毛凱平，鄒璟，李解，姜夢(mèng)雅，高桃珍

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病(temporomandibular joint osteoarthrosis, TMJOA)是指顳下頜關(guān)節(jié)組織發(fā)生磨損與變形，并在關(guān)節(jié)表面形成新骨的非炎癥性骨關(guān)節(jié)病。由于顳下頜關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與功能復(fù)雜，加之人的一生中牙合型不斷發(fā)生改變，顳下頜關(guān)節(jié)經(jīng)歷了復(fù)雜的改建過(guò)程，以致其發(fā)病率高達(dá)30%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解、組織改建是TMJOA最重要的病理改變。文獻(xiàn)證實(shí)，基質(zhì)調(diào)節(jié)因子通過(guò)影響細(xì)胞外基質(zhì)降解及合成導(dǎo)致基質(zhì)成分紊亂及功能改變，在TMJOA發(fā)生與發(fā)展中起著主要作用[2-7]。氦氖激光是臨床治療TMJOA的常用手段之一，但其作用機(jī)制尚不完全清楚，本研究通過(guò)觀察氦氖激光對(duì)退變顳下頜關(guān)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)基質(zhì)調(diào)節(jié)因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)表達(dá)的影響，以期明確氦氖激光對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)退變的保護(hù)作用與機(jī)制，為臨床運(yùn)用氦氖激光治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用骨骼發(fā)育成熟的健康成年雄性新西蘭大白兔40只，月齡5～6個(gè)月，體質(zhì)量2～2.5kg，無(wú)牙頜畸形，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)42000500002225)。②主要試劑： 羊抗兔BMP-2單克隆抗體(武漢博士德生物公司，貨號(hào)：BA0585)、鼠抗羊二抗(KPL公司)。③主要材料與儀器：PVDF膜(Millipore 公司)、氦氖激光多功能治療儀(MDC-500)。

1.2 方法 ①分組與處理：在標(biāo)準(zhǔn)條件下(武漢市第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)適應(yīng)性飼養(yǎng)3周后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的程序經(jīng)過(guò)了武漢市第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。所有動(dòng)物進(jìn)行編號(hào)，查隨機(jī)數(shù)字表分為4組各10只。正常組，自然飼養(yǎng)，不作任何治療；模型組，模型，不作任何治療；假模型組，同模型組，但不切除關(guān)節(jié)盤，不作任何治療；治療組，于造模后第1d開始氦氖激光治療，連續(xù)治療10d。各組分別在造模后第1天和11天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取5只，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以過(guò)量注射麻醉藥方法處死，取各組髁突，直接凍存于-80℃冰箱待檢測(cè)。②造模：參照常嘉等[8]的造模方法，建立顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病動(dòng)物模型。于耳緣靜脈注射1mg/kg的2.5g/L的戊巴比妥鈉。無(wú)菌條件下自眼外眥外側(cè)5mm處至外耳道方向行2cm長(zhǎng)的皮膚切口，分離皮下組織，暴露關(guān)節(jié)囊。水平切開關(guān)節(jié)囊，切開關(guān)節(jié)盤的外側(cè)附著，將下頜升支推向外側(cè)以充分暴露髁突關(guān)節(jié)面與關(guān)節(jié)盤。將關(guān)節(jié)盤前外二分之一部分切除。無(wú)菌生理鹽水充分沖洗后將剩余關(guān)節(jié)盤復(fù)位，分層縫合關(guān)節(jié)囊、皮下組織和皮膚。假模型組僅作關(guān)節(jié)囊切開后即縫合組織。術(shù)后不限制動(dòng)物的下頜運(yùn)動(dòng)，飼養(yǎng)顆粒性常規(guī)兔飼料，單籠飼養(yǎng)。連續(xù)肌肉注射青霉素3天，每天4萬(wàn)單位。于術(shù)后1個(gè)月行顳下頜關(guān)節(jié)CT檢查，出現(xiàn)典型的TMJOA改變即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，未出現(xiàn)TMJOA改變的動(dòng)物予以剔除。③治療方法：采用氦氖激光多功能治療儀(MDC-500)，輸出氦氖激光波長(zhǎng)632.8nm，功率10mw，激光光針光斑直徑2mm。取患側(cè)頰車、上關(guān)、下關(guān)、聽宮、翳風(fēng)，光針緊貼皮膚并與之垂直，每穴照射5min，共治療10d。

1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) Western Blot方法進(jìn)行檢測(cè)BMP-2蛋白表達(dá)量：按蛋白分子量配制10%的PAGE膠電泳，根據(jù)預(yù)染marker顯示，充分分離目的蛋白，取出凝膠用蒸餾水沖洗，剪與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜和濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡數(shù)秒后和濾紙一同浸泡于電轉(zhuǎn)緩沖液中。然后用含5%脫脂奶粉的TBST(封閉液)浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2h。再加入一抗孵育，TBST充分洗滌PVDF膜5～6次，用封閉液稀釋相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗——1:40000稀釋，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，顯色曝光。BandScan凝膠圖像分析軟件分析膠片灰度值。

