或缺失可能通過(guò)上調(diào)NF-κB的表達(dá)促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移。

Birner等[36]的研究表明，在食管腺癌中RKIP下調(diào)約50%，食管鱗狀細(xì)胞癌中RKIP下調(diào)約66%，且RKIP在Barrett食管、低級(jí)別上皮瘤變、高級(jí)別上皮瘤變和侵襲性腺癌組織中的表達(dá)程度依次降低，表明RKIP的缺失亦參與了食管上皮內(nèi)瘤變的過(guò)程。同時(shí)，RKIP表達(dá)的下調(diào)可降低食管癌患者無(wú)病生存率和總體生存率，且是無(wú)病生存率和總體生存率的獨(dú)立影響因素。他們認(rèn)為，抑制RKIP的下調(diào)或許可以延緩食管癌的發(fā)生和發(fā)展，也可能對(duì)治療食管癌具有潛在意義。

自RKIP被發(fā)現(xiàn)二十多年來(lái)，其在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中越來(lái)越受到重視，尤其對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用引來(lái)了諸多研究者的關(guān)注。RKIP通過(guò)對(duì)MAPK、NF-κB以及GPCR等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于RKIP對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌作用的研究尚不多，且?guī)缀鮾H停留在免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)水平。現(xiàn)有的研究表明，RKIP在食管鱗狀細(xì)胞癌中的低表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示可以此作為早期診斷標(biāo)志，進(jìn)而成為食管鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移治療的新靶點(diǎn)。同時(shí)，利用RKIP促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，可通過(guò)提高組織RKIP的表達(dá)以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)輔助治療的敏感性。

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(2015-08-13收稿2016-01-15修回)

(責(zé)任編輯郭青)

牛中喜，博士，副主任醫(yī)師。

1.100039北京，武警總醫(yī)院胸外科；2.610041成都，四川大學(xué)華西醫(yī)院胸外科

蘇立偉，E-mail:slwwjzy@163.com

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