趙　娜，張西臣

(1. 華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，河北唐山 063000；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062)

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寄生原蟲(chóng)端粒蛋白研究進(jìn)展

趙娜1,2，張西臣2*

(1. 華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，河北唐山 063000；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130062)

摘要：端粒蛋白是指那些直接或間接與端粒結(jié)合的蛋白組分。近年來(lái)寄生蟲(chóng)端粒蛋白研究引起了人們廣泛的關(guān)注，為寄生蟲(chóng)病的研究提供了新的思路。端粒蛋白具有維持染色體穩(wěn)定和細(xì)胞周期調(diào)控等多種功能，共同參與寄生蟲(chóng)生命周期的調(diào)節(jié)，同時(shí)也為寄生蟲(chóng)病的預(yù)防和治療開(kāi)辟了新的途徑。論文主要綜述了包括TRFs、Rap1、TERT、RPA、Sir2和Orc1、Gbp、Ku、Rbp38以及LaTBP1等原蟲(chóng)端粒蛋白及其功能，以期為尋找新的防治寄生蟲(chóng)病的靶點(diǎn)提供借鑒。

關(guān)鍵詞：寄生蟲(chóng)；端粒結(jié)合蛋白；端粒相關(guān)蛋白

端粒是真核細(xì)胞內(nèi)線性染色體末端的一種富含G的短雙鏈串聯(lián)重復(fù)序列[1]。端粒蛋白通過(guò)與端粒DNA相互作用，調(diào)節(jié)端粒DNA長(zhǎng)度和端粒酶活性、維持染色體穩(wěn)定，并與DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞的衰老和腫瘤有著極密切的聯(lián)系[2]。目前主要有3種形式的端粒蛋白,即單鏈DNA結(jié)合蛋白，雙鏈DNA結(jié)合蛋白和端粒相關(guān)蛋白。端粒結(jié)合蛋白直接保護(hù)端粒DNA，而端粒相關(guān)蛋白通過(guò)與端粒結(jié)合蛋白的相互作用間接影響端粒的功能。

寄生蟲(chóng)端粒蛋白的發(fā)現(xiàn)為寄生蟲(chóng)領(lǐng)域的研究開(kāi)拓了更為廣闊的方向。寄生蟲(chóng)端粒蛋白、端粒和端粒酶相互作用，共同完成對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)。同時(shí)，這將有助于了解寄生蟲(chóng)基因表達(dá)和變異、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和基因重組等機(jī)制。展開(kāi)和深入對(duì)該領(lǐng)域的研究，分離和鑒定寄生蟲(chóng)端粒蛋白、尋找或設(shè)計(jì)針對(duì)該蛋白的藥物或疫苗為寄生蟲(chóng)病的防治開(kāi)辟了新的途徑。本文就寄生原蟲(chóng)端粒蛋白的研究進(jìn)展做一概述。

1端粒重復(fù)序列結(jié)合因子

端粒重復(fù)序列結(jié)合因子(TTAGGG repeat-binding factors, TRFs)包括TRF1和TRF2兩種蛋白復(fù)合物，其以同源二聚體的形式存在，兩者間并無(wú)相互作用。它們包含N端的Myb區(qū)和C端的TRFH區(qū)，識(shí)別端粒重復(fù)序列的雙鏈DNA區(qū)域，Myb區(qū)與端粒DNA重復(fù)序列結(jié)合[3]。

目前，在寄生蟲(chóng)中研究該蛋白的主要有布氏錐蟲(chóng)(T.brucei)和亞馬遜利什曼原蟲(chóng)(L.amazonensis)。L.amazonensisTRF(LaTRF)分子質(zhì)量為82.5 ku，是錐蟲(chóng)TRF分子質(zhì)量大小的2倍；其具有與哺乳動(dòng)物TRFs類似的Myb和TRFH結(jié)構(gòu)域。染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)表明，LaTRF能在體內(nèi)與端粒特異性的結(jié)合[4]。然而，LaTRF在端粒中的功能仍有待研究。T.bruceiTRF(TbTRF)是哺乳動(dòng)物TRF2的同源物，但其缺少TRFH結(jié)構(gòu)域，RNAi介導(dǎo)的TbTRF表達(dá)水平的降低導(dǎo)致細(xì)胞分裂的停滯以及端粒的縮短[5]。TbTRF在T.brucei可變表面糖蛋白(VSG)轉(zhuǎn)換中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且其與端粒DNA的結(jié)合活性影響著對(duì)VSG轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)[6]。TbTRF的發(fā)現(xiàn)為研究端粒生物學(xué)功能以及T.brucei的致病機(jī)理提供了新的途徑。Jehi S E等[7]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的端粒蛋白T.bruceiTRF互作因子2(TbTIF2)，并且功能研究表明該蛋白在錐蟲(chóng)VSG轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)以及維持亞端粒結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，TbTRF/TbTIF2作用的結(jié)構(gòu)域是T.brucei特有的。因此，TbTRF/TbTIF2作用的結(jié)構(gòu)域有可能成為研究抗寄生蟲(chóng)藥物的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。