2 結(jié)果

2.1 模型兔顳下頜關(guān)節(jié)CT表現(xiàn) 模型兔于術(shù)后1個(gè)月行三維CT檢查，顯示關(guān)節(jié)軟骨逐漸消耗、喪失，出現(xiàn)缺損，關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，光澤度變差，髁突形態(tài)改建、軟骨層增厚明顯，患側(cè)髁突外觀肥大，見圖1A～C。

圖1A～C A和B分別為模型組健側(cè)(左側(cè))、患側(cè)(右側(cè))顳下頜關(guān)節(jié)三維CT表現(xiàn)，圖C為CT平掃，可見患側(cè)髁突形態(tài)明顯改變、軟骨層增厚明顯，髁突肥大。

2.2 氦氖激光治療對(duì)BMP-2表達(dá)的影響 Western blot檢測(cè)顯示，正常組和假模型組各時(shí)間點(diǎn)BMP-2蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性變化；造模成功后第1d時(shí)間點(diǎn)，模型組與氦氖激光組BMP-2蛋白表達(dá)均明顯減少，經(jīng)過(guò)氦氖激光治療10d后，BMP-2蛋白表達(dá)較第1d及模型組明顯上升(P<0.05)。見圖2，表1。

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)BMP-2蛋白表達(dá)

組別1d11d正常組 11.010±0.125假模型組 1.066±0.1910.982±0.096模型組 0.574±0.122a0.532±0.133a氦氖激光組0.506±0.074a0.736±0.081b

與正常組比較，aP<0.05; 與模型組及氦氖激光組第1d比較，bP<0.05

3 討論

盡管顳下頜骨關(guān)節(jié)病的機(jī)制尚未完全闡明，但髁突軟骨細(xì)胞對(duì)基質(zhì)合成與降解代謝調(diào)控的失衡被認(rèn)為是其主要病理環(huán)節(jié)[9]。文獻(xiàn)證實(shí)，髁突軟骨細(xì)胞是顳下頜骨關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)成分的惟一來(lái)源，顳下頜骨關(guān)節(jié)病的發(fā)生即為髁突軟骨細(xì)胞所控制的合成、降解代謝失衡所致，其主要特征為關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)成分的進(jìn)行性降解，同時(shí)伴隨著繼發(fā)性炎癥因子的釋放及其相關(guān)效應(yīng)[9]。

臨床研究表明，氦氖激光對(duì)顳下頜骨關(guān)節(jié)病具有良好的治療作用[10]，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。已有研究顯示，氦氖激光光針釋放出的激光光子能量被病態(tài)的生物分子吸收后，可改變病態(tài)生物分子內(nèi)能，這種改變相當(dāng)于一種刺激源，可直接或間接興奮神經(jīng)、肌肉和腺體，同時(shí)，可使鉀離子致解反應(yīng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，使五羥色胺物質(zhì)明顯降低，激活內(nèi)源性嗎啡樣鎮(zhèn)痛物質(zhì)，延長(zhǎng)感覺(jué)神經(jīng)潛伏時(shí)間，整合中樞神經(jīng)的痛覺(jué)信號(hào)，從而達(dá)到鎮(zhèn)痛效果，并通過(guò)促進(jìn)新生血管的形成改善顳下頜關(guān)節(jié)患者局部血液循環(huán)，通過(guò)抑制固有炎癥介質(zhì)PGE的合成及直接抗炎作用，降低炎癥反應(yīng)[11]。

BMP-2作為細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)因子，同時(shí)也是合成代謝酶，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，并能誘導(dǎo)未分化的間質(zhì)細(xì)胞不可逆的分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。對(duì)骨組織的發(fā)生、損傷和修復(fù)都具有重要作用。其對(duì)骨原細(xì)胞的分化起著決定性作用，是促進(jìn)成骨的主要因子，可在骨損傷局部和異位促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高其堿性磷酸酶活性，是唯一能夠單獨(dú)在異位誘導(dǎo)成骨形成的分子。這使其在骨關(guān)節(jié)病的臨床治療中具有極大的潛在應(yīng)用價(jià)值[12-13]。

綜上所述，退變的顳下頜關(guān)節(jié)組織中，BMP-2蛋白表達(dá)較正常顳下頜關(guān)節(jié)明顯降低，證實(shí)了BMP-2蛋白表達(dá)下降所致ECM合成減少是顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的機(jī)制之一。正常組與假模型組之間二者的表達(dá)無(wú)顯著性差異，說(shuō)明未切除關(guān)節(jié)盤的顳下頜關(guān)節(jié)模型無(wú)明顯的退變。選用氦氖激光照射患側(cè)頰車、上關(guān)、下關(guān)、聽宮、翳風(fēng)穴10d后，顳下頜關(guān)節(jié)組織中BMP-2蛋白表達(dá)明顯增加，表明氦氖激光治療可上調(diào)退變顳下頜關(guān)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)BMP-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，從而防治顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病。本研究為臨床運(yùn)用氦氖激光治療TMJOA提供了一定的理論依據(jù)，但氦氖激光影響相關(guān)蛋白表達(dá)的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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