王玉婷，張　強，李晨甦，李化生，田菁菁，楊建成*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學，遼寧沈陽 100866;2.沈陽市畜牧獸醫(yī)局，遼寧沈陽 110000；3.沈陽204醫(yī)院；遼寧沈陽 1100043)

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鈣蛋白酶對NO介導的糖尿病性血管內(nèi)皮功能障礙的影響研究進展

王玉婷1，張強2，李晨甦1，李化生1，田菁菁3，楊建成1*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學，遼寧沈陽 100866;2.沈陽市畜牧獸醫(yī)局，遼寧沈陽 110000；3.沈陽204醫(yī)院；遼寧沈陽 1100043)

摘要：糖尿病是最常見的代謝病之一，患有糖尿病的個體心腦血管疾病的發(fā)病率顯著增加。由糖尿病引起的血管內(nèi)皮功能障礙(ED)的潛在機制尚不明確，激活鈣蛋白酶，特別是μ-鈣蛋白酶，可增強NO介導的糖尿病ED的炎性反應，同時促進大血管和微血管中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的降解。μ-鈣蛋白酶/PKCβ2活化誘導的eNOS-pThr497/495和eNOS使血液中同型半胱氨酸含量升高，從而引起高血糖ED。論文主要綜述了鈣蛋白酶對NO介導的糖尿病性ED的作用，鈣蛋白酶可作為NO介導的糖尿病性ED的一個新的治療靶點。

關鍵詞：鈣蛋白酶；血管內(nèi)皮功能障礙；一氧化氮；糖尿病

糖尿病(diabetes)是常見的代謝病之一，患有糖尿病的個體心腦血管疾病發(fā)病率顯著增加。研究表明，內(nèi)皮功能障礙(endothelialdysfunction,ED)是糖尿病血管并發(fā)癥的關鍵環(huán)節(jié)；同時也加速了糖尿病及其并發(fā)癥的進程[1]。而內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)在ED發(fā)病機制中起關鍵作用，當機體發(fā)生ED時，體內(nèi)NO合成減少，內(nèi)皮素相對增多，從而引起血管收縮痙攣、平滑肌細胞增生和血管重塑等病理過程[2]。 鈣蛋白酶(calpain)主要存在于細胞質(zhì)中，是一種依賴Ca2+的中性半胱氨酸內(nèi)肽酶。研究表明在患糖尿病的個體中鈣蛋白酶的活性顯著升高[3]。而抑制鈣蛋白酶的活性可以減緩糖尿病介導的血管損傷、炎癥和ED[4]。本文綜述了鈣蛋白酶對NO介導的糖尿病性ED的作用，鈣蛋白酶作為NO介導的糖尿病性ED的一個新的治療靶的相關研究。

1鈣蛋白酶家族

1.1鈣蛋白酶家族概述

鈣蛋白酶是1964年由Guroff首次發(fā)現(xiàn)，1972年Bush等首先在骨骼肌中確認，1976年Dayton等對其進行純化。目前已發(fā)現(xiàn)15種亞型的鈣蛋白酶，其中研究較多的是μ-鈣蛋白酶m-鈣蛋白酶，它們分子量相近，都由兩個亞基組成，小亞基相同，而大亞基是2個相關基因的產(chǎn)物，2種大亞基之間存在一定的免疫交叉反應。

1.2鈣蛋白酶的激活

研究表明低濃度的Ca2+可以激活鈣蛋白酶。但兩者表現(xiàn)在最高活性時所需的Ca2+濃度不同，μ-鈣蛋白酶所需的Ca2+濃度為1 nmoL/L～12 nmoL/L，而m-鈣蛋白酶為250 nmoL/L～750 nmoL/L。例如，在線粒體轉運過程中，通過增加線粒體的氧化應激，間接的加強鈣蛋白酶對Ca2+的敏感性，從而激活鈣蛋白酶[5]；低氧可激活肺動脈內(nèi)皮細胞中的鈣蛋白酶[6]；此外，鈣蛋白酶膜定位的調(diào)節(jié)和磷脂酰肌醇的結合[7]與糖尿病誘導的Na+/H+交換也能激活鈣蛋白酶[8]。