2抑制/激活蛋白

人抑制/激活蛋白(human repressor/activator protein,hRap1)是hTRF2互作蛋白，它通過(guò)與hTRF2形成復(fù)合物發(fā)揮端粒調(diào)節(jié)以及末端保護(hù)功能。hTRF2參與端粒以及非端粒DNA損傷應(yīng)答，hRap1在這一過(guò)程中發(fā)揮著必不可少的作用[8]。T.bruceiRap1(TbRap1)也通過(guò)TbTRF與端粒DNA作用，在血液期的VSG表達(dá)沉默中發(fā)揮重要作用[9]。隨后，Pandya U M等[10]發(fā)現(xiàn)T.brucei在媒介昆蟲(chóng)體內(nèi)，TbRap1也能抑制VSG的表達(dá)，并參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)。到目前為止，關(guān)于TbRap1的結(jié)構(gòu)信息知之甚少，所以TbRap1與TbTRF的作用機(jī)制尚不能得到解釋。由于TbRap1獨(dú)特的與端粒DNA結(jié)合模式，其很可能與其他尚未得到鑒定的端粒蛋白作用而發(fā)揮功能。

3端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)最先在游仆蟲(chóng)中被鑒定出來(lái)，隨后在人、鼠、酵母等分別被鑒定和克隆[11]。迄今先后報(bào)道了18種寄生蟲(chóng)的TERT基因被克隆出來(lái)，包括藍(lán)氏賈第蟲(chóng)、惡性瘧原蟲(chóng)、微小隱孢子蟲(chóng)、布氏錐蟲(chóng)等[12]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)不同真核生物TERT由很多高度保守的基序構(gòu)成，TERT基因由3個(gè)結(jié)構(gòu)域N端、反轉(zhuǎn)錄區(qū)(RT)和C端組成，TERT與端粒酶RNA共同參與染色體末端端粒重復(fù)序列的合成[13]。

研究發(fā)現(xiàn),T.bruceiTERT(TbTERT)與其他真核生物的端粒酶具有相似的生物學(xué)活性。敲除TERT導(dǎo)致T.brucei每個(gè)分裂周期端粒長(zhǎng)度縮短3 bp～6 bp[14]。通過(guò)轉(zhuǎn)錄活性和端粒沉默試驗(yàn)研究端粒延伸機(jī)制，雖然端粒酶可能在T.brucei的染色體和微型染色體的有絲分裂中發(fā)揮與眾不同的作用，但其仍具有傳統(tǒng)的防止染色體末端融合和重排的作用。此外，Dreesen O等[14]推測(cè)T.bruceiTERT可能在VSG轉(zhuǎn)換中發(fā)揮作用，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4復(fù)制蛋白A

復(fù)制蛋白A(replication protein A, RPA)是一個(gè)高度保守的三聚體單鏈DNA結(jié)合蛋白，它參與DNA代謝的不同階段。目前鑒定的RPA同源物包括RPA1(70 ku)、RPA2(32 ku～34 ku)和RPA3(14 ku)[15]。在多數(shù)真核生物中，其通過(guò)OB折疊域與DNA結(jié)合。

在利什曼原蟲(chóng)(Leishmaniaspp.)中，RPA1具有標(biāo)準(zhǔn)的OB折疊域和一個(gè)縮短的RFA1結(jié)構(gòu)區(qū)[16]。在L.amazonensis中，LaRPA1通過(guò)N-端OB折疊域與端粒G-rich鏈結(jié)合，證明了LaRPA1是L.amazonensis端粒相關(guān)核蛋白[16-17]。計(jì)算機(jī)模擬分析顯示LaRPA1的三級(jí)結(jié)構(gòu)不同于人和酵母RPA1。功能試驗(yàn)表明，LaRPA1能夠防止單鏈DNA的丟失，發(fā)揮對(duì)端粒的"蓋帽"功能[18]。結(jié)果分析顯示LaRPA1很可能是一個(gè)端粒末端結(jié)合蛋白，至于其他功能需要不斷地去探索。

