周震宇，顏智勇

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南　長沙　410128；2 湘潭市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，湖南　湘潭　411104)

?

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域研究探討

周震宇1,2，顏智勇1

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖南長沙410128；2 湘潭市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，湖南湘潭411104)

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了核酸的定量，具有靈敏性高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。本文從實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)與缺陷，以及熒光定量PCR技術(shù)在國內(nèi)外環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用情況對熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行探討，以期使熒光定量PCR技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域有著更合適的應(yīng)用。

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)；優(yōu)點(diǎn)與缺陷；應(yīng)用情況；研究探討

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real time fluorescent quantitative PCR，Real-time PCR)技術(shù)是由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)公司在1996年推出的。該技術(shù)的推出實(shí)現(xiàn)了PCR以往只能定性分析而無法定量分析的瓶頸，與常規(guī)PCR相比，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)具有自動化程度更高、特異性更強(qiáng)、能夠快速有效解決PCR易污染問題等特點(diǎn)，使得其已在生物技術(shù)、醫(yī)藥技術(shù)、環(huán)境技術(shù)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

1　實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理

在實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)中，它是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)而形成的。熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理是，當(dāng)一個熒光分子(即分子供體)的熒光光譜的另一分子(即分子受體)和供體熒光團(tuán)的激發(fā)光譜重疊的熒光強(qiáng)度相同的熒光分子是與熒光強(qiáng)度的衰變分子會增加[1]。Ct值表示周期為每個管的熒光信號達(dá)到限制值的數(shù)目所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。實(shí)時熒光定量PCR中的Ct值是一個非常重要的因素，C代表循環(huán)(Cycle)，t代表閾值(Threshold)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小[1]。通過使用已知的初始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以，依據(jù)熒光探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量存在對應(yīng)關(guān)系，因此只需對熒光信號進(jìn)行“實(shí)時”檢測并獲得未知樣品的Ct值，獲得的熒光信號的值可以從項(xiàng)目的拷貝樣品數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算。

相比于常規(guī)PCR，實(shí)時熒光定量PCR用于改變在熒光信號的實(shí)時監(jiān)測PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的過程中循環(huán)，模板的初始量可以定量分析。簡言之，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的基本原理增加樣品核酸由相同的系統(tǒng)和反應(yīng)條件的指數(shù)擴(kuò)增，正比于產(chǎn)品的對數(shù)擴(kuò)增樣品的DNA含量，因?yàn)樵撓到y(tǒng)的用于著色或傳播的響應(yīng)結(jié)合的熒光標(biāo)記(熒光探針)的熒光的光產(chǎn)率正比于所用的核酸樣品的量進(jìn)行檢測的擴(kuò)增產(chǎn)物的量就可以通過熒光的量來確定[1]。

2　實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)勢與缺陷

2.1實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)勢

與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有了更多的改進(jìn)之處，具體如下[2]：

(1)實(shí)時熒光定量PCR實(shí)現(xiàn)了核酸的定量化研究，極大的擴(kuò)展了PCR技術(shù)在各個領(lǐng)域的應(yīng)用；

(2)實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的核酸對于檢測目標(biāo)核酸具有很高的靈敏度：科爾布(Kolb)等[3]使用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)來檢測環(huán)境中的甲烷氧化細(xì)菌(Methane oxidizing bacteria)的數(shù)量，檢測極限能夠?qū)崿F(xiàn)10 cells/樣品[4]；

(3)實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)可以在一個大范圍內(nèi)的檢測目標(biāo)核酸數(shù)量，簡便快捷：對靶DNA的實(shí)時熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通?？梢猿^7個數(shù)量級以上；

(4)實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)安全性高：在樣品的定量檢測在PCR反應(yīng)完成后，沒有進(jìn)一步的后續(xù)處理，減少了工作量，以除去使用的溴化乙錠(ethidium bromide，EB)等誘變風(fēng)險的過程。

2.2實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的缺陷

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)是一種高效，靈敏，安全的分子生物學(xué)手段，已經(jīng)成為主流定量核酸的技術(shù)之一，但此技術(shù)還不是很成熟，在使用過程中還存在一些缺陷，具體如下[1-3]：

(1)核酸熒光標(biāo)記是無法客觀地區(qū)分目標(biāo)核酸和非目標(biāo)核酸的，這會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有一定的影響；