1.3鈣蛋白酶的基本功能

鈣蛋白酶系統(tǒng)廣泛作用于動物體內(nèi)的各個組織，主要由鈣蛋白酶、鈣蛋白酶抑制蛋白和骨骼肌特異性鈣蛋白酶組成。它們參與動物肌肉生長，神經(jīng)發(fā)育，細胞信號轉導等生理活動。鈣蛋白酶可參與整合素介導的細胞遷移，細胞骨架重構，細胞分化和細胞凋亡等活動[9]。研究表明鈣蛋白酶的活化與急慢性糖尿病誘導的ED、神經(jīng)血管功能障礙和心肌細胞凋亡相關[1]。

2鈣蛋白酶對糖尿病性ED的作用

抑制鈣蛋白酶活性可影響糖尿病性ED，有研究表明抑制炎性細胞(白細胞)/細胞因子(細胞間黏附分子-1和血管細胞黏附分子-1)與內(nèi)皮細胞的相互作用[10]。另外，鈣蛋白酶可調(diào)節(jié)血管機械敏感重構。研究發(fā)現(xiàn)，機械應力可使鈣蛋白酶活性增加[11]。

2.1鈣蛋白酶與糖尿病

鈣蛋白酶-10、鈣蛋白酶-3和μ-鈣蛋白酶在糖尿病的發(fā)病機制中均發(fā)揮重要作用，如胰島素抵抗，胰島素分泌，肝糖合成，葡萄糖轉運和ED的發(fā)生。鈣蛋白酶-10是在糖尿病中確定的第一蛋白酶。鈣蛋白酶10的多態(tài)性與糖尿病易感性，葡萄糖穩(wěn)態(tài)，胰島素分泌和胰島素活化相關[12]。肥胖性和胰島素性糖尿病與骨骼肌中鈣蛋白酶-3表達量降低有關[13]。在糖尿病中μ-鈣蛋白酶(鈣蛋白酶-1)被激活可導致葡萄糖轉運障礙和ED的發(fā)生[14]。鈣蛋白酶抑制劑可減輕高糖誘導的微血管和血管炎癥[15]。不同蛋白酶在糖尿病的發(fā)病機制中起不同的作用，可見鈣蛋白酶抑制劑的選擇對糖尿病心血管并發(fā)癥的治療起著至關重要的作用。

2.2鈣蛋白酶與內(nèi)皮細胞

在內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞中，μ-鈣蛋白酶和m-鈣蛋白酶均有表達。激活鈣蛋白酶在血管生成、ED、傷口愈合的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[16]。Miyazaki T等[17]研究表明μ-鈣蛋白酶對內(nèi)皮細胞的功能有調(diào)節(jié)作用，并可保持血管生理功能的完整性。還有研究表明很多因素可增強內(nèi)皮細胞中鈣蛋白酶的活性。例如，血管內(nèi)皮生長因子可促使人類微血管和牛主動脈內(nèi)皮細胞中鈣蛋白酶活性增強[18]；血管緊張素Ⅱ影響小鼠毛細血管小靜脈內(nèi)皮細胞中鈣蛋白酶的活性[19]；氧化低密度脂蛋白可增強內(nèi)皮細胞中鈣蛋白酶的活性[1]；高血糖可增強小鼠微血管和大血管內(nèi)皮細胞中鈣蛋白酶的活性[10]；此外抗氧化劑可降低小鼠肺微血管內(nèi)皮細胞中μ-鈣蛋白酶的活性，但m -鈣蛋白酶活性不受影響[20]。