5Sir 2和Orc 1

在瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)，Sir2是高度保守的端粒蛋白，包括Sir2A及其同源物Sir2B，其中Sir2A具有組蛋白其去乙?；富钚?。研究表明，Sir2A缺失的P.falciparum具有更長(zhǎng)的端粒重復(fù)序列，證明該蛋白在端粒末端保護(hù)中發(fā)揮著作用[19]。

Orc1作為DNA復(fù)制啟動(dòng)蛋白，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，包括端粒生物學(xué)過(guò)程、姐妹染色單體粘連、基因沉默、著絲粒和中心體活性以及胞質(zhì)分裂。研究發(fā)現(xiàn)，P.falciparumOrc1(PfOrc1) N端1 aa-238 aa能與端粒DNA在體外結(jié)合，內(nèi)源性O(shè)rc1廣泛定位于端粒、亞端粒以及var啟動(dòng)子區(qū)域；Orc1與Sir2共同定位于端粒區(qū)，Orc1與Sir2協(xié)同作用抑制var家族的基因表達(dá)[20-21]。鑒于var基因家族編碼的產(chǎn)物在P.falciparum致病和免疫逃避過(guò)程中有重要作用，Orc1可能是探究P.falciparum致病性的新靶點(diǎn)。在T.brucei中，TbOrc1也是一個(gè)端粒相關(guān)蛋白，定位于亞端粒區(qū)，其調(diào)控VSG的表達(dá)和轉(zhuǎn)換[22]。

6Gbp

Liu C等[23]在微小隱孢子蟲(chóng)(C.parvum)中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)端粒結(jié)合蛋白CpGbp(約23 ku)，含有兩個(gè)RNA識(shí)別基序(RRMs)，其與單鏈G鏈端粒DNA結(jié)合，與萊茵衣藻的Gbp1p具有很高的同源性。該蛋白是一個(gè)核蛋白，與其潛在的調(diào)節(jié)端粒長(zhǎng)度的特性相一致。同時(shí)，在柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)中也發(fā)現(xiàn)了該蛋白的同源物EtGbp1p，研究證明其是一個(gè)端粒結(jié)合蛋白[24]。由于復(fù)雜的生活史以及體外培養(yǎng)技術(shù)的局限，C.parvum和E.tenella細(xì)胞和分子生物學(xué)特性的研究相對(duì)滯后，該蛋白的發(fā)現(xiàn)為深入研究二者的細(xì)胞和分子生物學(xué)特性以及生命周期調(diào)節(jié)提供了新的方向。

7其他端粒蛋白

Ku是由分子質(zhì)量各為70 ku和80 ku的蛋白亞基組成的異源二聚體，其具有修補(bǔ)斷裂的雙鏈DNA和維持端粒長(zhǎng)度的作用，同時(shí)參與DNA重組、基因沉默。T.bruceiKu表現(xiàn)出參與端粒長(zhǎng)度維持的功能，但是對(duì)DNA雙鏈損傷修復(fù)沒(méi)有明顯的作用。同時(shí)Ku的缺失以及導(dǎo)致的端粒漸進(jìn)性縮短都沒(méi)有對(duì)VSG轉(zhuǎn)換和VSG表達(dá)位點(diǎn)的沉默產(chǎn)生影響[25]。

對(duì)于錐蟲(chóng)屬來(lái)說(shuō)，Rbp38是一個(gè)獨(dú)特的蛋白，它不含有任何保守域。在L.tarentolae和T.brucei中，Rbp38是一個(gè)RNA結(jié)合蛋白，具有穩(wěn)定線粒體RNA的功能并參與動(dòng)基體DNA的復(fù)制[26]。研究表明LaRbp38是一個(gè)38 ku的端粒DNA結(jié)合蛋白，染色質(zhì)免疫共沉淀試驗(yàn)證明了其能與動(dòng)基體DNA和核DNA結(jié)合[27]。這提示了LaRbp可能具有多重生物學(xué)功能，為藥物研發(fā)提供了靶標(biāo)。