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程是非常復(fù)雜的，目前還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方法，這將在一定程度上使得研究人員對各種調(diào)查結(jié)果缺乏可比性；

(3)許多一定數(shù)量的核酸在體內(nèi)的拷貝數(shù)不明確，目前的大多數(shù)研究是基于平均份數(shù)進(jìn)行評估，其精度是可疑的；

(4)設(shè)計熒光探針和分子信標(biāo)是十分復(fù)雜的技術(shù)，目前在我國還沒有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)；

(5)實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)所需的基本實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)費(fèi)用都相比普通PCR有著較高的要求[3]。

2.3實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的應(yīng)用

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)牧、生物相關(guān)分子生物學(xué)定量研究的各個領(lǐng)域。大量的資料顯示，熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境領(lǐng)域。Tay[4]利用特異性16S rDNA引物擴(kuò)增自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacterautotrophicus)和分枝桿菌(Mycobacterium)兩種甲苯降解菌來檢測環(huán)境微生物在河流隨季節(jié)的變化情況。Grüntzig V[5]通過對反硝化亞硝酸鹽還原酶基因(nirS)的定量來研究施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)種類的豐度，說明了該種微生物不是海底的主要反硝化微生物。Vaitomaa J[6]利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對湖泊中微囊菌和項(xiàng)圈藻微囊藻素合成酶E拷貝數(shù)進(jìn)行定量，表明湖泊中主要的微囊藻素是微囊菌產(chǎn)生的。Cummings[7]利用熒光定量PCR技術(shù)對沿湖泊重金屬污染濃度梯度中的還原鐵離子泥土桿菌(Geobacteraceae)家族的豐度進(jìn)行了定量，發(fā)現(xiàn)分布相對均勻，泥土桿菌家族的分布基本與重金屬離子濃度的影響無關(guān)。Hall S J[8]通過采用熒光定量PCR技術(shù)對污水處理廠的活性污泥中的Nitrospiraspp進(jìn)行了監(jiān)測和定量分析。Harms G[9]通過熒光定量PCR對城市污水處理廠MLSS中的硝化螺菌(Nitrospira)和氨氧化細(xì)菌(Ammoniaoxidizingbacteria，AOB)的總量進(jìn)行了定量監(jiān)測。

在國內(nèi)熒光定量PCR技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用也是越來越廣泛。李光偉等[10]通過實(shí)時熒光定量PCR對五氯苯酚(Pentachlorophenol，PCP)好氧顆粒污泥中氨氧化細(xì)菌的定量分析進(jìn)行監(jiān)測，研究表明五氯苯酚對氨氧化細(xì)菌的數(shù)量影響不大，并且氨氧化細(xì)菌的數(shù)量與氨氮的去除率無直接關(guān)系。李磊等[11]通過實(shí)時熒光定量PCR對A2/O短程硝化反硝化系統(tǒng)內(nèi)的氨氧化菌進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明隨著亞硝酸鹽積累率的上升，系統(tǒng)內(nèi)氨氧化細(xì)菌的數(shù)量也在大幅度上升并且亞硝酸鹽積累率的下降相對于AOB菌群數(shù)量的下降有一定的滯后性。謝潤欣等[12]對城市污水中病原性大腸埃希氏菌毒力基因eaeA和rfbE進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，表明污水二級處理對這兩種毒力基因的去除效果明顯。李曉巖等[13]利用熒光定量PCR檢測腺病毒氣在大氣中的相對基因拷貝數(shù)，表明重組腺病毒氣溶膠主要分布在采樣器的第五級，腺病毒氣溶膠與粒子相比較大。何恩奇等[14]利用熒光定量PCR方法對產(chǎn)毒微囊藻mcyA基因進(jìn)行了定量的分析，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)毒微囊藻的快速定量監(jiān)測分析。

3　結(jié)　語

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)自產(chǎn)生至今已在環(huán)境領(lǐng)域有了廣泛應(yīng)用，具有靈敏度高、檢測范圍寬、操作安全等優(yōu)勢，也有不能統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)曲線、分子信標(biāo)設(shè)計十分復(fù)雜等缺陷[15]，但是隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和完善，熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)勢會更加明顯，其缺陷也必將會得到解決，熒光定量PCR技術(shù)也會有更大的完善，更廣泛的應(yīng)用。

[1]陳旭,齊鳳坤,康立功,等.實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2010,41(8):148-155.