2.3鈣蛋白酶與同型半胱氨酸血癥

同型半胱氨酸血癥(HHcy)是一種反應性血管損傷含硫基的氨基酸，是氨基酸代謝的中間產(chǎn)物，它可以經(jīng)過甲基化作用轉變成蛋氨酸。近年來臨床研究認為高同型半胱氨酸血癥是心腦血管及外周血管的獨立危險因子。血漿中同型半胱氨酸濃度升高是ED發(fā)展過程中一個獨立的因素。研究表明，糖尿病性心血管疾病的死亡率和發(fā)病率與糖尿病患者半胱氨酸血癥的患病率和同型半胱氨酸的血漿濃度成正相關[21]。據(jù)報道半胱氨酸血癥可增強微血管和大血管內(nèi)皮細胞中μ-鈣蛋白酶的活性。研究發(fā)現(xiàn)，D-半胱氨酸培養(yǎng)基分別培養(yǎng)人和小鼠主動脈內(nèi)皮細胞48 h后，D-葡萄糖含量增加，從而激活鈣蛋白酶[10]。此外，半胱氨酸血癥可誘導μ-鈣蛋白酶從胞漿轉移到線粒體內(nèi)，增加了體外培養(yǎng)的大鼠心臟微血管內(nèi)皮細胞中線粒體內(nèi)氧化應激的能力[22]。也有研究表明，半胱氨酸血癥/高血糖可誘導大血管內(nèi)皮細胞鈣蛋白酶的激活[10]。此外，μ-鈣蛋白酶siRNA可顯著抑制半胱氨酸血癥/高血糖引起的鈣蛋白酶活性。然而半胱氨酸血癥和糖尿病之間的相互作用以及半胱氨酸血癥/糖尿病對心血管疾病的發(fā)病機制尚不明確。

3鈣蛋白酶與ED相互作用機制

ED發(fā)生時，內(nèi)皮依賴性血管功能下降，血管通透性增加，內(nèi)皮結構性損害，內(nèi)皮細胞脫落等。在血管受到生理刺激時，內(nèi)皮通過釋放血管活性物質(zhì)保持血管的止血作用，如一氧化氮(NO)、前列環(huán)素(PGI2)和內(nèi)皮衍生極化因子(endothelium-derived hyperpolarizing factor，EDHF)[23]。研究表明，鈣蛋白酶可調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)，進而對ED產(chǎn)生影響。因此，鈣蛋白酶對血管舒張作用和機制可能為預防和治療糖尿病性ED提供依據(jù)。

3.1鈣蛋白酶對NO的作用

內(nèi)皮型NO是由一氧化氮合酶(eNOS)水解相關蛋白產(chǎn)生，如熱休克蛋白、小窩蛋白[24]、eNOS本身、Akt以及Akt中斷蛋白、hsp90和eNOS結合物、P13K/AMPK的調(diào)控信號[25]。激活鈣蛋白酶可使小窩蛋白-3降解，從而導致eNOS解偶聯(lián)[26]。 蛋白激酶C(PKC)可激活細胞質(zhì)中的酶，參與生化反應的調(diào)控，又可當做鈣蛋白酶裂解和激活的底物，是一種多功能的酶。在糖尿病患者的血管組織中首次發(fā)現(xiàn)PKCβ-2，激活PKCβ-2可誘發(fā)糖尿病介導的血管炎癥和心肌細胞凋亡[27]。PKC是參與糖尿病性ED重要信號分子，通過調(diào)節(jié)血管擴張劑導致糖尿病性ED的發(fā)生。另有研究表明，鈣蛋白酶也可作為PKC信號通路的下游靶點[28]。在高糖狀態(tài)下，PKC抑制劑(BIM-1)可降低鈣蛋白酶在小鼠微血管內(nèi)皮細胞中的活性[29]。研究表明，通過藥物抑制或者基因敲除u-鈣蛋白酶和PKCβ-2，可阻斷同型半胱氨酸血癥/高血糖引起的ED[10]。此外，u-鈣蛋白酶/pkcβ-2的激活可減少eNOS-pThr495、eNOS和NO的產(chǎn)生，從而加重同型半胱氨酸血癥/高血糖引起的ED[10]。

3.2鈣蛋白酶對PGI2的作用

PGI2由環(huán)氧合酶(COX)通過花生四烯酸代謝產(chǎn)生，也可通過血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞產(chǎn)生，其合成的主要來源是COX-2。PGI2主要功能是血管擴張和抗血小板凝集。內(nèi)皮細胞中PGI2含量減少可導致心血管疾病的發(fā)病率升高。 在糖尿病中，PGI2可能作用于平滑肌中血栓前列腺受體(TP)，導致內(nèi)皮性血管收縮。研究表明，鈣蛋白酶抑制劑可減少滑膜成纖維細胞中COX-2的降解，另有研究表明，鈣蛋白酶抑制劑(PD150606)通過作用于成纖維細胞中的鈣蛋白酶，影響IκB泛素化，進一步影響NF-κB的表達量，使COX-2的含量發(fā)生變化[31]。因此，有必要研究蛋白酶對糖尿病中PGI2介導的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙的作用。