LaTBP1是L.amazonensisDNA結(jié)合蛋白，能特異的結(jié)合雙鏈端粒DNA和GT-rich區(qū)。LaTBP1有一個(gè)Myb樣DNA結(jié)合域，在結(jié)合域中存在一個(gè)保守的疏水區(qū)，該疏水區(qū)與該蛋白結(jié)合DNA的活性有關(guān)[28]。

8 展望

隨著對(duì)端粒蛋白這一領(lǐng)域的深入研究，我們對(duì)端粒蛋白和端粒及它們所形成的端粒末端復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能逐漸清晰起來(lái)。寄生蟲(chóng)作為自然界中一大類生物，端粒蛋白和端粒在其基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控、基因重組和完成生活史方面發(fā)揮著不可替代的作用。然而，寄生蟲(chóng)端粒蛋白的研究處于相對(duì)滯后的狀態(tài)，僅在幾種原蟲(chóng)中有所研究，而且研究方向多限于端粒蛋白的鑒定和結(jié)構(gòu)的分析。對(duì)于寄生蟲(chóng)端粒蛋白的功能和作用原理，目前我們所能獲取的信息相對(duì)較少，阻礙了對(duì)于寄生蟲(chóng)更深層次的認(rèn)識(shí)，同時(shí)很難將其應(yīng)用到寄生蟲(chóng)病的防治中去。因此，寄生蟲(chóng)端粒蛋白的功能研究應(yīng)該成為該領(lǐng)域研究的重要方向，以便人們更深刻和多角度了解寄生蟲(chóng)，防治寄生蟲(chóng)病。

參考文獻(xiàn):

[1]Greider C W. Telomere length regulation[J]. Annu Rev Biochem, 1996, 65: 337-365.

[2]黃河, 孫潔. 端粒結(jié)合蛋白研究進(jìn)展[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 33(6): 469-473.

[3]Fairall L, Chapman L, Moss H, et al. Structure of the TRFH dimerization domain of the human telomeric proteins TRF1 and TRF2[J]. Mol Cell, 2001, 8(2): 351-361.

[4]da Silva M S, Perez A M, da Silveira Rde C, et al. TheLeishmaniaamazonensisTRF (TTAGGG repeat-binding factor) homologue binds and co-localizes with telomeres[J]. BMC Microbiol, 2010, 10: 136.

[5]Li B, Espinal A, Cross G A. Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2[J]. Mol Cell Biol, 2005, 25(12): 5011-5021.

[6]Jehi S E, Li X, Sandhu R, Ye F, et al. Suppression of subtelomeric VSG switching byTrypanosomabruceiTRF requires its TTAGGG repeat-binding activity[J]. Nucleic Acids Res, 2014, 42(20): 12899-12911.

[7]Jehi S E, Wu F, Li B. Trypanosoma brucei TIF2 suppresses VSG switching by maintaining subtelomere integrity[J].Cell Res, 2014 24(7): 870-885.

[8]Li X, Liu W, Wang H, et al. Rap1 is indispensable for TRF2 function in etoposide-induced DNA damage response in gastric cancer cell line[J]. Oncogenesis, 2015, 4: e144.

[9]Yang X, Figueiredo L M, Espinal A, et al. RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei[J]. Cell, 2009, 137(1): 99-109.

[10]Pandya U M, Sandhu R, Li B. Silencing subtelomeric VSGs byTrypanosomabruceiRAP1 at the insect stage involves chromatin structure changes[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(16): 7673-7682.

[11]楊桂連. 柔嫩艾美耳球蟲(chóng)端粒DNA和TERT基因克隆及端粒酶活性測(cè)定[D]. 吉林長(zhǎng)春: 吉林大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)系, 2009.

[12]楊桂連, 李建華, 張西臣. 寄生蟲(chóng)端粒及端粒酶的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2009, 31(5): 412-414.

[13]Autexier C, Lue N F. The structure and function of telomerase reverse transcriptase[J]. Annu Rev Biochem, 2006, 75: 493-517.

[14]Dreesen O, Li B, Cross G A. Telomere structure and shortening in telomerase-deficientTrypanosomabrucei[J]. Nucleic Acids Res, 2005, 33(14): 4536-4543.

[15]Wold M S. Replication protein A: a heterotrimeric, ssDNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism[J]. Annu Rev Biochem, 1997, 66: 61-92.

