王婷++劉麗麗++高文萱

摘 要：以河北省徐水縣長(zhǎng)期定位施肥試驗(yàn)田為研究對(duì)象，利用末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）分析和克隆文庫(kù)構(gòu)建，研究了5種施肥處理（清水灌溉CK、無(wú)機(jī)肥灌溉CF、不同牛場(chǎng)肥水灌溉T4、T5和T11）下土壤中nosZ型反硝化細(xì)菌群落多樣性及其群落結(jié)構(gòu)演變。結(jié)果表明，不同施肥處理下nosZ型反硝化細(xì)菌群落多樣性無(wú)顯著性差異，施肥條件對(duì)nosZ型反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響，說(shuō)明本試驗(yàn)土壤中nosZ型反硝化細(xì)菌對(duì)施肥不敏感，群落穩(wěn)定。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，nosZ型反硝化細(xì)菌主要與假單胞菌屬（Pseudomonas）具有較近的親緣關(guān)系。

關(guān)鍵詞： nosZ；反硝化細(xì)菌；牛場(chǎng)肥水灌溉；T-RFLP；群落多樣性

中圖分類號(hào)：S155.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.03.004

反硝化作用是微生物在嫌氣條件下進(jìn)行的硝酸鹽還原過(guò)程，在多種微生物參與下，將硝酸鹽亞硝酸鹽逐步還原，最終將氮以一氧化氮（NO）、氧化亞氮（N2O）或分子態(tài)氮（N2）的形式釋放出來(lái)的過(guò)程[1-3]。反硝化作用微生物主要分布于水體、沉積物和土壤中，由于土壤的環(huán)境更適合微生物的生存[4]，所以反硝化作用主要發(fā)生于土壤中。研究表明土壤因反硝化作用而喪失了20%～30%的氮肥[5]，全球70%的N2O排放來(lái)自土壤[6]，Stehfest和 Bouwman[7]指出，施肥農(nóng)田土壤每年釋放N2O-N 和 NO-N 的量分別達(dá)到 3.3 和 1.4 Tg。農(nóng)田土壤是重要的溫室氣體[二氧化碳（CO2）、甲烷（CH4）、氧化亞氮（N2O）]的源匯[8]。因此，深入研究農(nóng)田土壤反硝化的作用及其影響因素，可以為我們減少 N2O 的排放找到新途徑，對(duì)于保護(hù)地球生態(tài)非常重要。

隨著集約化飼養(yǎng)程度的不斷提高，養(yǎng)殖廢物發(fā)酵產(chǎn)生的沼液作為一種優(yōu)質(zhì)的有機(jī)液體肥料進(jìn)行水肥還田在很多國(guó)家和地區(qū)得到應(yīng)用和推廣[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，相比不施肥和常規(guī)施肥，沼液能夠提高作物質(zhì)量，影響土壤微生物[11-13]，而液態(tài)牛場(chǎng)肥水灌溉對(duì)反硝化微生物的影響幾乎沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

由于nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶催化N2O向N2轉(zhuǎn)化，將溫室氣體N2O 轉(zhuǎn)化為無(wú)害的 N2，是反硝化細(xì)菌的重要酶[2]。目前已有不少研究者通過(guò)研究 nosZ 基因的多樣性來(lái)探究反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，比如Ruiz-Rueda 等[14]通過(guò)對(duì)nosZ的 PCR-DGGE 研究，發(fā)現(xiàn)植被存在可以促進(jìn)微生物的硝化和反硝化作用。Enwall 等[15]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施用有機(jī)肥改變了 nosZ型反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，提高土壤的反硝化潛勢(shì)。

筆者以河北省徐水縣長(zhǎng)期定位試驗(yàn)田為研究對(duì)象，利用T-RFLP和構(gòu)建克隆文庫(kù)方法，探明了按當(dāng)?shù)剞r(nóng)民習(xí)慣施肥以及不同灌溉次數(shù)、不同濃度的牛場(chǎng)肥水灌溉的施肥方式下，冬小麥/夏玉米大田0～5 cm土層中nosZ型反硝化細(xì)菌群落的多樣性和組成變化，為深入探討牛場(chǎng)肥水灌溉施肥對(duì)大田反硝化作用影響提供相應(yīng)依據(jù)，并為大田合理施肥、提高牛場(chǎng)肥水灌溉效果以及減少 N2O 的排放提供科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與土壤樣品采集

本試驗(yàn)以徐水縣梁家營(yíng)長(zhǎng)期定位施肥試驗(yàn)田為研究對(duì)象。徐水縣地處太行山東麓，河北省中部，北緯38°09′～39°09′，東經(jīng)115°19′～115°46′，屬大陸性季風(fēng)氣侯，年平均氣溫11.9 ℃，年均降水量546.9 mm，年日照時(shí)數(shù)平均2 744.9 h。

試驗(yàn)田每個(gè)小區(qū)長(zhǎng)9 m，寬6 m，面積54 m2，四周1 m土體內(nèi)用塑料布隔開(kāi)，種植方式為冬小麥/夏玉米輪作。共設(shè)5個(gè)處理，施肥方式及灌溉肥水沼液原液成分見(jiàn)表1和表2。

土壤樣品在小麥?zhǔn)崭詈螅?月中旬）進(jìn)行采集，采用5點(diǎn)法采集土樣，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取5點(diǎn)采集0～5 cm的表層土，去除根系、雜草、土壤動(dòng)物和石塊等雜質(zhì)后混勻，于20 ℃冰箱保存。

1.2 土壤微生物總DNA提取

土壤微生物總DNA的提取方法和步驟按照土壤基因組DNA提取試劑盒FastDNAR SPIN Kit For Soil （MP Biomedicals，LLC）的說(shuō)明進(jìn)行。將提取的DNA用Nano Drop核酸蛋白儀（ND-1000）測(cè)定濃度及質(zhì)量，于-20 ℃冰箱中保存。

1.3 末端限制性酶切片段多態(tài)性（T-RFLP）

按照表3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0（TaKaRa）試劑盒進(jìn)行純化回收，并用Nano Drop核酸蛋白儀（ND-1000）檢測(cè)純化產(chǎn)物濃度及質(zhì)量。產(chǎn)物回收后，擴(kuò)增產(chǎn)物用內(nèi)切酶HhaⅠ（TaKaRa）進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系和條件按各內(nèi)切酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將酶切產(chǎn)物送去生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

通過(guò)計(jì)算Shannon-Wienner、Simpson和Pielou多樣性指數(shù)模型獲得nosZ型反硝化細(xì)菌群落多樣性指數(shù)。

1.4 克隆及測(cè)序分析

將1.3目的條帶分別進(jìn)行切膠回收，用Mini BEST DNA Fragment Purification Kit VER 4.0（TaKaRa）試劑盒進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物分別與pMD19R-T Vector載體進(jìn)行連接反應(yīng)。

將10 μL連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到100 μL大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白斑克隆子，用通用引物M13F（5′-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3′，TaKaRa），M13R（5′-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3′，TaKaRa）進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，選取大約100個(gè)克隆子擴(kuò)大培養(yǎng)后送去生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。