[2]趙大勇, 燕文明, 馮景偉.實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對氨氧化細(xì)菌的研究[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2010,33(12):8-13.

[3]Kolb S, Knief C, Stubner S, et al. Quantitative detection of methanotrophs in soil by novel pmoA-targeted real-time PCR assays[J].Applied and Environmental Microbiology,2003,69: 2423-2429.

[4]Tay S T L. Characterization and population dynamics of Toluene-degrading bacteria in a contaminated freshwater stream[D]. Massachusetts Institute of Technology, 1998.

[5]Grüntzig V, Nold S C, Zhou J, et al. Pseudomonas stutzeri nitrite reductase gene abundance in environmental samples measured by real-time PCR[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(2): 760-768.

[6]Vaitomaa J, Rantala A, Halinen K, et al. Quantitative real-time PCR for determination of microcystin synthetase E copy numbers for Microcystis and Anabaena in lakes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(12): 7289-7297.

[7]Cummings D E, Snoeyenbos-West O L, Newby D T, et al. Diversity of Geobacteraceae species inhabiting metal-polluted freshwater lake sediments ascertained by 16S rDNA analyses[J]. Microbial Ecology, 2003, 46(2): 257-269.

[8]Hall S J, Hugenholtz P, Siyambalapitiya N, et al. The development and use of real-time PCR for the quantification of nitrifiers in activated sludge[J]. Microorganisms in Activated Sludge and Biofilm Processes III, 2002, 46(1): 267-272.

[9]Harms G, Layton A C, Dionisi H M, et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant[J]. Environmental Science & Technology, 2003, 37(2): 343-351.

[10]李光偉,劉和,張峰,等.熒光定量PCR監(jiān)測五氯酚對好氧顆粒污泥和活性污泥中氨氧化細(xì)菌數(shù)量的影響[J].微生物學(xué)報,2007,47(1):136-140.

[11]李磊,張立東,劉晶茹,等.實(shí)時熒光定量PCR 對A2/O短程硝化系統(tǒng)內(nèi)氨氧化菌的定量分析[J].環(huán)境工程學(xué)報,2012,6(10):3597-3602.

[12]謝潤欣,張崇淼,王曉昌,等.城市污水中病原性大腸埃希氏菌毒力基因 eaeA和rfbE的實(shí)時熒光定量PCR檢測[J].環(huán)境科學(xué)研究, 2012, 25(8): 922-926.

[13]李曉巖,劉啟才,彭燕,等.腺病毒氣溶膠的實(shí)時熒光定量PCR檢測和綠色熒光蛋白活細(xì)胞檢測[ J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2007,27(5):785-789.

[14]何恩奇,鈕偉民,吳慶剛,等.產(chǎn)毒微囊藻mcyA基因熒光定量PCR方法的建立[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2011,34(12): 66-70.

[15]陳峻峰.抗生素對養(yǎng)豬廢水厭氧生物處理系統(tǒng)中微生物多樣性的影響[D].長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

Study on Real Time Fluorescent Quantitative PCR Technology on Environmental Area

ZHOUZhen-yu1,2，YANZhi-yong1

(1 College of Resource and Environment, Hunan Agricultural University, Hunan Changsha 410128;2 Xiangtan Municipal Research Institute of Environmental Protection, Hunan Xiangtan 411104, China)

Real-time fluorescent quantitative PCR developed in the base of PCR technique as one kind of quantitative techniques about nucleic acid with high sensitivity and strong specificity. The principle of real-time fluorescence quantitative PCR technology, advantages and disadvantages of real-time fluorescence quantitative PCR technology, application and fluorescence quantitative PCR technology at home and abroad on the fluorescent quantitative PCR technology were studied in order to make the fluorescent quantitative PCR technology be applied more appropriate.

real-time fluorescent quantitative PCR; advantages and disadvantages; application; study research

周震宇(1982-)，男，工程師，從事環(huán)境影響評價、環(huán)境工程治理、環(huán)境監(jiān)理工作。

顏智勇。

O657

A

1001-9677(2016)012-0153-02