3.3鈣蛋白酶對EDHF的作用

EDHF是小阻力血管張力的主要決定因素。由于EDHF的影響，內(nèi)皮細胞對eNOS和COX的介導的血管舒張的抑制作用產(chǎn)生耐受性。研究表明，EDHF介導的反應是通過激活K+通道(Kca)啟動的，因此在某些疾病狀況下，轉錄修飾后的Kca參與EDHF介導的ED反應[23]。據(jù)報道，高鹽飲食可加重糖尿病大鼠腸系膜動脈中EDHF介導的ED[32]。此外，在小鼠腸系膜中，通過氧化作用、酪氨酸硝化和鈣激活鉀通道可減輕同型半胱氨酸血癥中EDHF介導的ED[33]。據(jù)報道，內(nèi)源性蛋白酶抑制劑的過度表達對治療鏈脲佐菌素(STZ)處理的小鼠主動脈中EDHF介導的ED有所幫助，這表明激活糖尿病中鈣蛋白酶可調(diào)控EDHF，從而引發(fā)糖尿病性ED[34]。鈣蛋白酶抑制蛋白的過度表達可改善高糖小鼠主動脈中EDHF介導的ED。

4總結

大量研究表明，激活鈣蛋白酶，特別是μ-鈣蛋白酶對NO介導的糖尿病性ED有影響。激活鈣蛋白酶可減少Hsp90和eNOS的相互作用從而降低NO的生物利用度，并且加速eNOS、eNOS-pThr495的降解。鈣蛋白酶抑制劑能夠緩解NO介導的糖尿病ED，并且減輕血管炎癥反應。高同型半胱氨酸血癥可使μ-鈣蛋白酶活化從而加重糖尿病性ED。由于鈣蛋白酶對PGI2和EDHF在糖尿病中的作用機制尚不完全明確，所以進一步研究鈣蛋白酶對NO介導的糖尿病性ED的影響是有必要的，有望為鈣蛋白酶可作為NO介導的糖尿病性ED的治療靶點提供科學依據(jù)。

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專論與講座

Effect of Calpain on NO Mediated Diabetic Vascular Endothelial Dysfunction

WANG Yu-ting1,ZHANG Qiang2,LI Chen-su1,LI Hua-sheng1,TIAN Jing-jing3,YANG Jian-cheng1

(1.ShenyangAgriculturalUniversity,Shenyang,Liaoning,110866,China；2.ShenyangVeterinaryBureau,Shenyang,Liaoning,110000,China；3.Shenyang204hospital,Shenyang,Liaoning,110043,China)

Abstract:Diabetes is one of the most common metabolic disease.Compared with healthy individuals,the incidence of cardiovascular disease in individuals with diabetes increases significantly.Although domestic and foreign scholars have carried out extensive researches,the potential mechanism of endothelial dysfunction(ED) caused by diabetes mellitus is not clear.Activation of calpain, especially μ-calpain,enhances inflammatory response mediated by NO in diabetic ED,and promotes the degradation of large vessels and microvascular endothelial nitric oxide synthase (eNOS).Study also shows that μ-calpain/PKCβ2 activation induced eNOS-pThr497/495 and eNOS elevate homocysteine levels in the blood,leading to hyperglycemia-induced ED.This article reviewed the effets of calpain on NO-mediated diabetic vascular ED in the hope of calpain as a new therapeutic targets to NO mediated diabetic ED.

Key words:calpain;endothelial dysfunction;NO;diabetes

收稿日期：2015-12-14

作者簡介：王玉婷(1990-)，女，遼寧沈陽人，碩士研究生，主要從事動物生理學與生殖內(nèi)分泌學研究。 *通訊作者

中圖分類號:S852.2

文獻標識碼:A

文章編號:1007-5038(2016)06-0106-04