[16]Neto J L, Lira C B, Giardini M A, et al.Leishmaniareplication protein A-1 bindsinvivosingle-stranded telomeric DNA[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 358(2): 417-423.

[17]Pavani R S, Fernandes C, Perez A M, et al. RPA-1 fromLeishmaniaamazonensis(LaRPA-1) structurally differs from other eukaryote RPA-1 and interacts with telomeric DNA via its N-terminal OB-fold domain[J]. FEBS Lett, 2014, 588(24): 4740-4748.

[18]Da Silveira Rde C, Da Silva M S, Nunes V S, et al. The natural absence of RPA1N domain did not impairLeishmaniaamazonensisRPA-1 participation in DNA damage response and telomere protection[J]. Parasitology, 2013, 140(4): 547-559.

[19]Tonkin C J, Carret C K, Duraisingh M T, et al. Sir2 paralogues cooperate to regulate virulence genes and antigenic variation inPlasmodiumfalciparum[J]. Plos Biol, 2009, 7(4): e84.

[20]Mancio-Silva L, Rojas-Meza A P, Vargas M, et al. Differential association of Orc1 and Sir2 proteins to telomeric domains inPlasmodiumfalciparum[J]. J Cell Sci, 2008, 121(Pt 12): 2046-2053.

[21]Deshmukh A S, Srivastava S, Herrmann S, et al. The role of N-terminus ofPlasmodiumfalciparumORC1 in telomeric localization and var gene silencing[J]. Nucleic Acids Res, 2012, 40(12): 5313-5331.

[22]Benmerzouga I, Concepción-Acevedo J, Kim H S, et al.TrypanosomabruceiOrc1 is essential for nuclear DNA replication and affects both VSG silencing and VSG switching[J]. Mol Microbiol, 2013, 87(1): 196-210.

[23]Liu C, Wang L, Lancto C A, et al. Characterization of aCryptosporidiumparvumprotein that binds single-stranded G-strand telomeric DNA[J]. Mol Biochem Parasitol, 2009, 165(2): 132-141.

[24]Zhao N, Gong P, Li Z, et al. Identification of a telomeric DNA-binding protein in Eimeria tenella[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 451(4): 599-602.

[25]Conway C, McCulloch R, Ginger M L, et al. Ku is important for telomere maintenance, but not for differential expression of telomeric VSG genes, in African trypanosomes[J]. J Biol Chem, 2002, 277(24): 21269-21277.

[26]Sbicego S, Alfonzo J D, Estévez A M, et al. RBP38, a novel RNA-binding protein from trypanosomatid mitochondria, modulates RNA stability[J]. Eukaryot Cell, 2003, 2(3): 560-568.

[27]Lira C B, Siqueira Neto J L, Giardini M A, et al. LaRbp38: aLeishmaniaamazonensisprotein that binds nuclear and kinetoplast DNAs[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 358(3): 854-860.

[28]Lira C B, de Siqueira Neto J L, Khater L, et al. LaTBP1: aLeishmaniaamazonensisDNA-binding protein that associates in vivo with telomeres and GT-rich DNAusing a Myb-like domain[J]. Arch Biochem Biophys, 2007, 465(2): 399-409.

Advance in Telomeric Proteins of Parasitic Protozoa

ZHAO Na1,2, ZHANG Xi-chen2

(1.LaboratoryAnimalCenter,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan,Hebei,063000,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,JilinUniversity,Changchun,Jilin，130062,China)

Abstract:Telomere proteins are integral components of the telomere complex that bind directly or indirectly with telomere DNA. The telomeric proteins that provide a new research area on parasites, have been paid a great attention recently. They play important roles in both chromosome stability and the regulation of life cycle in parasites. Furthermore, the researches on telomeric proteins opens exciting avenues on the prevention and treatment of parasitic diseases. This article reviewed telomeric proteins of protozoa and related functions, including TRFs, Rap1, TERT, RPA, Sir2, Orc1, Gbp, Ku, Rbp38, and LaTBP1, to develop novel targets for anti-parasite agents.

Key words:parasite; telomere-binding protein; telomere-associated protein

收稿日期：2015-11-29

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272550，30970322)

作者簡(jiǎn)介：趙娜(1986-)，女，河北唐山人，講師，博士，主要從事動(dòng)物及人獸共患寄生蟲(chóng)病研究。 *通訊作者

中圖分類號(hào):S852.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1007-5038(2016)06-0102-04